含有I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的慢病毒载体

摘要

本发明涉及将I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列插入慢病毒载体以增加病毒效价。本发明包括这些载体，制备载体的方法和使用载体的方法，包括医疗用途。

说明书

技术领域

本发明属于重组疫苗技术的领域并涉及慢病毒载体的改进，其可用作治疗性和预防性疫苗。含有I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的载体提供了比其它载体改善的特性。

背景

重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展，允许修饰病毒基因组以产生修饰的病毒。通过这种方式，已能够将遗传序列引入非致病性病毒，从而它们编码需要在干扰后于靶细胞内得以表达的免疫原性蛋白质，以在其宿主内发展特定免疫应答。

这类载体构成了疫苗技术的主要优势(Kutzler等，NatRevGenet，9(10)：776-788，2008)。具体而言，它们具有优于传统疫苗的优势：避免活(减毒的)病毒和消除灭活疫苗制造的相关风险。

在二十世纪八十年代早期由Mann等引入使用改性的逆转录病毒(逆转录病毒载体)的基因递送(Cell，33(1)：153-9，1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。它们具有简单的基因组，从中产生多蛋白Gag、Pol和Env并且要求为反式以用于病毒复制(Breckpot等，2007，GeneTher，14(11)：847-62；He等，2007，ExpertRevvaccines，6(6)：913-24)。一般需要的顺式序列是长末端重复序列(LTR)及其周边序列：用于整合的反向重复序列(IR或att位点)、包装序列Ψ、转运RNA结合位点(引物结合位点，PBS)，和涉及逆转录的一些其它序列(正链起始必需的LTR内的重复R以及多嘌呤序列(PPT))。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并且用表达盒替代。

源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体(即，慢病毒载体)已涌现为用于基因治疗和免疫治疗目的的有希望的工具，因为它们显示优于其它病毒系统的若干优势。具体地，慢病毒本身没有毒性，并且与其它逆转录病毒不同，慢病毒能够转导非分裂细胞，尤其是树突状细胞(He等，2007，ExpertRevvaccines，6(6)：913-24)，使得通过内源性途径呈递抗原。

慢病毒通过遗传组成相似性、复制的分子机制和与其宿主的生物相互作用连接。它们最常称为缓慢疾病综合征的试剂，该综合征在延长的亚临床感染之后开始并缓慢发展；因此，它们被称作“慢”病毒(Narayan等，1989，JGenVirol，70(7)：1617-39)。其基本构成与所用逆转录病毒相同但由于附属基因(例如vif、vpr、vpu、nef、tat和rev)的存在而更为复杂，所述附属基因在慢病毒的体内复制中起关键作用。

慢病毒代表逆转录病毒科(Retroviridae)的一个慢病毒(slowvirus)属，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于其宿主内，并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。病毒在其宿主内的持续复制取决于其避开宿主防御的能力。

重组整合型慢病毒载体的设计基于慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非分裂细胞中的有效转导需要慢病毒基因组中存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。它们导致形成三链DNA结构，称为中心DNA“瓣(flap)”，该结构使基因进入非分裂细胞(包括树突细胞(DC))核内的效率最大化(Zennou等，2000，Cell，101(2)173-85；Arhel等，2007，EMBOJ，26(12)：3025-37)。

树突细胞对于抗原递呈而言具有重要作用，因为其构成了以递呈抗原和起始免疫应答为主要功能的抗原递呈细胞(APC)的主要类型。

为产生免疫应答，须由细胞将抗原蛋白加工成肽，所述肽通过主要组织相容性复合物蛋白(MHC)在细胞表面显示。循环的APC在引流淋巴结内将肽-MHC复合物递呈至T细胞，其在此处与T细胞受体相互作用并联合共刺激信号一起激活T细胞。

多项研究已显示，使用慢病毒载体的接种导致DC进行抗原呈递和抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL；CD8⁺T细胞)的强激活。因此，慢病毒载体已经工程改造用于基因转化和免疫疗法应用。

已通过移除LTRU3序列，产生完全不含原先在LTR中存在的病毒启动子和增强子序列的“自动失活”载体，从而改善了慢病毒载体的安全性。

可通过在不同的DNA质粒瞬时转染HEK293T人培养细胞后由重组技术产生含有慢病毒载体的慢病毒颗粒：

(i)包装质粒，其表达至少Gag、PolRev、Tat，并在一些情况下表达转移构建体的包装所必需的结构和酶蛋白；

(ii)转移质粒，其含有包装、逆转录和整合所必需的表达盒和HIV顺式作用因子；以及

(iii)编码包膜的质粒，在多数情况下是水泡性口炎病毒(VSV.G)的糖蛋白，该蛋白允许形成能够靶向多种细胞(尤其是主要组织相容性(MHC)抗原递呈细胞(APC)，包括DC)的混合颗粒(假型)。

该方法能够使转染的细胞瞬时生产慢病毒颗粒载体。然而，也可通过向细胞基因组中稳定地插入包装基因、原病毒编码DNA和包膜基因来连续产生慢病毒颗粒载体。这使得能够由细胞连续产生慢病毒颗粒载体而不需要瞬时转染。当然，也可使用这些方法的组合，其中将一些DNA/质粒整合至细胞基因组而其他的通过瞬时转染提供。

非整合型慢病毒载体正被设计尝试用于降低与插入诱变事件相联系的潜在癌发生的风险，特别用于疫苗接种目的。

在基于直接注射抗原编码整合型慢病毒载体的疫苗接种中，表达相关抗原的转导的细胞成为引发的免疫应答的靶标并在数天或数周内从接种疫苗的生物体中清除。

此外，自动失活的慢病毒载体中病毒启动子和增强子序列的3′LTR的U3区域的缺失限制了内源性启动子激活的可能性。该缺失直接体现了1998-1999年进行的SCID-X1基因治疗试验所获得的经验，该试验使用基于莫罗尼病毒的逆转录病毒载体针对患有罕见类型的X连锁(SCID-X1基因)严重免疫缺陷疾病的儿童进行(Cavazzana-Calvo等，2000，Science.，288(5466)：669-72)。在该试验中，9名儿童中的4名由于莫罗尼衍生的慢病毒载体在非常靠近人LM02原癌基因处整合而发展出白血病(Hacein-Bey-Abina等，2008，J.Clin.Invest.，118(9)：3132-3142)。这表明，恶性肿瘤是病毒U3启动子/增强子接近LM02原癌基因的结果。

增强子是顺式作用序列，其可相隔一定距离作为转录激活因子起作用。它们已经在病毒衍生的载体中广泛采用，因为它们似乎对于在多种细胞类型，尤其是DC中获得转基因强表达而言最高效(Chinnasamy，Chinnasamy等，2000，HumGeneTher11(13)：1901-9；Rouas等，2008，CancerGeneTher9(9)：715-24；Kimura等，2007，MolTher15(7)：1390-9；Gruh等，2008，JGeneMed10(1)21-32)。然而，考虑到插入诱变的安全问题，应将这类转录增强子序列从慢病毒载体构建体中删除以破坏增强子邻近效应所产生的插入诱变风险。迄今为止，该增强子邻近效应是最常见的插入突变机制并且是基因转移后人或动物肿瘤发生事件的病例中描述的唯一效应。

因此，需要研发不包括病毒增强子的逆转录病毒，特别是慢病毒载体，其允许转基因编码的免疫原性肽足量表达，如果可能，表达量与使用CMV启动子时观察到的相当。具体地，存在对具有改进效价的载体的需求。

一项最近的研究报道了使用主要组织相容性复合物II型基因(II型MHC)(Kimura等，2007，MolTher15(7)：1390-9)和dectin-2基因(Lopes等，2008，JVirol82(1)：86-95)来源的DC特异性启动子代替病毒启动子。Lopes等使用的dectin-2基因启动子包含推定的增强子和腺病毒保守序列(腺病毒启动子中的反向末端重复)(Bonkabara等，2001，J.Immunology，167：6893-6900)。Kimura等使用的MHCII型基因启动子不含任何已知增强子。

然而，在没有增强子的情况下，发现II型MHC启动子无法在DC中提供足够的转基因表达。具体而言，与使用CMV启动子/增强子所观察到的免疫应答相反，包含II型MHC启动子的慢病毒载体未能在免疫活性C57BL/6小鼠中引起免疫反应。虽然在小鼠中注射后观察到了整合和持续的转基因表达，但通过II型MHC启动子转录的慢病毒载体无法刺激抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞应答，甚至在疫苗接种加强后也是如此。因此，这些研究的作者的结论是使用II型MHC启动子仅对于在基因替换疗法中寻求持续表达的应用而言有兴趣，但在免疫疗法中没有兴趣。

