预测受试者对多激酶抑制剂的反应的基因表达标志及其使用方法

摘要

本发明公开了预测癌症患者对多激酶抑制剂的反应的基因表达标志。还公开了预测所述多激酶抑制剂用于治疗患者癌症的功效的方法。还公开了用于区分对多激酶抑制剂治疗癌症的反应者与非反应者的方法。另公开了用多激酶抑制剂治疗癌症患者的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年8月28日提交的国际专利申请系列号 PCT/CN2013/082487的优先权和权益，该案全文通过引用并入本文中 用于所有目的。

发明领域

本发明涉及受试者的治疗以及用于用多激酶抑制剂，例如索拉非 尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、阿西替尼(Axitinib)、凡德 他尼(Vandetanib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、卡博替尼(Cabozantinib) 等，或其盐、溶剂化物或生理功能衍生物，或其混合物治疗的受试者 的鉴别和选择。提供了用于如癌症等疾病的预测、诊断、预后及治疗 的方法、试剂及工具。

发明背景

肝细胞癌(HCC)是一种侵袭性肿瘤并且是世界上第五大致命性 癌症。它在东亚和男性中特别流行(ParkinDM，BrayF，FerlayJ，Pisani P.Globalcancerstatistics，2002.CACancerJClin2005；55：74-108； El-SeragHB，7.Rudolp.hKL.Hepatocellularcarcinoma：epidemiology andmolecularcarcinogenesis.Gastroenterology2007；132：2557-76)。在美 国和中国，其发病率稳步增加(1)。截至目前，有效的治疗选择很少。 常见的标准化学疗法(例如多柔比星(doxorubicin))具有极少临床 益处。

唯一得到批准的可用靶向疗法是索拉非尼，该疗法目前变得可行 (1)。索拉非尼是靶向血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成并 且阻断RAF/细胞外信号调节激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK级联 的一种多激酶抑制剂。它是最先发现的可延长晚期肝细胞癌(HCC) 患者的存活期的药物，并且已经被销售用于治疗晚期肾细胞癌和不可 切除的HCC。然而，HCC患者的存活期增加仅3个月。与许多新一 代的靶向疗法相同，索拉非尼也具有不利的副作用。就安全性和缺乏 功效而言，许多HCC患者对索拉非尼的反应不良。很明显，需要索 拉非尼的预测标记物来帮助选择可能得到最大益处的患者群体。

关于索拉非尼的初始单组II期研究报导，磷酸化ERK(pERK) 的基线水平可能是一种相关的标记物，而且有一些报导公布了血清标 记物(例如可溶性c-KIT、HGF、AFP、VEGF等)与索拉非尼治疗 结果之间的关系，但这些结果只是非常初步的结果或在多项研究中并 不恒定。因此，利用这些因素作为潜在预测标记物需要进行进一步评 价，并且新的策略，如基于基因组学的分子标志分析，可用于鉴别新 的预测标记物，并有助于更好地了解索拉非尼在HCC中的作用机制。

发明概述

本发明提供了可以用于预测受试者对药物的反应性/抗性的一组 基因标记物。在一些实施方案中，基因标记物包括SEC14L2、H6PD、 TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2、UGT2A1、其功能变 体、片段或直系同源物。

本发明还提供了一组基因标记物的活性谱集合，所述组基因标记 物包括至少两个或更多个选自由以下组成的组的基因标记物： SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2、 UGT2A1，其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，该 活性谱从超过一个对药物起反应的受试者收集。在一些实施方案中， 该活性谱从超过一个对药物具有抗性的受试者收集。在一些实施方案 中，该药物是多激酶抑制剂。在一些实施方案中，多激酶抑制剂靶向 血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成并且阻断RAF/细胞外信 号调节激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK级联。在一些实施方案中， 多激酶抑制剂包括索拉非尼，或其盐、溶剂化物或生理功能衍生物。 在一些实施方案中，活性谱集合在用药物治疗之前、期间和/或之后 从受试者、受试者的部分或源自于受试者的细胞收集。在一些实施方 案中，该组基因标记物包括至少两个、三个或四个本发明的基因标记 物。

本发明还提供了用于确定受试者对药物的反应性或抗性的方法。 在一些实施方案中，该药物是多激酶抑制剂。在一些实施方案中，多 激酶抑制剂靶向血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成并且阻 断RAF/细胞外信号调节激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK级联。在 一些实施方案中，多激酶抑制剂包括索拉非尼，或其盐、溶剂化物或 生理功能衍生物。在一些实施方案中，所述方法包括测量一组基因标 记物的活性谱。在一些实施方案中，所述方法另外包括将该组的活性 谱与预定活性谱相比较。在一些实施方案中，受试者的反应性是基于 该组基因标记物的活性谱与该预定活性谱之间的比较确定。在一些实 施方案中，如果该组的活性谱在该预定活性谱的范围内，那么确定该 受试者对药物具有反应，或如果该组的活性谱不在该预定活性谱的范 围内，那么确定其对药物具有抗性。在一些实施方案中，也可以使用 从对药物不具有反应的受试者得到的活性谱。举例来说，如果该组的 活性谱是在源自于对药物不具有反应的受试者的活性谱的范围内，那 么确定该受试者对药物不具有反应。

在一些实施方案中，一组基因标记物的活性谱包括描述基因表达 水平、RNA活性水平和/或蛋白质活性水平的一个或多个参数。在一 些实施方案中，该活性谱由基于基因表达水平、RNA活性水平和/或 蛋白质活性水平计算的一个定量标志值或一组标志值反映。

在一些实施方案中，该组包括至少两个、三个或四个基因标记物。 在一些实施方案中，基因标记物包括至少一个或多个选自由以下组成 的组的标记物：SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、 IRF8、STAT2及UGT2A1，或其任何组合。

在一些实施方案中，活性谱是基因表达水平，其中一个或多个基 因标记物的表达在多激酶抑制剂治疗前类似于或低于预定活性谱指 示受试者具有反应，而一个或多个基因标记物的表达在多激酶抑制剂 治疗前高于预定活性谱指示受试者具有抗性。

作为替代方案，本发明的生物标记物的活性水平在治疗后关于预 定标准水平标准化或稳定化指示受试者具有反应。在一些实施方案 中，SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2 和/或UGT2A1关于预定标准水平标准化或稳定化指示受试者具有反 应。在一些实施方案中，SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、 ACTA1、IRF8、STAT2和/或UGT2A1关于预定标准水平不存在标准 化和稳定化指示受试者对治疗具有抗性。如本文所使用，当一个生物 标记物的水平趋近预定标准水平时，它被称为标准化。如本文所使用， 当一个生物标记物的水平远离预定标准水平的速度降低时，它被称为 稳定化。