因此，对于针对抗原诱导免疫应答，II型MHC启动子不是适当的慢病毒载体启动子。此外，dectin-2启动子具有树突细胞特异性，其无法消除整合至其他非表达细胞类型中的载体。而且，dectin-2启动子似乎含有增强子。因此，由于安全原因，dectin-2启动子不是良好的慢病毒载体启动子。

优选地，在免疫治疗中，慢病毒载体提供了有效的转基因表达，其引发所需的特异性免疫应答。这需要APC(如树突细胞)中的表达处于高水平。

还优选通过免疫应答除去慢病毒载体所转导的细胞以提供更高水平的安全性。即，针对转基因产生的免疫应答可在宿主中引发足以除去慢病毒载体转导细胞的免疫应答。消除经转导的细胞消除了慢病毒载体在宿主中的持续存在，以及该载体的可能二级作用。为了消除经转导的细胞，在非树突细胞中需要一定水平的表达以由免疫应答进行消除。

同时，启动子应通过原初和记忆T细胞的激活中涉及的关键细胞(即树突细胞)使免疫刺激最大化并应使导致恶性肿瘤的干细胞中的插入诱变和基因毒性的风险最小化。因此，启动子应在树突和其他细胞中具有足够高的活性，但不含增强子。基于这些标准，由于强增强子的存在，病毒启动子(如CMV启动子)不是理想的。这些标准归纳如下：

1.树突细胞中的高表达以诱导最大免疫应答；

2.在其他转导的细胞类型中以足够的水平表达，该表达水平足以供于通过诱导的免疫应答进行消除；以及

3.缺少增强子元件以避免插入效应。

载体应该能够以高效价生成以最大化递送和表达，而最小化污染。

因此，本领域中存在对于改良载体的需要。本发明满足本领域中的这些需要。

发明内容

本发明包括包含慢病毒载体的组合物以及制备和使用该载体的方法。在一个实施方式中，本发明涵盖包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列，优选进一步包含I型MHC或β2微球蛋白启动子的慢病毒载体。

本发明包括生产慢病毒载体的方法，该方法包括向慢病毒载体中插入至少300个核苷酸，优选300-400、300-600或300-1100个核苷酸的I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列。

优选地，上游启动子序列插入I型MHC或β2微球蛋白启动子的上游。最优选地，上游启动子以与I型MHC或β2微球蛋白启动子相同的取向插入。

在一些实施方式中，上游启动子序列是I型MHC上游启动子序列。在一些实施方式中，上游启动子序列是β2微球蛋白上游启动子序列，优选包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：27。

在一些实施方式中，该启动子是I型MHC启动子。在一些实施方式中，该启动子是β2微球蛋白启动子。

本发明包括包含至少300个核苷酸，优选300-400、300-600或300-1100个核苷酸的I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的慢病毒载体。

优选地，上游启动子序列在I型MHC或β2微球蛋白启动子的上游。最优选地，上游启动子与I型MHC或β2微球蛋白启动子的取向相同。

在一些实施方式中，上游启动子序列是I型MHC上游启动子序列。在一些实施方式中，上游启动子序列是β2微球蛋白上游启动子序列，优选包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：27。在一些实施方式中，该启动子是I型MHC启动子。在一些实施方式中，该启动子是β2微球蛋白启动子。

优选地，I型MHC启动子是HLA-A2启动子、HLA-B7启动子或HLA-E启动子。

优选地，上游启动子序列是HLA-A2、HLA-B7、或HLA-E、或HLA-DRα上游启动子序列。

优选地，慢病毒载体包含慢病毒cPPT/CTS序列。优选地，慢病毒载体包含慢病毒Ψ(psi)序列。

本发明包括包含本发明的慢病毒载体的分离的宿主细胞。本发明包括用作药物或疫苗，尤其是用于基因疗法的本发明的慢病毒载体。

在优选的实施方式中，上游启动子序列包含以下任意一种的核苷酸序列：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：27、SEQIDNO：28、SEQIDNO：29、SEQIDNO：30、SEQIDNO：31、SEQIDNO：32、SEQIDNO：33、SEQIDNO：34、SEQIDNO：35或SEQIDNO：36。

附图说明

图1A、B和C显示以下示意图：(A)β2m启动子(启动子区域和上游染色体区域)，(B)I型MHC启动子，和(C)II型MHC启动子。

图2显示了在各种启动子上游克隆有或没有β2m上游启动子序列的各种慢病毒构建体的产率。β2m上游启动子序列通过融合PCR克隆到各种启动子的上游。所得的慢病毒载体产生并用于转导HEK-293T细胞，并且通过专门qPCR来评价经转导的细胞的百分比。

图3显示了在各种启动子上游以正向或反向取向克隆有或没有β2m上游启动子序列的各种慢病毒构建体的产率。β2m上游启动子序列通过融合PCR以正向(5’-3’)或反向(3’-5’)取向克隆到各种启动子的上游。所得的慢病毒载体产生并用于转导HEK-293T细胞，并且通过专门qPCR来评价经转导的细胞的百分比。

图4显示了在转基因(GFP)下游以正向或反向取向克隆有或没有β2m上游启动子序列的各种慢病毒构建体的产率。β2m上游启动子序列以正向(5’-3’)或反向(3’-5’)取向克隆到携带各种启动子的慢病毒构建体的转基因(GFP)的下游。所得的慢病毒载体产生并用于转导HEK-293T细胞，并且通过专门qPCR来评价经转导的细胞的百分比。

图5显示了在原病毒序列外部以正向或反向取向克隆有(到质粒主链中)或没有β2m上游启动子序列的各种慢病毒构建体的产率。β2m上游启动子序列以正向(5’-3’)或反向(3’-5’)取向克隆到携带各种启动子的原病毒构建体以外(质粒主链内)。所得的慢病毒载体产生并用于转导HEK-293T细胞，并且通过专门qPCR来评价经转导的细胞的百分比。

图6显示了在各种启动子上游以正向或反向取向克隆有或没有HLA-E上游启动子序列的各种慢病毒构建体的产率。HLA-E上游启动子序列通过融合PCR以正向(5’-3’)或反向(3’-5’)取向克隆到各种启动子的上游。所得的慢病毒载体产生并用于转导HEK-293T细胞，并且通过FACS分析来评价经转导的细胞的百分比。

图7显示了β2-微球蛋白(SEQIDNO：1)和I型MHC(SEQIDNO：2-7)上游启动子序列的核苷酸序列。显示了共有序列(SEQIDNO：8)。

图8A-B显示了β2-微球蛋白(SEQIDNO：40)、I型MHC(SEQIDNO：37-39)、和II型MHC(SEQIDNO：41)启动子和短上游启动子序列的核苷酸序列。显示了κB、ISRE和SXY模块的位置。

图9A-C显示了β2-微球蛋白(SEQIDNO：45)、I型MHC(SEQIDNO：42-44)、和II型MHC(SEQIDNO：46)启动子和长上游启动子序列的核苷酸序列。显示了κB、ISRE和SXY模块的位置。

图10显示了具有以正向取向位于其天然启动子上游的短或长β2-m、HLA-A2、HLA-B7、HLA-E或HLA-DRα上游启动续序列的各种慢病毒构建体的产率。

发明详述

检测了I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列对慢病毒载体效价的作用。上游启动子序列位于在β2微球蛋白和I型MHC启动子中发现的Ets/ISRE和NF-Kb结合位点的上游(图1)。上游启动子序列位于在II型MHC启动子中发现的SXY模块的上游(图1)。人β2-微球蛋白(β2m)启动子与I型MHC启动子有一定的相似性，因为其包含ISRE，尽管是在单个NF-Kb结合位点的上游。

β2m和I型MHC启动子的上游启动子序列在核苷酸水平上显示出一些相似性(图7)。选择2种上游启动子序列β2m和HLA-E用于分析。

首先，将β2m的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与β2m和MHCI启动子HLA-A2、HLA-B7和HLA-E相同的取向并位于它们的上游。为了进行比较，将β2m的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与泛素(UBC)基因启动子、CMV启动子或MHCII启动子(HLA-DRα)相同的取向并位于它们的上游。在这些载体中，启动子驱动绿色荧光蛋白(GFP)的表达。

为寻找表达，通过将壳体化质粒和提供VSV.G包膜的质粒共转染HEK-293T细胞来对载体进行包装，基本如Naldini等，1996，Science272：263-7中所述。然后用不同载体的颗粒来转化HEK-293T细胞。在含有所有载体的细胞中检测表达。

向带有β2m、HLA-A2、HLA-B7或HLA-E启动子的慢病毒载体中加入β2m上游启动子序列导致病毒效价大约2-5倍的增加。相反，向带有CMV启动子、UBC启动子或HLA-A2启动子的慢病毒载体中加入β2m上游启动子序列证明对效价的影响很小(图2)。因此，β2m上游启动子序列可从含有β2m或MHCI启动子的慢病毒载体中增加效价。

接着，将β2m的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与β2m和MHCI启动子HLA-A2、HLA-B7和HLA-E相反的取向并位于它们的上游。为了进行比较，将β2m的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与泛素(UBC)基因启动子、CMV启动子或MHCII启动子(HLA-DRα)相反的取向并位于它们的上游。以与HLA-A2、HLA-B7或HLA-E相反的取向向它们的上游加入β2m上游启动子序列至慢病毒载体不会导致病毒效价的增加(图3)。事实上，几种带有以相反取向插入的β2m上游启动子序列的慢病毒载体显示效价降低。因此，由β2m上游启动子序列导致的慢病毒载体的效价增加是依赖于取向的。

接着，将β2m的上游启动子序列以与β2m和MHCI启动子HLA-A2、HLA-B7和HLA-E相同或相反的取向插入慢病毒载体的转基因下游。为了进行比较，将β2m的上游启动子序列以与泛素(UBC)基因启动子、CMV启动子或MHCII启动子(HLA-DRα)相同或相反的取向插入慢病毒载体转基因的下游。以与β2m、HLA-A2、HLA-B7或HLA-E启动子相同的取向向转基因下游加入β2m上游启动子序列仅导致病毒效价的少许增加(图4)。因此，由β2m上游启动子序列导致的慢病毒载体的效价增加是依赖于位置的。

接着，将β2m的上游启动子序列以与β2m和MHCI启动子HLA-A2、HLA-B7和HLA-E相同或相反的取向插入慢病毒载体的LTR-LTR区域外侧。为了进行比较，将β2m的上游启动子序列以与泛素(UBC)基因启动子、CMV启动子或MHCII启动子(HLA-DRα)相同或相反的取向插入慢病毒载体LTR-LTR区域外侧。以相同或相反取向加入将β2m上游启动子序列加入LTR-LTR区域外侧导致病毒效价没有明显差异(图5)。因此，由β2m上游启动子序列导致的来自慢病毒载体的效价增加依赖于其在载体中LTR之间的存在。

接着，将HLA-E的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与β2m和MHCI启动子HLA-A2、HLA-B7和HLA-E相同或相反的取向并位于它们的上游。为了进行比较，将HLA-E的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与泛素(UBC)基因启动子、CMV启动子或MHCII启动子(HLA-DRα)相同或相反的取向并位于它们的上游。

向慢病毒载体的β2m、HLA-A2、HLA-B7或HLA-E启动子上游加入HLA-E上游启动子序列导致病毒效价大约2-4倍的增加(图6)。在大多数构建体中，HLA-E上游启动子序列在两个取向上类似地作用。向带CMV启动子或UBC启动子的慢病毒载体中加入HLA-E上游启动子序列证明在效价上大约2倍的增加(图6)。然而，向带HLA-DRα启动子的慢病毒载体中加入HLA-E上游启动子序列证明在效价上有很少或没有影响。因此，HLA-E上游启动子序列可从含有β2m、MHCI、CMV或UBC启动子的慢病毒载体中增加效价。

将HLA-A2的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与β2m启动子相同或相反的取向并位于其上游。向慢病毒载体的β2m启动子的上游加入HLA-A2上游启动子序列导致两种取向中病毒效价大约3-4倍增加。

HLA-B7的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与β2m启动子相同或相反的取向并位于其上游。向慢病毒载体的β2m启动子上游加入HLA-B7上游启动子序列导致在相同取向上大约10倍的病毒效价增加和在相反取向上大约4倍的病毒效价增加。

将HLA-DRα的上游启动子序列插入慢病毒载体，以与β2m启动子相同或相反的取向并位于其上游。向慢病毒载体的β2m启动子上游加入HLA-DRα上游启动子序列导致在相同取向上大约6倍的病毒效价增加和在相反取向上大约4倍的病毒效价增加。

由于上游序列的尺寸都为约300-400nt，研究了较大的上游序列(500-1100nt)的影响。将β2m的较大上游启动子序列(1058bp)插入慢病毒载体以与β2m启动子相同或相反的取向并位于其上游。与较小(330bp)的上游序列相比，较大的上游启动子序列并不进一步增加病毒效价，而是保留大部分已增加的病毒效价(图10)。

将HLA-A2的较大上游启动子序列(531bp)插入慢病毒载体，以与HLA-A2启动子相同的取向并位于其上游。在这种情况中，较大的HLA-A2上游启动子序列病毒效价增加了3倍；而较小的(322bp)HLA-A2上游序列对HLA-A2启动子有负面影响(图10)。

将HLA-B7的较大上游启动子序列(511bp)插入慢病毒载体，以与HLA-B7启动子相同的取向并位于其上游。在这种情况中，与较小的(352bp)HLA-B7上游序列相比，较大的HLA-B7上游启动子序列还增加病毒效价2-3倍(图10)。将HLA-E的较大上游启动子序列(1047bp)插入慢病毒载体，以与HLA-E启动子相同的取向并位于其上游。与较小的(328bp)上游序列相比，较大的上游启动子序列消除了病毒效价的增加(图10)。

将HLA-DRα的较大上游启动子序列(522bp)插入慢病毒载体，以与HLA-DRα启动子相同的取向并位于其上游。在这种情况中，与较小的(356bp)HLA-DRα上游序列相比，较大的HLA-DRα上游启动子序列对病毒效价有相同的影响(图10)。

研究了插入多个上游启动子序列的影响。向慢病毒载体的β2m启动子的上游、下游以及上游和下游插入HLA-E上游启动子序列。虽然插入上游导致效价的3-4倍的增加，插入下游对效价没有影响并且同时插入上游和下游导致病毒效价的降低。

因此，本发明的主要目的是包含β2m或MHCI或MHCII上游启动子序列的慢病毒载体，以及制备和使用这种载体的方法。

慢病毒载体

在本发明范围内，“慢病毒载体”指非复制型载体，其供于使用包含顺式作用慢病毒RNA或DNA序列的转基因转导宿主细胞，且需要以反式形式提供的慢病毒蛋白(例如Gag、Pol和/或Env)。慢病毒载体含有顺式作用包装序列，但缺少功能性Gag、Pol和Env蛋白的表达。慢病毒载体可以RNA或DNA分子的形式存在，这取决于所述逆转录载体的产生或发展阶段。

慢病毒载体可以是重组DNA分子的形式，如质粒。慢病毒载体可以是慢病毒颗粒载体的形式，如慢病毒和其他蛋白质的复合物中的RNA分子。通常，对应于修饰或重组的慢病毒颗粒的慢病毒颗粒载体包含由两个单链RNA拷贝组成的基因组。这些RNA序列可通过从插入宿主细胞基因组的双链DNA序列(原病毒载体DNA)转录获得，或者可由转化的宿主细胞中质粒DNA(质粒载体DNA)的瞬时表达获得。

慢病毒载体来源于慢病毒，尤其是人免疫缺陷病毒(HIV-1或HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)，其经修饰以除去涉及致病性的遗传决定簇并导入对获得治疗效果有用的新决定簇。

这类载体基于顺式和反式作用序列的分离。为制备复制缺陷型载体，可删除反式作用序列(如gag、pol、tat、rev和env基因)并使用编码转基因的表达盒代替。

非分裂细胞中的有效整合与复制通常需要慢病毒基因组中心存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。这导致形成三链DNA结构，称为中心DNA“瓣(flap)”，其作为对核孔处的整合前复合物脱包被并将表达盒有效导入非分裂细胞(如树突细胞)的细胞核的信号。

在一个实施方式中，本发明包括包含称为cPPT/CTS序列的中心多嘌呤序列和中心终止序列，具体如欧洲专利申请EP2169073所述。

其它序列通常以顺式出现，如参与载体原病毒DNA序列整合到宿主细胞基因组的长末端重复(LTR)。可通过使LTR序列突变以获得载体，例如在所述LTR的结构域U3中突变(ΔU3)(MiyoshiH等，1998，JVirol.72(10)：8150-7；Zufferey等，1998，JVirol72(12)：9873-80)。

在一个实施方式中，本发明包括包含LTR序列的慢病毒载体，优选具有移除了3’LTR中启动子和增强子序列的突变的U3区域(ΔU3)。

整合包装序列Ψ(psi)以支持多核苷酸序列衣壳化成载体颗粒(Kessler等，2007，Leukemia，21(9)：1859-74；Paschen等，2004，CancerImmunolImmunother12(6)：196-203)。