在一些实施方案中，多激酶抑制剂是索拉非尼、阿西替尼、凡德 他尼、帕唑帕尼、卡博替尼或其任何组合。

在一些实施方案中，受试者是患有癌症的人。在一些实施例中， 癌症是肝细胞癌。

本发明还提供了用于向受试者施用药物的方法。在一些实施方案 中，该药物是多激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述方法包括测试 该受试者的一组基因标记物的活性谱。在一些实施方案中，该组基因 标记物包括至少一个或多个选自由以下组成的组的标记物： SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2及 UGT2A1。在一些实施方案中，所述方法另外包括将该组的活性谱与 预定活性谱相比较。在一些实施方案中，该比较在施用药物之前、期 间或之后进行。在一些实施方案中，该药物包含至少一种多激酶抑制 剂。在一些实施方案中，多激酶抑制剂靶向血管内皮生长因子(VEGF) 介导的血管生成并且阻断RAF/细胞外信号调节激酶(ERK)激酶 (MEK)/ERK级联。在一些实施方案中，如果该组的活性谱是在源 自于对药物起反应的一群受试者的预定活性谱的范围内，那么向受试 者施用多激酶抑制剂。

本发明还提供了一种阵列，该阵列包含用于检测至少两个或更多 个基因标记物的探针。在一些实施方案中，基因标记物选自由以下组 成的组：SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、 STAT2及UGT2A1。在一些实施例中，该阵列是微阵列。

附图简述

图1示出了对于索拉非尼在一大组HuPrimeHCCPDX中的功效 的评价。图1A：计算ΔT/ΔC，其中ΔT和ΔC分别是治疗组和对照组 在指定目的平均肿瘤体积变化，在图B-E中以箭头指示。*：p＜0.05； **：p＜0.01；***：p＜0.001。图1B至1E显示代表性对索拉非尼起反应，模型代码分别是001、006、020及021。

图2示出了通过IHC检测的基线pERK水平与模型对索拉非尼 的反应无关。

图3显示标志基因的表达预示着在PDX模型中索拉非尼治疗对 于HCC的影响。以log2标度表示的标记物基因的平均mRNA表达 强度指定为标志评分。

图4示出了RAF/细胞外信号调节激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK 级联。

发明详述

如本文所使用，以下术语应具有以下含义：

在本说明和权利要求书中使用的动词“包括(comprise)”及其变 化形式是以其非限制性意义使用，意思指包括该词语之后的项目，而 且不排除未具体提到的项目。

术语“一个(种)(a/an)”是指一个或多个所述实体；举例来说， “一个基因”是指一个或多个基因或者至少一个基因。因此，术语“一 个(种)”、“一个(种)或多个(种)”及“至少一个(种)”在本文 中可互换使用。此外，加不定冠词“一个(种)”提到的“一个要素”不 排除可能存在超过一个要素，除非上下文清楚地要求有且仅有一个要 素。

本发明提供了分离的、嵌合的、重组或合成的多核苷酸序列。如 本文所使用，术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸 片段”及“分离的核酸片段”在本文中可互换使用并且涵盖单链或双链 的DNA、RNA、cDNA，以及其化学修饰。这些术语涵盖核苷酸序列 等。多核苷酸可以是单链或双链RNA或DNA的聚合物，其中任选 地含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基。呈DNA聚合物形式的多 核苷酸可以包含一个或多个具cDNA、基因组DNA、合成DNA或其 混合物的区段。核苷酸(通常以其5′-单磷酸形式存在)是以单字母 名称提及，如下所示：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别针对RNA 或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷 酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)， “Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I” 表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。在一些实施方案中，所述分离 的、嵌合的、重组或合成的多核苷酸序列是来源于本发明的基因标记 物。

本文所使用的单字母氨基酸缩写具有其在本领域中的标准含义， 并且本文所描述的所有肽序列都是根据惯例书写，其中N末端在左 边，而C末端在右边。

本发明提供了可以用于预测患者对药物的反应的表达基因标志。 如本文所使用，术语“基因”是指与生物功能有关的任何DNA区段。 因此，基因包括但不限于，其表达所需的编码序列和/或调控序列。 基因还可以包括例如形成其它蛋白质的识别序列的不表达的DNA区 段。基因可以从多种来源获得，包括从所关注的来源克隆，或由已知 或预测的序列信息合成，并且可以包括被设计成具有所希望的参数的 序列。

本发明提供了同源和直系同源的多核苷酸和多肽。如本文所使 用，术语“同源的”或“同源物”或“直系同源物”是本领域中已知的并且 是指共有共同的祖先或家族成员并且基于序列同一性程度确定的相 关序列。术语“同源性”、“同源的”、“基本上类似”及“基本上对应”在 本文中可互换使用。这些术语是指这样一些核酸片段，其中一个或多 个核苷酸碱基的变化不会影响核酸片段介导基因表达或产生某些表 型的能力。这些术语还指本发明的核酸片段的修饰，如相对于初始未 修饰的片段，基本上不改变所得核酸片段的功能特性的一个或多个核 苷酸的缺失或插入。因此，应了解的是，如本领域的技术人员所理解， 本发明不仅仅涵盖具体的示范性序列。这些术语描述了在一个物种、 亚种、品种、培养变种或品系中发现的基因与在另一物种、亚种、品 种、培养变种或品系中相应或相同的基因之间的关系。出于本发明的 目的，将比较同源序列。“同源序列”或“同源物”或“直系同源物”被认 为、相信或已知是功能相关的。功能关系可以通过多种方式中的任一 种指示，这些方式包括但不限于：(a)序列同一性的程度和/或(b) 相同或类似的生物功能。优选地，同时适用(a)和(b)。序列同一 性程度可能变化，而在一些实施方案中，该同一性程度是至少50％(当 使用本领域中已知的标准序列比对程序时)、至少60％、至少65％、 至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少约91％、 至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、 至少约97％、至少约98％，或至少98.5％，或至少约99％，或至少 99.5％，或至少99.8％，或至少99.9％。同源性可以使用本领域中易 于得到的软件程序，如CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M. Ausubel等人编，1987)增刊30，第7.718节，表7.71中所论述的那 些测定。一些比对程序是MacVector(OxfordMolecularLtd，Oxford， U.K.)、ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware，Pennsylvania) 及AlignX(VectorNTI，Invitrogen，Carlsbad，CA)。另一比对程序是 Sequencher(GeneCodes，AnnArbor，Michigan)，使用默认参数。

本发明提供了来源于标志基因的核酸序列的探针和引物。如本文 所使用，术语“探针”是指能够与扩增靶标特异性退火的寡核苷酸。如 本文所使用，术语“引物”是指这样一种寡核苷酸，该寡核苷酸能够与 扩增靶标退火，使DNA聚合酶附接，由此当处于诱导引物延伸产物 合成的条件下，即，在核苷酸和聚合试剂(如DNA聚合酶)存在下 并且在适合温度和pH下时充当DNA合成的起始点。为得到最大扩 增效率，(扩增)引物优选是单链的。优选地，引物是寡聚脱氧核糖 核苷酸。引物必须足够长以在聚合试剂存在下引发延伸产物的合成。 引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度和引物组成(A/T对比 G/C含量)。如在DNA扩增领域，如在PCR扩增中常用的，一对双 向引物由一个正向引物和一个反向引物组成。在一些实施方案中，这 些引物或探针与SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27及29中的任一个杂交。在一些实施方案中，这些引 物或探针与SEQIDNO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23、25、27及29中的任一个在严格杂交条件下杂交。如本文所使用， 严格杂交条件可以是6×SSC(0.9MNaCl，0.09M柠檬酸钠，pH7.4)， 65℃。