在一个实施方式中，本发明包括包含慢病毒包装序列Ψ(psi)和I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的慢病毒载体。

其它额外的功能性序列，如转运RNA-结合位点或引物结合位点(PBS)或土拨鼠后调控元件(WPRE)也可优选包含在本发明的慢病毒载体多核苷酸序列中，以得到转基因在体内更稳定的表达。

在一个实施方式中，本发明包括包含PBS的慢病毒载体。在一个实施方式中，本发明包括包含WPRE和/或IRES的慢病毒载体。

因此，在优选的实施方式中，慢病毒载体包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列、至少一种cPPT/CTS序列、一种Ψ序列、一种(优选2种)LTR序列和包括在启动子(尤其是I型MHC或β2微球蛋白启动子)转录控制下的转基因的表达盒。

转基因

本发明包括含有转基因的慢病毒载体。在本发明范围内，“转基因”指待用慢病毒载体转导的慢病毒载体中的核酸序列，其正常情况下不存在于细胞中。慢病毒用于将该序列导入经转导的细胞。术语“转基因”不包括促进转基因转导的那些载体序列。转基因可以是来自另一种生物体的核酸序列。或者，转基因可以是来自相同生物体的核酸序列，但具有控制其表达的不同调控序列。转基因可以是正义或反义核酸分子。根据本发明的优选实施方式，转基因序列编码免疫原性多肽。

优选地，免疫原性多肽是病毒、寄生虫、细菌或真菌的。在一个实施方式中，免疫原性多肽是肿瘤抗原。

该免疫原性多肽优选包括来自感染性疾病病原的一个或多个表位，例如来自HIV的Gag、Pol和/或Nef蛋白的抗原。

也可由本发明的转基因编码几种表位形成多表位。

在特定实施方式中，这类表位来源于肿瘤中鉴定到的靶抗原，并可通过获得针对其本身的细胞介导免疫应答的方式进行选择。靶抗原是在本领域中已有详细记录，可相对于数种肿瘤类型进行选择，且具体是黑色素瘤或癌中，包括肾癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、和淋巴瘤。

B2M和MHCI启动子

本发明包括将β2m或I型MHC(MHCI)启动子插入慢病毒载体中。如本文中所用，“I型MHC(MHCI)启动子”包括天然产生或合成的I型MHC启动子。术语“I型MHC启动子”并不包括β2m启动子。

天然产生的MHCI和β2m启动子

天然产生的MHCI启动子的示例是HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E、HLA-G基因启动子。这些天然产生的MHCI启动子一般从编码I型MHC蛋白的基因的启动子区域中克隆或复制，后称为推定的编码，如基因组数据库中的蛋白质(如NCBI多核苷酸数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/dna-rna)。β2m和I型MHC蛋白都进入主要组织相容性复合物(MHC)。优选的启动子列于美国专利公开号2014/0120132-A1，其通过引用纳入本文。

这些基因编码的蛋白质发现于几乎所有细胞类型中。MHCI蛋白一般存在于白细胞膜的表面处，其中它们与β2-微球蛋白(β2m)蛋白结合。这些相关联蛋白质的作用是将内源性来源的肽递呈至CD8+T细胞。因此，其在抗原特异性免疫应答的产生过程中起核心作用。因为多年来β2m和MHC蛋白已得到了广泛研究和描述，所以其基因已被成熟表征并可使用序列比对工具(如BLAST法)良好地检测(Altschul，S.F.等(1990).Basiclocalalignmentsearchtool.(局部比对搜索基本工具)J.Mol.Biol.215(3)：403-410)。

β2m和I型MHC启动子也共有在树突细胞中被强激活的能力，以及，在大多数其它人体组织中以较低强度激活的能力。

本发明的β2m和I型MHC启动子还可含有其它调控元件，如一个或多个Sp1和ETs结合位点。在一个优选实施方式中，I型MHC启动子含有2个Sp1结合位点和1个Ets结合位点。在其他实施方式中，Ap1和/或Ap2位点也包含在I型MHC启动子中。

优选的I型MHC启动子是人HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E、HLA-F和HLA-G启动子。

合成的β2m和I型MHC启动子

β2m和I型MHC启动子也可以是合成的。合成的β2m和I型MHC启动子包括使用分子生物学技术组装β2m和I型MHC启动子的单独组分合成的启动子或者使用分子生物学技术由天然产生的β2m和I型MHC启动子衍生的启动子。

ISRE

β2m和MHC型基因的转录通常由2种主要调控元件介导：干扰素刺激应答元件(ISRE)和SXY模块(包括W/S、X1X2/位点α以及Y/增强子B调控元件)(参见图1)。还参见VandenElsen，Immunogenetics(1998)48：208-211。

这些调控启动子元件位于延伸自大约转录起始位点上游第-220至-95核苷酸的区域中。其介导β2m和I型MHC基因的组织特异性和细胞因子诱导的转录。

β2m和I型MHC基因启动子的ISRE通常含有干扰素调节因子(IRF)家族成员的结合位点。因此，I型MHC启动子的一个特性是结合干扰素调节因子(IRF)家族成员。这可由，例如，凝胶迁移试验验证。

NF-κB结合位点

另一种调控元件，增强子A(含有细胞核转录因子κB(NF-κB)的结合位点)存在于大多数情况中。因此，β2m和I型MHC启动子的一个特性是结合细胞核转录因子κB(NF-κB)。这可由，例如，凝胶迁移试验验证。

SXY模块

除了ISRE，β2m和I型MHC启动子通常共有另一组保守的上游序列基序，由4种调控元件组成：S或W盒、X1/CREX2盒或位点α、以及Y盒或增强子B，它们一起被称为SXY模块。该SXY模块通常与含有调节因子X(RFX；由RFX5、RFXB/ANK和RFXAP组成)、cAMP反应元件结合蛋白(CREB)/激活转录因子(ATF)和作为增强体驱动这些基因反式激活的核因子Y(NFY)的多蛋白复合物协同地结合。因此，β2m和I型MHC启动子的一个特性是结合这些因子。这可由，例如，凝胶迁移试验验证。

相反地，II型MHC启动子不显示增强子A或ISRE元件(VandenElsen，P.J等，1998，Immunogenetics.48：208-221)。此外，如使用从裸淋巴细胞综合征(BLS；一种由于RFX亚基之一或CIITA中发生突变产生的重症联合免疫缺陷)患者建立的细胞系进行的研究所示，发现II型MHC基因调控中的RFX和CIITA是至关重要的。此外，缺少CIITA或RFX亚基之一分别影响MHC增强体的功能和组装，导致缺少II型MHC且I型MHC转录水平下降(VandenElsen，P.J.等，2004，CurrentOpinioninImmunology，16：67-75)。

β2M和MHCI以及MHCII上游启动子序列

本发明包括将β2m、I型MHC(MHCI)或II型MHC(MHCII)启动子插入慢病毒载体中。本文所用的“β2m上游启动子序列”是指在天然出现的β2微球蛋白启动子中的Ets/ISRE结合位点的紧邻上游发现的序列的1100个碱基对或更少，如图8A-B和图9A-C所示。也参见VandenElsen等，CurrentOpinioninImmunology2004，16：67-75的图1，其通过引用纳入本文。本文所用的“I型MHC(MHCI)上游启动子序列”是指正好在天然出现的I型MHC启动子中的NF-Kb结合位点上游发现的序列的1100个碱基对或更少，如图8A-B和图9A-C所示。β2m和I型MHC(MHCI)上游启动子序列的示例示于图7。本文所用的“II型MHC(MHCII)上游启动子序列”是指正好在天然出现的II型MHC启动子中的SXY模块上游发现的序列的1100个碱基对或更少，如图8A-B和图9A-C所示。

在多个实施方式中，上游启动子序列包含少于I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的1100、1000、900、800、700、600、550、500、450、400或350个核苷酸。

在多个实施方式中，上游启动子序列包含至少I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。

在多个实施方式中，上游启动子序列包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、或500至305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、550、600、700、800、900、1000、或1100个核苷酸(在所有可能的范围组合内)。优选地，上游启动子序列包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300-400、300-500、300-600、300-700、或300-1100个核苷酸。最优选地，上游启动子序列包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300-335个核苷酸。

优选地，B2M上游启动子序列包含核苷酸序列：

AGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCGGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACATCACGAGACTC(SEQIDNO：1)。优选地，B2M上游启动子序列包含SEQIDNO：27或28的核苷酸序列。

优选地，I型MHC上游启动子序列包含HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E或HLA-G上游启动子序列。

优选地，I型MHC上游启动子序列包含SEQIDNO：2-7或SEQIDNO：29-34中任意的核苷酸序列。

优选地，I型MHC上游启动子序列包含核苷酸序列：

CTGGAGGGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCCTCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCCAGGATTACAGCCATGCGCCACCACGCCGGCTAATTTTTTGGACTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCGGGCTGGTCTCGAACTCCCAACCTCAGGTGATCAGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCAGCCAGGACTAATTTCTAAGAGTGTGCAGAGATACCGAAACCTAAAAGTT(SEQIDNO：2)。

优选的上游启动子序列包括以下：

上游β2m(330bp)：

GAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAGCTGTAGTTATAAACAGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCGGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACAT(SEQIDNO：27)

上游β2m(1058bp)：

CTTCCAAGATCTCTGCCCCTCCCCATCGCCATGGTCCACTTCCTCTTCTCACTGTTCCTCTTAGAAAAGATCTGTGGACTCCACCACCACGAAATGGCGGCACCTTATTTATGGTCACTTTAGAGGGTAGGTTTTCTTAATGGGTCTGCCTGTCATGTTTAACGTCCTTGGCTGGGTCCAAGGCAGATGCAGTCCAAACTCTCACTAAAATTGCCGAGCCCTTTGTCTTCCAGTGTCTAAAATATTAATGTCAATGGAATCAGGCCAGAGTTTGAATTCTAGTCTCTTAGCCTTTGTTTCCCCTGTCCATAAAATGAATGGGGGTAATTCTTTCCTCCTACAGTTTATTTATATATTCACTAATTCATTCATTCATCCATCCATTCGTTCATTCGGTTTACTGAGTACCTACTATGTGCCAGCCCCTGTTCTAGGGTGGAAACTAAGAGAATGATGTACCTAGAGGGCGCTGGAAGCTCTAAAGCCCTAGCAGTTACTGCTTTTACTATTAGTGGTCGTTTTTTTCTCCCCCCCGCCCCCCGACAAATCAACAGAACAAAGAAAATTACCTAAACAGCAAGGACATAGGGAGGAACTTCTTGGCACAGAACTTTCCAAACACTTTTTCCTGAAGGGATACAAGAAGCAAGAAAGGTACTCTTTCACTAGGACCTTCTCTGAGCTGTCCTCAGGATGCTTTTGGGACTATTTTTCTTACCCAGAGAATGGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCAAGCTGTAGTTATAAACAGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCTGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACAT(SEQIDNO：28)

上游HLA-A2(322bp)：

TACACCTCCATTCCCAGAGCAAGCTTACTCTCTGGCACCAAACTCCATGGGATGATTTTTCTTCTAGAAGAGTCCAGGTGGACAGGTAAGGAGTGGGAGTCAGGGAGTCCAGTTCCAGGGACAGAGATTACGGGATAAAAAGTGAAAGGAGAGGGACGGGGCCCATGCCGAGGGTTTCTCCCTTGTTTCTCAGACAGCTCTTGGGCCAAGACTCAGGGAGACATTGAGACAGAGCGCTTGGCACAGAAGCAGAGGGGTCAGGGCGAAGTCCAGGGCCCCAGGCGTTGGCTCTCAGGGTCTCAGGCCCCGAAGGCGGTGTATG(SEQIDNO：29)

上游HLA-A2(531bp)：

GAGTCCTGTTGTAATGCTTTTGGACACATTTATACATTAAGGGGCCAAAGTCACATTTTTTACCTATTAGATTCCTGATCATTCAGGGGTTACCAAGATTCTGCTACCCACTGTAGTTAATAAACAAAGAGCAAATTGGTCTCTATTCTGTCTCATGCACTCAGGCACAACTTTTCCGGATTAAAAACAAAAACAACAACAACAAAAATCTACACCTCCATTCCCAGATCAAGCTTACTCTCTGGCACCAAACTCCATGGGGTGATTTTTCTTCTAGAAGAGTCCAGGTGGACAGGTAAGGAGTGGGAGTCAGGGAGTCCAGTTCAGGGACAGAGATAATGGGATGAAAAGTGAAAGGAGAGGGACGGGGCCCATGCCGAGGGTTTCTCCCTTGTTTCTCAGACAGCTCCTGGGCCAAGACTCAGGGAGACATTGAGACAGAGCGCTTCGCACAGGAGCAGAGGGGTCAGGGCGAAGTCCCAGGGCCCCAGGCGTGGCTCTCAGAGTCTCAGGCCCCGAAGGCGGTGTATG(SEQIDNO：30)

上游HLA-B7(352bp)：

AGGTTTAAAGAGAAAACCCCTGTCTCTACACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACTCTCTGGCATCAAGTTCCCCGTGCTCAGTTTCCCTACACAAGAGTCCAAGAGGAGAGGTAAGGAGTGGGAGGCAGGGAGTCCAGTTCAGGGACAGGGATTCCAGGACGAGAAGTGAAGGGGAAGGGGCTGGGCGCAGCCTGGGGGTCTCTCCCTGGTTTCCACAGACAGATCCTTGTCCAGGACTCAGGCAGACAGTGTGACAAAGAGGCTTGGTGTAGGAGAAGAGGGATCAGGACGAAGTCCCAGGTCCCGGACGGGGCTCTCAGGGTCTCAGGCTCCGAGGGCCGCGTCTGCAAT(SEQIDNO：31)

上游HLA-B7(511bp)：

GAGTTTAATTGTAATGCTGTTTTGACACAGGTCTTTTACAAATTGGAATTCTAATCATTCAGGGATTACCAATATTGTGCTACCTACTGTATTAACAAACAAAAAGGAAACTGGTCTCTATGAGAATCCCTATGCGGTGCCTTCAGAGAAAACTTCACCAGGTTTAAAGAGAAAACCCCTGTCTCTACACCTCCATTCCCAGGGCGAGCTCACTCTCTGGCATCAAGTTCCCCGTGCTCAGTTTCCCTACACAAGAGTCCAAGAGGAGAGGTAAGGAGTGGGAGGCAGGGAGTCCAGTTCAGGGACAGGGATTCCAGGACGAGAAGTGAAGGGGAAGGGGCTGGGCGCAGCCTGGGGGTCTCTCCCTGGTTTCCACAGACAGATCCTTGTCCAGGACTCAGGCAGACAGTGTGACAAAGAGGCTTGGTGTAGGAGAAGAGGGATCAGGACGAAGTCCCAGGTCCCGGACGGGGCTCTCAGGGTCTCAGGCTCCGAGGGCCGCGTCTGCAAT(SEQIDNO：32)

上游HLA-E(328bp)：

ACTAATTTCTTTTTTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGGGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCCTCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCCAGGATTACAGCCATGCGCCACCACGCCGGCTAATTTTTTGGACTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCGGGCTGGTCTCGAACTCCCAACCTCAGGTGATCAGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCAGCCAGGACTAATTTCTAAGAGTGTGCAGAGATACCGAAACCTAAAAGTT(SEQIDNO：33)

上游HLA-E(1047bp)：

TTTTTTCCCCCTAGACATCTCACTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGTGATCTCGGCTCACTGCAACCACCACCTCTCGGGTTCAAGCAATTCTCCTATCTCAGCCTCCAGAGTTGCTGGAATTACAGGCGCGCACCACCACACCCGGCTAATTTTTGTATTGTTAGTAGAGACAGGGTTTCATCATGTTGGCCAGGTTAGTCTTGAACTCCTGACCTCGTGATCTGCCTGCCTCGGCCTACCAAAATGCTGCGATTACAGGCGTGAGCCACCGTTCCCGGCCTATACGTTGTTTATTTTGGAAAAATTAAAAATTAAGTTTTTTTTCATTAAAGATATGTTATTTCCGATCAAGAGATCAAGACCATCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCACACGCCTGTAGTTCCAGTTACTGGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGAAGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCATGCCACTGCACTCCAGCCTGGGGACAGAGCAAGACTCTGACTCAAAAAAAAAAAAAGTTGTTTCTATTAACATGTAATGGGTTATTAATATTCTCTTAAATGAATTAATATTTTTAATATTTTGTTTTAATATCTTTTAATTTATATATGATAAAAATTGATACAATCCACAGAAACAAAATTTATTTGGGTCCTCACTAATTTCTTTTTTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGGGCAATGGCACGATCTTGGCTCACCGCAACCTCCTCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCCAGGATTACAGCCATGCGCCACCACGCCGGCTAATTTTTTGGACTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATATTGGTCGGGCTGGTCTCGAACTCCCAACCTCAGGTGATCAGCCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATTACAGGCGTGAGCCACCGCGCCCAGCCAGGACTAATTTCTAAGAGTGTGCAGAGATACCGAAACCTAAAAGTT(SEQIDNO：34)