术语“阵列”或“矩阵”是指可定址的位置或“地址”在装置上的排 列。这些位置可以排列成二维阵列形式、三维阵列形式或其它矩阵形 式。位置的数量可以在数个到至少几十万个的范围内。最重要的是， 每个位置表示一个完全独立的反应位点。“核酸阵列”是指含有核酸探 针，如寡核苷酸或较大部分的基因的阵列。阵列上的核酸优选是单链 的。探针是寡核苷酸的阵列被称为“寡核苷酸阵列”或“寡核苷酸芯 片”。“微阵列”，在本文中又称“生物芯片(biochip/biologicalchip)”， 是离散区域的密度为至少约100/cm²，并且优选为至少约1000/cm²的 区域的阵列。微阵列中的区域具有在约10-250μm之间的范围内的典 型尺寸，例如直径，并且阵列中各区域间分开大致相同的距离。阵列 的组成及其制备和使用方法的非限制性实例描述于美国专利号 5202231、5695940、5525464、5445934、5744305、5677195、5800992、 5871928、5795716、5700637、6054270、5807522及6110426中，各 自通过引用全文并入本文中用于所有目的。

如本文所使用，术语“样本”或“生物样本”是指从生物体或从生物 体的各组成部分(例如，细胞)获得的样本。样本可以属于任何生物 组织或流体。样本可以是来源于患者的样本。此类样本包括但不限于， 唾液、血液、血细胞(例如，白细胞)、组织或活检样本(例如，肿 瘤活检)、尿液、腹膜液及胸膜液、患者来源的异种移植物(PDX) 或由此得到的细胞。生物样本还可以包括组织切片，如所取得的用于 组织学目的的冷冻切片。

术语“标记物”涵盖多种细胞内和细胞外事件以及整个生物体的 生理变化。标记物可以表示细胞功能的基本上任何方面，例如但不限 于，信号传导分子、转录因子、代谢物、基因转录物以及蛋白质翻译 后修饰产生的水平或速率。标记物可以包括转录物水平、速率和/或 稳定性的部分和/或全基因组分析，以及蛋白质水平、活性和/或修饰 的部分和/或全蛋白质组分析。标志也可以指与未治疗的患病细胞相 比较，在化合物治疗的患病受试者体内上调或下调的基因或基因产 物。也就是说，该基因或基因产物任选地在其它基因或基因产物存在 下，对可能使用其的经治疗细胞具有足够特异性以鉴别、预测或检测 小分子的功效。因此，在一些实施方案中，标志是表征一种化合物在 患病细胞中的功效或患病细胞对该化合物治疗的反应的基因或基因 产物。

术语“基线水平”是指关于“正常”水平的标准对照(即，未患病患 者、对药物起反应的患者或对药物不起反应的患者等)，而且还可以 是比较性的，例如在将低基线水平与患病的其它受试者的水平相比较 时。

术语“多激酶抑制剂”是指可以降低或阻断超过一种蛋白质激酶 的作用的一种组合物。该抑制剂可以降低或阻断丝氨酸激酶、酪氨酸 激酶、苏氨酸激酶和/或其它类型激酶的作用。该抑制剂可以靶向血 管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成并且阻断RAF/细胞外信号 调节激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK级联。多激酶抑制剂的实例包 括但不限于，包含以下一种或多种药物的组合物：如索拉非尼(例如 )、威罗非尼(vemurafenib)(例如，)、舒尼替尼 (例如)、阿西替尼(例如)、凡德他尼(例如 )、卡博替尼(例如)、普纳替尼(ponatinib)(例 如，)、鲁索替尼(ruxolitinib)(例如)、瑞格非尼 (regorafenib)(例如)、克卓替尼(crizotinib)(例如， )、其盐、溶剂化物或生理功能衍生物，或其混合物。

术语“索拉非尼”是指4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基}羰基) 氨基]苯氧基}-N-甲基吡啶-2-甲酰胺的盐。4-{4-[({[4-氯-3-(三氟甲基) 苯基]氨基}羰基)氨基]苯氧基}-N-甲基吡啶-2-甲酰胺和许多其它脲， 及其药学上可接受的盐，如盐、制剂、生理功能衍生物，如众多申请， 包括但不限于国际申请WO00/42012、WO00/41698、WO02/062763、 WO03/354950、WO02/085859、WO03/047579、WO04/15653、WO 07/053573、WO08/008733、WO09/106825、WO09/054004、WO 09/111061、WO/2013/000909；美国专利号7235576、7351834、7897623、 8445687；及美国专利申请号2013/0012550(各自通过引用全文并入 本文中)中描述的那些的合成和用途。

术语“舒尼替尼”(又称为SU11248或Sutent)是指N-(2-二乙基 氨基乙基)-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1H-吲哚-3-亚基)甲基]-2，4-二甲基-1H- 吡咯-3-甲酰胺，及其药学上可接受的盐，如盐、制剂、生理功能衍生 物，如众多申请，包括但不限于国际申请WO/2011/004200A1、 WO/2010/011834A2、WO/2011/128699A2、WO/2011/104555A2、 WO/2009/067686A2、WO/2009/067674A2、WO/2010/039798A2、 WO/2011/100325A2、WO/2012/088522A1、WO/2009/124037A1、 WO/2010/049449A2、WO/2009/157011A1；美国专利号6573293、 7125905、7211600；及美国专利申请公布号US20110263671、 US20100256392、US20110034703、US20130190512、US20090247767、 US20100160646、US20090062368、US20110275690、US20110092717、 US20110112164(各自通过引用全文并入本文中)中描述的那些。

术语“阿西替尼”(又称为AG013736或Inlyta)是指N-甲基 -2-[[3-[(E)-2-吡啶-2-基乙烯基]-1H-吲唑-6-基]硫烷基]苯甲酰胺，及其 药学上可接受的盐，如盐、制剂、生理功能衍生物，如众多申请，包 括但不限于国际申请WO/2013/046133A1和WO/2011/038467A1；美 国专利号6534524、7141581；及美国专利申请公布号US20090062347 和US20120244116(各自通过引用全文并入本文中)中描述的那些。

术语“凡德他尼”(又称为INN或Caprelsa)是指N-(4-溴-2-氟苯 基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺，及其药学上可 接受的盐，如盐、制剂、生理功能衍生物，如众多申请，包括但不限 于美国专利号7173038、8067427及RE42353(各自通过引用全文并 入本文中)中描述的那些。