上游HLA-DRα(356bp)：

ATACAGCCTTTCATCCTTCTCCAGTGTTGAGAGTGTTGAACCTCAGAGTTTCTCCTCTCATTTTCTCTAAATGAGATACAATGCCAGCCATCCCAAGCTCTTGGCCTGAGTTGATCATCTTGAAGTCTAGGACTCCAAGAAGCATGAAAGAGCTTCTTTAGTGAAGCTATGTCCTCAGTACTGCCAAAATTCAGACAATCTCCATGGCCTGACAATTTACCTTCTATTTGGGTAATTTATTGTCCCTTACGCAAACTCTCCAACTGTCATTGCACAGACATATGATCTGTATTTAGCTCTCACTTTAGGTGTTTCCATTGATTCTATTCTCACTAATGTGCTTCAGGTATATCCCT(SEQIDNO：35)

上游HLA-DRα(522bp)：

TAGGCTTTGCCCATTATACTCTCTCATATTCATTGACCTGAATCCTCAAATGAGGTGTGTCCATTAGTCAACTCCAATCTCTTGTCATATATAAGATGGTAGAGATGAGAAGAAGGTAGCTCCTTTACAGCCCACTATTTCCACTAACTACTACCTGTGTTTCAAGATACAGCCTTTCATCCTTCTCCAGTGTTGAGAGTGTTGAACCTCAGAGTTTCTCCTCTCATTTTCTCTAAATGAGATACAATGCCAGCCATCCCAAGCTCTTGGCCTGAGTTGTTCATCTTGAAGTCTAGGACTCCAAGAAGCATGAAAGAGCTTCTTTAGTGAAGCTATGTCCTCAGTACTGCCAAAATTCAGACAATCTCCATGGCCTGACAATTTACCTTCTATTTGGGTAATTTATTGTCCCTTACGCAAACTCTCCAGCTGTCATGGCACAGACATATGATCTGTATTTAGCTCTCACTTTAGGTGTTTCCATTGATTCTATTCTCACTAATGTGCTTCAGGTATATCCCT(SEQIDNO：36)

在一些实施方式中，载体包含SEQIDNO：37-46中的任意。

慢病毒载体的产生

在一个实施方式中，本发明包括一种方法，该方法包括将I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列插入慢病毒载体。该方法还可包括插入本文中所述任意其他核酸元件，如DNA瓣序列。

本发明包括生产慢病毒载体的方法，该方法包括将至少I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸插入慢病毒载体。

在多个实施方式中，上游启动子序列包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的少于1100、1000、900、800、700、600、550、500、450、400或350个核苷酸。

本发明包括生产慢病毒载体的方法，该方法包括将I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、或500至305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、550、600、700、800、900、1000、或1100个核苷酸(在所有可能的范围组合内)插入慢病毒载体。优选地，上游启动子序列包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300-400、300-500、300-600、300-700、或300-1100个核苷酸。

最优选地，上游启动子序列包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300-335个核苷酸。

优选地，将I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列插入包含I型MHC或β2微球蛋白启动子的慢病毒载体。上游启动子序列可以是与启动子相同或相反的取向。

本发明包括生产慢病毒载体的方法，该方法包括将至少I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸和I型MHC或β2微球蛋白启动子插入慢病毒载体。

在多个实施方式中，上游启动子序列包含少于I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的1100、1000、900、800、700、600、550、500、450、400或350个核苷酸。

本发明包括生产慢病毒载体的方法，该方法包括将I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、或500至305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、550、600、700、800、900、1000、或1100个核苷酸(在所有可能的范围组合内)和I型MHC或β2微球蛋白启动子插入慢病毒载体。优选地，上游启动子序列包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300-400、300-500、300-600、300-700、或300-1100个核苷酸。最优选地，上游启动子序列包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的300-335个核苷酸。

在一个实施方式中，在插入I型MHC或β2微球蛋白启动子之前将I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列插入慢病毒载体。

在一个实施方式中，在插入I型MHC或β2微球蛋白启动子之后将I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列插入慢病毒载体。

在一个实施方式中，将I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列和I型MHC或β2微球蛋白启动子一起插入慢病毒载体。

在一个实施方式中，β2微球蛋白上游启动子序列以与I型MHC或β2微球蛋白启动子相同的取向插入上游。

在一个实施方式中，I型MHC或II型MHC上游启动子序列以与I型MHC或β2免疫球蛋白启动子相同的取向插入上游。

优选地，上游启动子序列包含β2微球蛋白、HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E或HLA-G上游启动子序列并且该启动子是β2微球蛋白、HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E或HLA-G启动子。所有的组合单独被认为是本发明的部分。

优选地，上游启动子序列包含包含SEQIDNO：1-SEQIDNO：7或SEQIDNO：27-SEQIDNO：36中任意的核苷酸序列。

慢病毒颗粒载体的产生

本发明提供了一种生产慢病毒颗粒载体的方法，该载体含有I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列。因此，本发明包括一种慢病毒颗粒载体，该载体包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列。慢病毒颗粒载体(或慢病毒载体颗粒)包括与病毒蛋白质相关联的慢病毒载体。

插入I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列可增加载体的效价。

根据该方法的一个实施方式，颗粒载体在转化有DNA质粒的宿主细胞中获得。

这种DNA质粒可包含：

-细菌复制起点(如pUCori)；

-用于选择的抗生素抗性基因(如KanR)；且更具体地：

-一种慢病毒载体，该载体包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列。

本发明允许产生重组载体颗粒，其包括以下步骤：

i)使用慢病毒载体转染或转导合适的宿主细胞；

ii)使用包装质粒载体转染或转导所述宿主细胞，所述包装质粒载体含有编码反转录病毒(优选慢病毒)的至少结构和聚合酶蛋白的病毒DNA序列；这类包装质粒在本领域中已有描述(Dull等，1998，JVirol，72(11)：8463-71；Zufferey等，1998，JVirol72(12)：9873-80)。

iii)培养所述转染的宿主细胞以使所述慢病毒载体表达并包装成慢病毒载体颗粒；以及

iv)收获所述培养的宿主细胞中由步骤iii)的表达和包装所得到的慢病毒载体颗粒。

用包装质粒转染或转导的宿主细胞可以是稳定包装细胞系。因此，该方法可包括：

i)使用慢病毒载体转染或转导包装细胞系；

ii)培养该细胞系以使所述慢病毒载体表达并包装成慢病毒载体颗粒；以及

iii)收获培养的培养的细胞系中由步骤ii)的表达和包装所得的慢病毒载体颗粒。

基于不同原因，制备获得的逆转录病毒颗粒的假型(即增加或代替特定颗粒包膜蛋白)可能是有帮助的。例如，具有不同的包膜蛋白以区分重组颗粒与天然颗粒或其他重组颗粒可能是有利的。在疫苗接种策略中，当患者已经发展出针对慢病毒的免疫时，假型颗粒载体更有可能逃避免疫系统。如果类似的颗粒载体的连续注射是使患者对疾病产生免疫所必需的，那么这是特别有帮助的。

为制备本发明的逆转录病毒颗粒的假型，还可使用编码病毒包膜蛋白(优选VSV-G包膜蛋白)的一种或数种包膜DNA质粒来转染宿主细胞。

合适的宿主细胞优选是人培养细胞系，例如HEK细胞系。

用于生产载体颗粒的方法可在宿主细胞中进行，其基因组已使用如下一种或多种组分稳定转化：慢病毒载体DNA序列、包装基因和包膜基因。这类DNA序列可被视作与本发明的原病毒载体类似，包含额外的启动子以允许载体序列转录并提高颗粒生产率。

在优选实施方式中，还对宿主细胞进行修饰，使其能够在培养基中以连续的方式生产病毒颗粒，同时整个细胞不发生溶胀或死亡。关于用于生产病毒颗粒的这类技术，可参见Strang等，2005，JVirol79(3)：1165-71；Relander等，2005，MolTher11(3)：452-9；Stewart等，2009，GeneTher，16(6)：805-14；和Stuart等，2011，HumgeneTher(在版)。