术语“帕唑帕尼”(又称为Votrient)是指5-[[4-[(2，3-二甲基-2H- 吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺，及其药学上可 接受的盐，如盐、制剂、生理功能衍生物，如众多申请，包括但不限 于国际申请WO/2010/036796A1、WO/2012/073254A1、 WO/2011/050159A1、WO/2011/009016A1、WO/2011/085007A1、 WO/2012/103060A1、WO/2011/039648A1、WO/2011/140343A1、 WO/2013/043529A1及WO/2011/146458A1；美国专利号7105530、 7262203和8114885；以及美国专利号US20110301113、 US20120197019、US20120165354、US20110281901、US20130012531、 US20120028918及US20120232102(各自通过引用全文并入本文中) 中描述的那些。

术语“卡博替尼”(又称为Cometriq或XL184)是指N-(4-((6，7- 二甲氧基喹啉-4-基)氧基)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺，及 其药学上可接受的盐，如盐、制剂、生理功能衍生物，如众多申请， 包括但不限于美国专利7579473(通过引用全文并入本文中)中描述 的那些。

如本文所使用，术语“治疗(treating/treatment)”是指用于获得包 括临床结果在内的有益或希望的结果的方法。出于本发明的目的，有 益或希望的临床结果包括但不限于，以下一种或多种：减轻由疾病引 起的一种或多种症状的严重程度和/或频率；减小疾病的范围；使疾 病稳定(例如，防止或延迟疾病的恶化)；延迟或减慢疾病的进展； 改善疾病状态；降低治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量；和 /或提高生活质量。用本文所描述的制剂“治疗”患者包括管理个体以抑 制或引起疾病或病症的消退。

术语“有效量”是指引起希望的治疗结果的一种或多种化合物的 量。有效量可以被包含在一次或多次剂量内，即，可能需要单次剂量 或多次剂量来达到希望的治疗终点。

“治疗有效量”是指足以产生希望的治疗结果(例如，减轻疾病或 病症的严重程度)的一种或多种化合物的量。在一个实施方案中，治 疗有效量是指多激酶抑制剂的治疗有效的血浆浓度。“预防有效量”是 指当向疑似和/或可能发生疾病或病症的个体施用时，足以防止或减 轻未来疾病或病症的严重程度的包括一种或多种化合物的药物制剂 的量。

所谓“药学上可接受的”意思指这样一种物质，该物质并非生物学 上或在其它方面不合需要的，即，该物质可以并入向患者施用的药物 组合物中，而不引起任何明显不合需要的生物作用或以有害方式与该 组合物中所含的任何其它组分相互作用。当使用术语“药学上可接受 的”指药物载剂或赋形剂时，它暗示该载剂或赋形剂满足毒理学和制 造测试所需的标准或被纳入美国食品和药品管理局(U.S.Foodand Drugadministration)所制定的无效成分指南中。

术语“病症”或“疾病”在本文中可互换使用，意思指罹患该疾病的 受试者的身体状态或身体器官和/或组织之一的任何变化，由此干扰 或扰乱器官功能和/或组织功能的表现(例如，引起器官功能失调) 和/或引起症状，如不适、功能失调、痛苦或甚至死亡。

术语“受试者”、“个体”或“患者”是指一种动物，例如哺乳动物， 并且包括但不限于，人、牛科动物、马、猫科动物、犬科动物、啮齿 动物或灵长类动物。在一些实施方案中，个体是人。

如本文所使用，术语“衍生物”包括衍生物、类似物、前药及非天 然的前驱物。

术语“药学上可接受的盐”是指保持化合物的生物效用并且并非 生物学上或在其它方面不合需要的盐。

必要时，其它术语将在以下详细说明中予以定义。

癌症

本发明提供了一种用于确定受试者对一种或多种药物(如多激酶 抑制剂)的反应性或抗性的方法。在一些实施方案中，该药物被用于 治疗癌症。

在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：舌癌、口癌、咽 癌及口腔癌、食道癌、胃癌、胃肠间质瘤、小肠癌、肛门癌、肛管癌、 直肠肛管癌、肝癌、肝内胆管癌、胆囊癌、胆管癌、其它消化器官癌 症、喉癌、骨癌及关节癌症、子宫癌、子宫颈癌、子宫体癌、外阴癌、 阴道癌、睾丸癌、阴茎癌、膀胱癌、肾癌(kidneycancer)、肾癌(renal cancer)、输尿管癌及其它泌尿器官癌症、眼癌、脑癌及神经系统癌症、 CNS癌症及甲状腺癌，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有 效量的β-拉帕醌(β-lapachone)或其药学上可接受的盐与药学上可接 受的载剂的组合，其中所述β-拉帕醌或其药学上可接受的盐治疗所述 选自由以下组成的组的癌症：舌癌、口癌、咽癌及口腔癌、食道癌、 胃癌、胃肠间质瘤、小肠癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛管癌、肝癌、 肝内胆管癌、胆囊癌、胆管癌、其它消化器官癌症、喉癌、骨癌及关 节癌症、子宫癌、子宫颈癌、子宫体癌、外阴癌、阴道癌、睾丸癌、 阴茎癌、膀胱癌、肾癌(kidneycancer)、肾癌(renalcancer)、输尿 管癌及其它泌尿器官癌症、眼癌、脑癌及神经系统癌症、CNS癌症 及甲状腺癌。

在一些实施方案中，癌症是肝癌。在一些实施方案中，癌症是肝 细胞癌(HCC)、间叶组织、肉瘤、肝胚细胞瘤、胆管瘤、血管肉瘤、 血管内皮瘤、淋巴瘤或其混合。

基因标记物

本发明提供了一组基因标记物。在一些实施方案中，该组基因标 记物中的一个或多个成员可以用于确定受试者对如多激酶抑制剂等 药物的反应性或抗性。

在一些实施方案中，该多激酶抑制剂靶向血管内皮生长因子 (VEGF)介导的血管生成并降低RAF/细胞外信号调节激酶(ERK) 激酶(MEK)/ERK级联的活性或阻断该级联(参见图4)，所述多激 酶抑制剂包括但不限于，索拉非尼(例如，)、威罗非尼(例 如，)、舒尼替尼(例如，)、阿西替尼(例如)、 凡德他尼(例如)、卡博替尼(例如)、普纳替 尼(例如)、鲁索替尼(例如)、瑞格非尼(例如 )、克卓替尼(例如)、其盐、溶剂化物或生理功能 衍生物，或其混合物。

在一些实施方案中，该组基因标记物包括以下基因中的至少一 个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个：

SEC14L2：又名SEC14样2、角鲨烯、转运蛋白、TAP、上清液 蛋白因子、C22orf6、SPF、KIAA1186、KIAA1658、生育酚相关蛋白、 α-生育酚相关蛋白或HTAP，例如具有GenBankID是AL096881的核 苷酸序列，及UniProtKB是O76054的多肽序列或其功能变体、片段 或直系同源物。在一些实施方案中，SEC14L2标记物包括转录物变 体1(SEQIDNO：1)或SEC14L2同种型1(SEQIDNO：2)、其功 能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，SEC14L2标记物 包括转录物变体2(SEQIDNO：3)或SEC14L2同种型2(SEQIDNO： 4)、其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，SEC14L2 标记物博阿凯转录物变体3(SEQIDNO：5)或SEC14L2同种型3 (SEQIDNO：6)、其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方 案中，SEC14L2的活性在预定活性水平内指示，受试者对多激酶抑 制剂治疗具有反应。在一些实施方案中，受试者的SEC14L2的活性 类似于或低于预定活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反 应。在一些实施方案中，受试者的SEC14L2的活性高于预定活性水 平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗不具有反应。如本文所使用，术 语“类似”是指受试者体内基因标记物的活性与预定活性水平之间无 显著统计学差异。如本文所使用，术语“低于”或“高于”是指，受试者 体内基因标记物的活性与预定活性水平存在统计学差异，从而确定受 试者体内基因标记物的活性当与预定活性水平相比较时较低或较高。

H6PD：又称己糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖1-脱氢酶)、GDH/6PGL 内质双功能蛋白、GDH、葡萄糖1-脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖 脱氢酶、G6PDH、唾液脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、CORTRD1、 G6PD，H形式，EC1.1.1.49、EC2.7.4.3或EC3.1.1.31，例如具有 GenBankID是CAA10071.1的核苷酸序列，以及UniProtKB是O95479 的多肽序列，或其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中， H6PD标记物包括转录物变体1(SEQIDNO：7)或H6PD同种型1 (SEQIDNO：8)、其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方 案中，H6PD标记物包括转录物变体2(SEQIDNO：9)或H6PD同 种型2(SEQIDNO：10)、其功能变体、片段或直系同源物。在一些 实施方案中，H6PD的活性在预定活性水平内指示，受试者对多激酶 抑制剂治疗具有反应。在一些实施方案中，受试者的H6PD的活性类 似于或低于预定活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反 应。在一些实施方案中，受试者的H6PD的活性高于预定活性水平指 示，受试者对多激酶抑制剂治疗不具有反应。

TMEM140：又称跨膜蛋白140，例如具有GenBankID是 NM_018295.3的核苷酸序列及UniProtKB是Q9NV12的多肽序列， 或其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，TMEM140 标记物包括TMEM140转录物SEQIDNO：11或TMEM140多肽SEQ IDNO：12、其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中， TMEM140的活性在预定活性水平内指示，受试者对多激酶抑制剂治 疗具有反应。在一些实施方案中，受试者的TMEM140的活性类似于 或低于预定活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反应。在 一些实施方案中，受试者的TMEM140的活性高于预定活性水平指 示，受试者对多激酶抑制剂治疗不具有反应。

SLC2A5：又称溶质载体家族2(易化葡萄糖/果糖转运蛋白)成 员5、葡萄糖转运蛋白样蛋白5、GLUT51、溶质载体家族2、易化葡 萄糖转运蛋白成员5、小肠第5型葡萄糖转运蛋白、果糖转运蛋白、 GLUT-5，例如具有GenBankID是NM_001135585或NM_003039的 核苷酸序列，以及UniProtKB是P22732的多肽序列，或其功能变体、 片段或直系同源物。在一些实施方案中，SLC2A5标记物包括转录物 变体1(SEQIDNO：13)或SLC2A5同种型1(SEQIDNO：14)、其 功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，SLC2A5标记物 包括转录物变体2(SEQIDNO：15)或SLC2A5同种型2(SEQIDNO： 16)、其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，SLC2A5 的活性在预定活性水平内指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反 应。在一些实施方案中，受试者的SLC2A5的活性类似于或低于预定 活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反应。在一些实施方 案中，受试者的SLC2A5的活性高于预定活性水平指示，受试者对多 激酶抑制剂治疗不具有反应。

ACTA1，又称骨骼肌的肌动蛋白α1，CFTDM，ACTA，MPFD， NEM3，NEM2，ASMA，肌动蛋白，α骨骼肌，CFTD1，3型线状体 肌病，NEM1，α-肌动蛋白-1或CFTD，例如具有GenBankID是 NM_001100.3的核苷酸序列，及UniProtKB是P68133的多肽序列， 或其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，ACTA1标 记物包含ACTA1转录物SEQIDNO：17或ACTA1多肽SEQIDNO： 18、其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，ACTA1 的活性在预定活性水平内指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反 应。在一些实施方案中，受试者的ACTA1的活性类似于或低于预定 活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反应。在一些实施方 案中，受试者的ACTA1的活性高于预定活性水平指示，受试者对多 激酶抑制剂治疗不具有反应。

IRF8：又称干扰素调节因子8，干扰素共有序列结合蛋白1， ICSBP，H-ICSBP，ICSBP1，干扰素共有序列结合蛋白，或IRF-8， 例如具有GenBankID是NM_002163.2、NM_001252275.1或 NM_006798.3的核苷酸序列，及UniProtKB是Q02556的多肽序列， 或其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，IRF8标记 物包括IRF8转录物SEQIDNO：19或IRF8多肽SEQIDNO：20、其 功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，IRF-8的活性在 预定活性水平内指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反应。在一些 实施方案中，受试者的IRF8的活性类似于或低于预定活性水平指示， 受试者对多激酶抑制剂治疗具有反应。在一些实施方案中，受试者的 IRF8的活性高于预定活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗不 具有反应。

STAT2：又称信号转导蛋白及转录活化蛋白2，P113，STAT113， 干扰素α诱导的转录活化蛋白，信号转导蛋白和转录活化蛋白2，信 号转导蛋白和转录活化蛋白2，ISGF-32，例如具有GenBankID是 NM_005419.3或NM_198332.1的核苷酸序列，及UniProtKB是P52630 的多肽序列，或其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中， STAT2标记物包括转录物变体1(SEQIDNO：21)或STAT2同种型 1(SEQIDNO：22)、其功能变体、片段或直系同源物。在一些实施 方案中，STAT2标记物包括转录物变体2(SEQIDNO：23)或STAT2 同种型2(SEQIDNO：24)、其功能变体、片段或直系同源物。在一 些实施方案中，STAT2的活性在预定活性水平内指示，受试者对多激 酶抑制剂治疗具有反应。在一些实施方案中，受试者的STAT2的活 性类似于或低于预定活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有 反应。在一些实施方案中，受试者的STAT2的活性高于预定活性水 平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗不具有反应。