本发明的目的由用慢病毒颗粒载体转化的宿主细胞组成。

慢病毒颗粒载体可包括以下元件，如前文所定义：

-cPPT/CTS多核苷酸序列；以及

-启动子控制下的转基因序列，

-I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列，

和任选的上述其它元件之一。

细胞中表达转基因的方法

本发明包括用于在细胞(优选非分裂细胞)中表达转基因的方法。该方法包括在允许转基因表达的条件下，使用本发明的慢病毒载体或慢病毒颗粒载体转导细胞。

细胞优选是哺乳动物细胞，特别是人细胞。特别优选的是人非分裂细胞。

转基因优选编码免疫原性多肽。该方法还可包括收获或分离所述多肽。

慢病毒载体或慢病毒颗粒载体优选包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列。优选地，该载体还包含I型MHC或β2微球蛋白启动子。

在一个实施方式中，本发明包括一种表达转基因的方法，该方法包括向慢病毒载体中插入I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列并且用含有I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的载体转导细胞。

慢病毒载体的治疗性用途

本发明还涉及本发明的慢病毒载体，尤其是慢病毒颗粒载体形式，用于制备治疗性组合物或疫苗的用途，该治疗性组合物或疫苗能够诱导或造成针对表位的免疫反应发生或增强，更具体地，由存在于含有I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列的载体中的转基因编码的那些。

因此，本发明提供了用作药物或疫苗，尤其是用于基因疗法的载体。

这些载体优先用于感染性疾病的治疗或预防，特别是与病毒感染相关联的疾病，且更特别的是与逆转录病毒感染(如AIDS和其他免疫缺陷)相关联的疾病。

本发明还可用于针对肿瘤和癌症的治疗方案，特别可用于针对肿瘤的免疫治疗或疫苗接种治疗的方案。

由于本发明的载体更特异性地靶向树突细胞以获得细胞介导的免疫应答，特别是与这些细胞中的转基因表达的抗原相关联的CTL应答，其作为靶向缓慢或内源性病原微生物(如分枝杆菌或HIV病毒)的疫苗时其特别有用。

因此，本发明涉及包含前文所定义的慢病毒载体的免疫原性组合物。

本发明的免疫原性组合物优选包含载体和载体颗粒中的cPPT和CTS序列，以诱导或刺激载体基因组在靶细胞中的核输入。

逆转录期间，cPPT和CTS序列诱导称作DNA三链体的三链DNA结构的形成，其刺激DNA载体序列的核输入。优选地，该载体包含转基因以及逆转录病毒或逆转录病毒样来源逆转录、表达和壳体化的调控信号，该组合物能够诱导或刺激CTL(细胞毒性T淋巴细胞)或CD4对载体中存在的转基因序列所编码的一种或数种表位产生应答。

通过在载体中包含I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游启动子序列来改善慢病毒载体的效价。

因此，本发明的慢病毒载体能够诱导、提高记忆CTL应答的发生或通常与之相关联。换言之，通过诱导、刺激或参与细胞介导免疫应答(特别是CTL应答或记忆应答)的发生，它们可用于制备用于治疗肿瘤疾病或感染性疾病的治疗性组合物。

本发明的慢病毒载体可用于治疗方法和诱导免疫应答的方法，包括向宿主给予慢病毒载体并在宿主中产生针对转基因的特异性免疫应答。这些宿主中生成的细胞和抗体可用作诊断试剂。

本发明的慢病毒载体可通过已知给药途径直接给予患者，包括系统性、局部或表皮、肌内、真皮内，例如瘤内给药途径。本发明还包括离体给药，例如靶细胞的离体转导，随后将经处理的细胞给予待治疗的患者。

在特定实施方式中，本发明的免疫原性组合物可直接给予患者，以可诱导、提高或在体内参与细胞介导的免疫应答(特别是CTL介导的免疫应答)的发生的方式给予。

在另一个实施方式中，免疫原性组合物可单次使用或重复给予后使用，使其能够产生长期记忆型细胞介导的应答。

本发明的免疫原性组合物可用于引发或刺激针对多种表位的细胞介导的免疫应答，所述表位由感兴趣的核苷酸序列或者载体或载体颗粒中存在的转基因编码，且其还可用于引发或刺激针对某一基因整个序列产物的细胞介导的免疫应答，例如病原体基因或能够编码至少8至15个氨基酸(优选9至12个氨基酸)的所述基因的片段。

本发明还包括包含核苷酸序列的慢病毒载体，所述核苷酸序列编码诱导细胞应答的氨基酸序列的多个重复(至少2条相同序列)和/或含有至少2条不同序列(对应于不同病原体或肿瘤抗原的2个表位)的氨基酸序列。

因此，本发明包括可用于预防性和/或治疗性疫苗接种方案的组合物，其用于肿瘤的治疗且特别是用作抗癌或抗感染性疾病治疗。

具体而言，其可与佐剂、其他免疫原性组合物、化疗或任何其他治疗性处理联用。

因此，已经描述了本发明的不同实施方式，本领域技术人员应注意，本文所公开的内容仅是示例性的，且多种其他替代、调整或修改可包括在本发明的范围内。因此，本发明不限于本文所示特定实施方式。

实施例

实施例1.细胞系

将HEK293T(人胚胎肾细胞系，ATCCCRL-11268，(Graham等，1977))细胞保持在补充了10％胎牛血清(FBS，PAA)、1％L-谷氨酰胺(Eurobio)、1％青霉素-链霉素(生命技术公司(Lifetechnologies)的Gibco)和1％丙酮酸钠(生命技术公司的Gibco)的达氏改良伊氏培养基(DMEM/高改良，Hyclone)中。该细胞系保持在37℃下含5％CO₂的湿润气氛的孵育器中。

实施例2.质粒构建

启动子在pFLAP-GFP原病毒质粒的MluI和BamHI位点之间克隆。

β2m_上游序列(β2m_US)在启动子的上游克隆：

HLA-B7和HLA-E启动子购自GeneArt(生命技术公司)，并且它们设计为包括在原始启动子序列的5’端上游的β2m上游启动子序列(β2m_US)。为了生成HLA-B7和HLA-E原病毒质粒，进行PCR反应以仅扩增野生型启动子序列，其克隆在pFlap-GFP质粒的MluI和BamHI位点之间。

为了将β2m-上游序列(β2m_US)加到HLA-A2、HLA-DRα、CMV和UBC启动子的5’端，进行融合PCR反应。简言之，进行3次分开的PCR反应：第一次PCR扩增β2m_US，第二次PCR扩增启动子，包括与β2m_US的末端同源的25bp突出端。PCR1和2的产物然后在琼脂糖凝胶(QIA快速凝胶提取试剂盒，凯杰公司(QIAGEN))中纯化并用作第三次PCR的基质，第三次PCR将生成最终的DNA产物(β2m_US-启动子)。用于各启动子的三次PCR的引物描述于表1。PCR3产物经凝胶纯化并在(生命技术公司)中克隆、测序、由MluI和BamHI限制性酶消化并克隆到pFlap-GFP中。

β2m_上游序列以反向取向克隆到启动子的上游：

如上所述，使用融合PCR将反向取向的β2m上游启动子序列(β2m_USR)克隆到各启动子的上游。所有USR_启动子在AscI和BamHI位点之间扩增，然后使用MluI和BamHI位点克隆到pflap-GFP中。用于各启动子的三次PCR的引物列于表2。

β2m_上游序列以正向取向克隆到GFP下游：

使用XhoI和KpnI限制性位点将β2m_US克隆到GFP报告基因的下游。首先，进行PCR以将XhoI和KpnI位点分别加到β2m_US的5’和3’。PCR使用的引物是：正向：5’-CTCGAGGAGAAACCCTGCAGGGAATTC-3’(SEQIDNO：9)，反向：5’-GGTACCGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3’(SEQIDNO：10)。PCR产物经凝胶纯化、在(生命技术公司)中克隆、测序、由XhoI和KpnI限制性酶消化并克隆到pFlap-GFP的XhoI和KpnI位点之间。

β2m_上游序列以反向取向克隆到GFP下游：

使用XhoI和KpnI限制性位点将反向取向的β2m上游启动子序列(β2m_USR)克隆到GFP报告基因的下游。首先，进行PCR以将XhoI和KpnI位点分别加到β2m_US的5’和3’。使用的引物是：正向：5’-GGTACCGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAG-3’(SEQIDNO：11)，反向：5’-CTCGAGGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3’(SEQIDNO：12)。PCR产物然后经凝胶纯化、在(生命技术公司)中克隆、测序、由XhoI和KpnI限制性酶消化并克隆到pFlap的XhoI和KpnI位点之间。