UGT2A1：又称UGT2A2，UDP葡糖醛酰基转移酶2家族，多肽 A1，复合位点；UDP葡糖醛酰基转移酶2家族，多肽A1；UDP糖 基转移酶2家族，多肽A1；UDP-葡糖醛酰基转移酶2A1；UDPGT2A1； UGT2A2；或EC2.4.1.17，例如具有GenBankID是NM_001252274.1、 NM_001252275.1或NM_006798.3的核苷酸序列，及UniProtKB是 Q9Y4X1的多肽序列，或其功能变体、片段或直系同源物。在一些实 施方案中，UGT2A1标记物包括转录物变体1(SEQIDNO：25)或 UGT2A1同种型1(SEQIDNO：26)、其功能变体、片段或直系同源 物。在一些实施方案中，UGT2A1标记物包括转录物变体2(SEQID NO：27)或UGT2A1同种型2(SEQIDNO：28)、其功能变体、片段 或直系同源物。在一些实施方案中，UGT2A1标记物包括转录物变体 2(SEQIDNO：29)或UGT2A1同种型2(SEQIDNO：30)、其功能 变体、片段或直系同源物。在一些实施方案中，UGT2A1的活性在预 定活性水平内指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反应。在一些实 施方案中，受试者的UGT2A1的活性类似于或低于预定活性水平指 示，受试者对多激酶抑制剂治疗具有反应。在一些实施方案中，受试 者的UGT2A1的活性高于预定活性水平指示，受试者对多激酶抑制 剂治疗不具有反应。

本发明还提供了包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、 七个、八个或更多个基因标记物在内的一组基因标记物的活性谱。在 一些实施方案中，基因标记物选自由以下组成的组：SEC14L2、H6PD、 TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2及UGT2A1，或其功 能变体、片段或直系同源物。

在一些实施方案中，尽管使用了本申请的超过一个基因标记物， 但可以基于一个或多个基因标记物的活性确定反应性。在这些情况 下，可以得出结论，受试者很可能对治疗具有反应或很可能对治疗不 具有反应。在一些实施方案中，尽管使用了本申请的超过一个基因标 记物，但就确定受试者是否对多激酶抑制剂治疗具有反应来说，每个 基因标记物的活性携带相同“重量”或决定因子。在一些实施方案中， 尽管使用了本申请的超过一个基因标记物，但就确定受试者是否对多 激酶抑制剂治疗不具有反应来说，每个基因标记物的活性携带不同 “重量”或决定因子。在一些实施方案中，该重量可以由该标记物的预 测能力决定，而该预测能力可以通过决定系数(r2)和相关p值定量。 在一些实施方案中，较高r2值和/或较低p值指示较佳的预测能力。

在一些实施方案中，尽管使用了本申请的超过一个基因标记物并 且一些基因标记物指示受试者对多激酶抑制剂治疗具有反应，而一些 基因标记物指示受试者可能对多激酶抑制剂治疗不具有反应，或基于 使用的所有基因标记物的活性没有确定结果，但可以基于所用基因标 记物或所用一小组特定基因标记物的总体活性，例如，基于指示反应 性的基因标记物的数量得出结论，受试者很可能对治疗具有反应或很 可能对治疗不具有反应。举例来说，当测试总计n个基因标记物(n＝2、 3、4或更多，等)时，如果m个基因标记物指示受试者对治疗具有 反应，而m不小于n-m，则可以得出结论，受试者可能对治疗具有反 应。如果m小于n-m，则可以得出结论，受试者可能对治疗不具有反 应。

如本文所使用，术语“活性谱”是指代表一个或多个基因标记物相 异的特征或特性的一组数据。此类特征或特性包括但不限于，转录物 丰度、转录物稳定性、转录速率、翻译速率、翻译后修饰、蛋白质丰 度、蛋白质稳定性和/或蛋白质酶促活性等。在一些实施方案中，活 性谱包含与每个基因标记物的基因表达水平相关的数据。

在一些实施方案中，提供了一组基因标记物的活性谱的集合。在 一些实施方案中，该集合包含从一组特定的受试者获得的活性谱。在 一些实施方案中，该组特定的受试者由对多激酶抑制剂具有反应的受 试者组成。在一些实施方案中，该组特定的受试者由对多激酶抑制剂 不具有反应的受试者组成。

在一些实施方案中，该集合包含在一个或多个方面统计学上均 一，例如在描述活性谱的特征和特性的一个或多个定量或半定量参数 方面统计学均一的活性谱。在一些实施方案中，这些定量参数包括但 不限于，转录物丰度、转录物稳定性、转录速率、翻译速率、翻译后 修饰、蛋白质丰度、蛋白质稳定性和/或蛋白质酶促活性等。一组活 性谱在一个或多个方面是否统计学均一可以通过本领域技术人员已 知的任何适合的统计测试和/或算法确定。

在一些实施方案中，一个或多个基因标记物的活性响应于多激酶 抑制剂而增加。在一些实施方案中，一个或多个基因标记物的活性响 应于多激酶抑制剂而降低。在一些实施方案中，一个或多个基因标记 物响应于多激酶抑制剂而保持其活性。如本文所使用，术语“基因活 性”是指基因表达水平、RNA活性水平或蛋白质活性水平。如本文所 使用，术语“RNA活性水平”是指mRNA丰度、合成速率和/或稳定性 等。如本文所使用，术语“蛋白质活性水平”是指蛋白质丰度、合成速 率、稳定性、酶促活性、磷酸化速率等。

在一些实施方案中，本发明的一个或多个基因标记物的活性谱集 合是从一项或多项测试获得的。该测试可以由受试者自身、医生、护 士、测试实验室、医疗服务人员或能够进行该测试的任何其它团体执 行。含有活性谱集合的测试结果接着可以由相同团体或由第二方，如 受试者自身、医生、护士、测试实验室、医疗服务人员、医师、临床 试验人员、医院、实验室、研究所或能够分析该测试的任何其它团体 进行分析，以确定受试者对药物是否具有反应。

不管本发明的基因标记物的活性在多激酶抑制剂治疗之后如何 变化，对于本文所描述的所有基因标记物来说，当与随机选择的患者 或对治疗不起反应的患者的平均表达水平相比较时，其表达水平在治 疗前都较低。因此，对治疗起反应的患者的表达水平可以用作参考。 当一个或多个目前描述的基因标记物的表达水平在对治疗起反应的 患者的表达水平的范围内时，指示受试者具有反应。换句话说，在多 激酶抑制剂治疗前，给定受试者的这些基因标记物的表达与对治疗起 反应的一组受试者的预定表达水平的比较可以用于预测对多激酶抑 制剂治疗起反应的可能性。作为替代方案，也可以使用对治疗不起反 应的患者的表达水平。举例来说，在多激酶抑制剂治疗前，当给定受 试者的一个或多个目前描述的基因标记物的表达水平在对治疗不起 反应的患者的表达水平的范围内时，指示受试者不具有反应性。

方法

还提供了使用本发明的该组基因标记物的方法。

在一些实施方案中，提供了用于确定受试者对药物的反应性或抗 性的方法。在一些实施方案中，多激酶抑制剂靶向血管内皮生长因子 (VEGF)介导的血管生成并降低RAF/细胞外信号调节激酶(ERK) 激酶(MEK)/ERK级联的活性或阻断该级联(参见图4)。

在一些实施方案中，该药物包含一种或多种多激酶抑制剂，如 可以靶向血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成并阻断RAF/ 细胞外信号调节激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK级联的抑制剂，包 括但不限于，索拉非尼(例如)、威罗非尼(例如)、 舒尼替尼(例如)、阿西替尼(例如)、凡德他尼(例 如)、卡博替尼(例如)、普纳替尼(例如)、 鲁索替尼(例如)、瑞格非尼(例如)、克卓替尼(例 如)、其盐、溶剂化物或生理功能衍生物，或其混合物。在 一些实施方案中，该药物是索拉非尼、阿西替尼、凡德他尼、帕唑帕 尼、卡博替尼、其盐、溶剂化物或生理功能衍生物，或其混合物。

在一些实施方案中，该药物被用于治疗与癌症相关的疾病。在一 些实施方案中，癌症是肝癌或肾癌。在一些实施方案中，肝癌是肝细 胞癌。

在一些实施方案中，所述方法包括测量从受试者收集的样本中一 组基因标记物的活性谱，该组基因标记物包括至少一个或多个选自由 以下组成的组的标记物：SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、 ACTA1、IRF8、STAT2及UGT2A1。

在一些实施方案中，所述方法另外包括将该组的活性谱与源自于 对多激酶抑制剂起反应的一组受试者的预定活性谱相比较，其中如果 该组的活性谱在预定活性谱的范围内，那么确定受试者对多激酶抑制 剂具有反应。

在一些实施方案中，所述方法另外包括将该组的活性谱与源自于 对多激酶抑制剂不起反应的一组受试者的预定活性谱相比较，其中如 果该组的活性谱在预定活性谱的范围内，那么确定受试者对多激酶抑 制剂不具有反应。

如本文所使用，术语“预定水平”、“预定活性谱”或“参考活性谱” 是指表示对多激酶抑制剂治疗具有反应的一组受试者中一个或多个 基因标记物的平均、代表性特征或特性的标准化数据或数据集。此类 特征或特性包括但不限于，转录物丰度、转录物稳定性、转录速率、 翻译速率、翻译后修饰、蛋白质丰度、蛋白质稳定性和/或蛋白质酶 促活性等。在一些实施方案中，该组特定的受试者由约5个、约10 个、约20个、约50个、约100个、约200个、约300个、约400个、 约500个、约1000个、约5000个、约10000个或更多个别受试者组 成。预定活性谱可以是在该组特定受试者都暴露于多激酶抑制剂之 前、期间或之后收集的标准化数据或数据集。在一些实施方案中，预 定活性谱是在该组特定的受试者都暴露于多激酶抑制剂之前收集的 标准化数据或数据集。(或来自细胞、肿瘤细胞的样本，

在一些实施方案中，预定活性谱是预定界限(predeterminedbar) 或阈值水平。受试者体内的本发明给定基因标记物的活性高于预定界 限或阈值活性指示该受试者对治疗不具有反应，而受试者体内的本发 明给定基因标记物活性类似或低于预定界限或阈值活性指示该受试 者对治疗具有反应。

在一些实施方案中，预定活性谱是预定范围。受试者体内的本发 明给定基因标记物的活性高于或超出该范围指示该受试者对治疗不 具有反应，而受试者体内的本发明给定基因标记物活性在该范围内或 低于该范围则指示该受试者对治疗具有反应。

应了解，除从已知对治疗具有反应的一组受试者获得预定活性 谱外，可以从已知对治疗不具有反应的受试者获得“阴性预定活性 谱”。在一些实施方案中，受试者体内的本发明给定基因标记物的活 性类似于或高于阴性预定活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗 不具有反应。在一些实施方案中，受试者体内的本发明给定基因标记 物的活性低于阴性预定活性水平指示，受试者对多激酶抑制剂治疗具 有反应。

如本文所使用，当受试者体内血管内皮生长因子(VEGF)介导 的血管生成在多激酶抑制剂作用下减少或被阻断，并且受试者体内的 RAF/细胞外信号调节激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK级联的活性减 少或被阻断时，该受试者对多激酶抑制剂具有“反应”，这可以通过本 领域技术人员已知的任何适合方法测试。在一些实施方案中，反应性 可以由多激酶抑制剂的抗肿瘤活性反映。在一些实施方案中，多激酶 抑制剂的抗肿瘤活性可以通过％ΔT/ΔC测量，其中ΔT＝治疗组中的 肿瘤体积变化，并且ΔC＝对照组中的肿瘤体积变化。在一些实施方 案中，多激酶抑制剂的抗肿瘤活性可以在从受试者、受试者的一部分 或来源于受试者的PDX收集的任何适合样本中测量。在一些实施方 案中，取决于多激酶抑制剂的类型和肿瘤的类型，当％ΔT/ΔC的预测 值小于约90％，小于约85％，小于约80％，小于约75％，小于约70％， 小于约65％，小于约60％，小于约55％，小于约50％，小于约45％， 小于约40％，小于约35％，小于约30％，小于约25％，小于约20％， 小于约15％，小于约10％，小于约5％或甚至更小时，认为受试者对 多激酶抑制剂具有反应。在一些实施方案中，当对应于一个或多个基 因标记物的活性谱的％ΔT/ΔC预测值小于约40％时，预测受试者对多 激酶抑制剂具有反应。

如本文所使用，“该组的活性谱在预定活性谱的范围内”一句是 指，所分析的活性谱类似于预定活性谱，例如，描述该活性谱的参数 接近描述该预定活性谱的参数，或在预定活性谱的变化范围内，例如， 这些参数在基于由描述该预定活性谱的参数构建的90％置信区间的 变化范围内。

该组的活性谱可以由任何适合参数描述。在一些实施方案中，该 组的活性谱由与有待评价的受试者体内表达的一个或多个基因标记 物相关的标志值描述。相应地，预定活性谱由与参考组中表达的基因 标记物相关的标志值描述。

在一些实施方案中，当从所分析的受试者收集的样本中该组基因 标记物的活性谱在基于对多激酶抑制剂治疗具有反应的一组受试者 的预定活性谱的范围内时，确定所分析的受试者对多激酶抑制剂具有 反应。

作为替代方案，当从所分析的受试者收集的样本中该组基因标记 物的活性谱在表示对多激酶抑制剂治疗不具有反应的一组受试者的 一个或多个基因标记物的平均、代表性特征或特性的标准化数据或数 据集内时，确定所分析的受试者对多激酶抑制剂不具有反应。

提供了用于向受试者施用多激酶抑制剂的方法。在一些实施方案 中，所述方法包括测试该受试者的包含至少一个或多个基因标记物在 内的一组基因标记物的活性谱。在一些实施方案中，基因标记物选自 由以下组成的组：SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、 IRF8、STAT2及UGT2A1。

在一些实施方案中，所述方法另外包括将该组的活性谱与预定活 性相比较，其中如果该组的活性谱在该预定活性谱的范围内，那么向 受试者施用多激酶抑制剂。在一些实施方案中，多激酶抑制剂靶向血 管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成并降低RAF/细胞外信号调 节激酶(ERK)激酶(MEK)/ERK级联的活性或阻断该级联(参见 图4)。