克隆到pUCori和KanR之间的β2m上游序列：

由于pUCori和KanR序列之间存在的限制性位点的数量受到限制，我们选择将β2m_US克隆到PmlI位点中。由于PmlI位点也存在于pFlap主链的5’LTR中，我们首先使用融合PCR将β2m_US加到pUCori的上游，然后克隆2个PmlI位点之间的整个片段。PCR1使用的引物(β2m_US的扩增)是：F1_5’-CACGTGGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAG-3’(SEQIDNO：13)和R1_5’-GAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3’(SEQIDNO：14)。PCR2使用的引物(pUCori和SV40的扩增)是：F25-TGCCTTCTTAAACATCACGAGACTCCTAAAACTTCATTTTTAATTT-3’(SEQIDNO：15)，含有与β2m_US的末端同源的突出端(粗体)，和R2_5’-CACGTGATGAAATGCTAGGCGGCTGTC-3’(SEQIDNO：16)。PCR1和2产物在琼脂糖凝胶上纯化并用作第三次PCR的基质，并且F1和R2引物用于扩增。PCR3产物经凝胶纯化并在(生命技术公司)中克隆、测序、由PmlI消化并克隆到pFlap-GFP中的相同位点之间。由酶促消化来控制克隆取向。

以反向取向克隆到pUCori和KanR之间的β2m_上游序列：

如上所述，β2m_USR克隆到PmlI位点之间。

PCR1使用的引物(β2m_US的扩增)是：F1_5’-CACGTGGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCATG-3’(SEQIDNO：17)和R1_5’-GAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAG-3’(SEQIDNO：18)。PCR2使用的引物(pUCori和SV40的扩增)是：F2_5-TGGGGAATTCCCTGCAGGGTTTCTCCTAAAACTTCATTTTTAATTT-3’(SEQIDNO：19)，含有与β2m_US的末端同源的突出端(粗体)，和R2_5’-CACGTGATGAAATGCTAGGCGGCTGTC-3’(SEQIDNO：20)。PCR1和2产物经凝胶纯化并用作第三次PCR的基质，并且F1和R2引物用于扩增。PCR3产物经凝胶纯化并在(生命技术公司)中克隆、测序、由PmlI消化并克隆到pFlap-GFP中的相同位点之间。由酶促消化来控制克隆取向。

使用M1uI和BamHI位点将启动子克隆到pFlap-GFP质粒中。由于β2m和HLA-B7启动子在其序列中含有M1uI位点，使用AscI位点(与M1uI位点相容)作为置换，其使M1uI位点消失。

克隆在启动子上游的短上游序列

HLA-A2、HLA-E和HLA-DRα短上游序列购自GeneArt并且使用M1uI限制性位点克隆在它们相应的启动子的上游。通过测序来控制插入序列的取向。使用用于PCR1的融合PCR引物将HLA-B7短上游序列加到HLA-B7启动子的上游(HLA-B7US的扩增)，该引物是：F1_5’-GGCGCGCCCAGGTTTAAAGAGAAAACCCCTG-3’(SEQIDNO：17)和R1_5’-ATTGCAGACGCGGCCCTCGGAGCCTGAGA-3’(SEQIDNO：18)。PCR2使用的引物(HLA-B7启动子的扩增)是：F25-AGGCTCCGAGGGCCGCGTCTGCAATGGGGAGGCGCACGTTGGGGATTC-3’(SEQIDNO：19)，含有与HLA-B7US的末端同源的突出端(粗体)，和R25’-CGGAAGGAAAGTGACGGGCGAA-3’(SEQIDNO：20)。PCR1和2产物经凝胶纯化并用作第三次PCR的基质，并且F1和R2引物用于扩增。PCR3产物经凝胶纯化并克隆到(生命技术公司)、测序、由M1uI和BamHI限制性酶消化并克隆到pFlap-GFP中。

克隆在启动子上游的长上游序列

HLA-A2、HLA-E和HLA-DRα长上游序列购自GeneArt并且使用M1uI限制性位点克隆在它们相应的启动子的上游。通过测序来控制插入序列的取向。

B2m_Up和HLA-B7_Up嵌段(启动子+长上游序列)购自GeneArt并且使用M1uI/BamHI限制性位点克隆到pFlap-GFP中。

双上游序列

使用XhoI和KpnI限制性位点将HLA-E_US克隆到pFlap-ΔU3-β2m_E_US-GFP中的GFP基因上游。首先，进行PCR以将XhoI和KpnI位点分别加到HLA-E_US的5’和3’。用于PCR的引物是：正向：5’-CTCGAGACTAATTTCTTTTTTCTTGTTGCC-3’和反向：5’-GGTACCAACTTTTAGGTTTCGGTATCTCTGCACA-3’。PCR产物然后经凝胶纯化、在(生命技术公司)中纯化、测序、由XhoI和KpnI限制性酶消化并克隆到pFlap-ΔU3-β2m_E_US-GFP中的相同位点之间，以得到pFlap-ΔU3-β2m_E_US-GFP_E_US。

实施例3.慢病毒产生

使用标准磷酸钙沉淀方案通过HEK293T细胞的瞬时转染产生慢病毒载体。HEK293T细胞以7x10⁶个细胞接种在10mL完全培养基中的10cm²组织培养皿(BDFalcon)中并在37℃下5％CO₂的潮湿气氛的孵育器中保持24小时以粘附。对于各产生的载体，如下转染组织培养皿：慢病毒主链质粒pFlap(10μg)、pThV-Env1编码包膜质粒(2μg)和pThV-GP包装质粒(10μg)与353μL的无菌蒸馏水(生命技术公司的Gibco)和125μL的CaCl₂(伏路卡公司(Fluka))混合。然后向500μL的37℃预热的HBS2XpH＝7.3中逐滴加入DNA混合物，并且1mL的所得沉淀物加入细胞的培养基中。转染的细胞然后在37℃，5％CO₂下孵育。培养基在转染后24小时用7mL不含血清的收获培养基置换并且在另外24小时后通过2500rpm下离心5分钟收获病毒上清并储存在-20℃下。

实施例4.通过流式细胞术对慢病毒载体进行定量

为了对感染性颗粒进行定量，HEK293T细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种在含10％FBS的完全培养基的24-孔平板(BDFalcon)中并孵育4小时以粘附。通过用300μl的病毒样品在完全培养基中的1/100、1/300和1/900稀释物置换，接着在37℃，5％CO₂下孵育2小时来转导细胞。吸收之后，各孔中加入1mL的完全培养基。在转导后72小时，细胞用胰蛋白酶消化并重悬在300μL的完全培养基中，并且由FACScalibur流式细胞仪(BD生物科学公司)使用FL1通道测定表达GFP的细胞的百分比。对各测试的样品进行2组3种稀释。对应于不到30％的经转导的细胞的百分比的值用于计算病毒悬浮液中存在的转导单元(TU)的大致数量。

实施例5.由ELISAp24对总产生的颗粒的定量

使用市售试剂盒(帕金埃尔默公司(PerkinElmer))按照生产商的推荐在各生产上清的10^-5、10^-6和10^-7稀释上进行对总颗粒的定量。

实施例6：qPCR对高效产生的颗粒的定量

HEK293T细胞接种在培养基的6-孔平板(BDFalcon)并在37℃，5％CO₂下的潮湿气氛中孵育4小时。用慢病毒载体的3种连续稀释物(1/5、1/10和1/20)来转导细胞。孵育后72小时，细胞收获并且得到经转导的HEK293T细胞团块。在-20℃下的中间储存之后，使用基于QIAGENQIAampDNA小试剂盒手册的方法使用柱和微量离心来从经转导的细胞-团块中提取总基因组DNA。提取的DNA储存在-20℃下直至用于qPCR。基于5’-3’Taq聚合酶的外切核酸酶活性，使用优化的TaqmanqPCR在提取的DNA上对整合到宿主基因组中的原病毒DNA进行定量。

该探针是针对我们的慢病毒载体序列的主链有特异性的寡核苷酸。用聚合酶主混合物(富酶泰斯热科学公司(FermentasThermoScientific))并使用FlapA引物(CCCAAGAACCCAAGGAACA)(SEQIDNO：21)、FlapS引物(AGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAAC)(SEQIDNO：22)、和LentiTM引物(6FAM-AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGG-BBQ)(SEQIDNO：23)来进行扩增。为了将整合的数量对收获的细胞的数量标准化，使用相同的主混合物和肌动蛋白A引物(CGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT)(SEQIDNO：24)、肌动蛋白S引物(AACACCCCAGCCATGTACGT)(SEQIDNO：25)和HumuraACTTM探针(6FAM-CCAGCCAGGTCCAGACGCAGGA-BBQ)(SEQIDNO：26)对细胞ACTIN基因平行应用特异性扩增。按照热程序(50℃下2分钟，95℃下10分钟，和40个循环的95℃下15秒和63℃下1分钟)在MasterCyclerEpRealplexS(Eppendorf)上实现两种反应。在MasterCyclerEpRealplex软件上进行分析。