一组基因标记物的活性谱可以由本领域技术人员已知的任何适 合方法测定。在一些实施方案中，从受试者取得生物样本并进行分析。 基因活性可以是基因拷贝数、基因扩增数或启动子活性等。RNA活 性可以是mRNA丰度、合成速率和/或稳定性等。蛋白质活性可以是 蛋白质丰度、合成速率、稳定性、酶促活性、磷酸化速率、修饰、结 合活性等。在一些实施方案中，接着通常检验生物样本中如RNA、 mRNA、cDNA、cRNA、蛋白质等一种或多种基因表达产物的存在。

在一些实施方案中，直接使用来自生物样本中mRNA，通过杂交 来测定一个或多个基因的表达水平。在一些具体实施方案中，RNA 从生物样本获得。接着，使用本领域中已知的方法将RNA转化成 cDNA(互补DNA)拷贝。在一些具体实施方案中，cDNA用荧光标 记或其它可检测的标记进行标记。接着使cDNA与含有多个目标探针 的基质杂交。目标探针通常地在严格杂交条件下与基因标志的至少一 个DNA序列杂交。在某些实施方案中，该多个探针能够在杂交条件 下与源自于选自SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、 IRF8、STAT2及UGT2A1的基因标记物的序列杂交。在一些实施方 案中，条件包括在65℃下使用6×SSC(0.9MNaCl，0.09M柠檬酸 钠，pH7.4)。探针可以包括核酸。术语“核酸”涵盖具有与参考核酸类 似的结合特性并且以与参考核苷酸类似的方式代谢的合成、天然存在 及非天然存在的已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键联。这些类 似物的实例包括但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手 性膦酸甲酯、肽核酸(PNA)。

在某些情形中，探针的长度将是约15到约50个碱基对或更长。 cDNA的杂交量可以通过测定如荧光团等可检测标记的存在来测量。 可以使用杂交信号的定量来产生对一位特定患者或多位患者的基因 标志中一个特定序列或一组序列的评分。

含有在严格杂交条件下与标记物的一个或多个基因序列杂交的 多个序列的DNA阵列或微阵列包括在本发明的范围内。含有一个或 多个目标探针的基质的实例是附接到基质的多个DNA探针。在某些 实施方案中，该基质可以包含一种或多种物质，如凝胶、硝化纤维素、 尼龙、石英、玻璃、金属、基于二氧化硅的材料、二氧化硅、树脂、 聚合物等，或其组合。通常，DNA探针包含约10-50bp的连续DNA。 在某些实施方案中，DNA探针是约20至约50bp的连续DNA。在某 些实施方案中，本发明涉及包含微阵列使用指导的试剂盒。该试剂盒 可以包括容器，该容器包括一个或多个微阵列及其使用指导。

也可以使用能检测核酸的方法来分析生物样本中一个或多个基 因标记物的基因表达，所述方法包括但不限于，PCR(聚合酶链式反 应)；RT-PCT(逆转录酶-聚合酶链式反应)；定量或半定量PCR等。

在某些实施方案中，通过检测基因或DNA序列的蛋白质表达产 物来测量基因表达水平。蛋白质产物水平可以使用本领域中已知的方 法，包括使用特异性结合到特定蛋白质的抗体来测量。这些抗体，包 括多克隆抗体或单克隆抗体，可以使用本领域中已知的方法产生。这 些抗体还可以与固体基质偶联以形成抗体芯片或抗体微阵列。抗体或 蛋白质微阵列可以使用本领域中已知的方法制备。

一旦测量出基因表达水平，就计算标志值/评分。本文中描述了 如何计算标志值/评分的实施例。在一些实施方案中，以log2标度表 示的标记物基因的平均mRNA表达强度称为标志评分。接着将标志 值/评分与和预定活性谱相关的标志值相比较以预测受试者对多激酶 抑制剂治疗的反应。在一些实施方案中，通过％ΔT/ΔC预测值测量所 预测的受试者的反应，其中ΔT＝治疗组中的肿瘤体积变化，并且ΔC＝ 对照组中的肿瘤体积变化。

标志值可以由任何适合方法计算。在一些实施方案中，用预定算 法计算标志值。在一些实施方案中，基于表达水平对每个基因标记物 指定一个值。用于计算标志值的方法的非限制性实例描述于以下文献 中：Chang等人SIGNATURE：Aworkbenchforgeneexpression signatureanalysis，BMCBioinformatics2011，12：443)；Kawaguchi等人 (Geneexpressionsignature-basedprognosticriskscoreinpatientswith glioblastoma)，CancerSci.2013年6月7日[印刷版前电子版])；Cuzick 等人(PrognosticvalueofanRNAexpressionsignaturederivedfromcell cycleproliferationgenesinpatientswithprostatecancer：aretrospective study)，LancetOncol.2011年3月12日(3)：245-55.doi： 10.1016/S1470-2045(10)70295-3.)；Sánchez-Navarro(An8-gene qRT-PCR-basedgeneexpressionscorethathasprognosticvalueinearly breastcancer.)，BMCCancer.2010年6月28日；10：336.doi： 10.1186/1471-2407-10-336.)；Shi等人(ANetwork-BasedGene ExpressionSignatureInformsPrognosisandTreatmentforColorectal CancerPatients)，PLoSONE，2012，7(7)：e412)；Matsui等人 (DevelopingandValidatingContinuousGenomicSignaturesin RandomizedClinicalTrialsforPredictiveMedicine，ClinicalCancer Research，2012，2012；doi：10.1158/1078-0432.CCR-12-1206)；Lyng等 人(GeneExpressionSignaturesThatPredictOutcomeof Tamoxifen-TreatedEstrogenReceptor-Positive，High-Risk，Primary BreastCancerPatients：ADBCGStudy，PLoSONE，2013，8(1)：e54078)； 及Zhao等人(CombiningGeneSignaturesImprovesPredictionofBreast CancerSurvival，PLoSONE，2011，6(3)：e17845)，各自通过引用全文并 入本文中。

尽管不存在确定受试者是否对治疗起反应所需的绝对阈值表达 水平，但本领域技术人员应能够基于多激酶抑制剂和有待治疗的疾病 的类型确定适合的标准阈值。举例来说，在一些实施方案中，为便利 起见，当与基因标记物的标志值有关的％ΔT/ΔC预测值小于约40％ (或其它优选值)时，可以确定受试者对给定的多激酶抑制剂起反应。

在一些实施方案中，本发明的方法可以基于剂量应用。举例来说， 对于同一多激酶抑制剂的每一预定剂量，可以鉴别出一组基因标记 物，并且这些基因标记物可以用于确定特定受试者是否在该预定剂量 下对特定多激酶起反应。待施用的剂量的非限制性实例包括约0.1 μg/kg、约1μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约1mg/kg、约10mg/kg、 约50mg/kg、约100mg/kg或更多。

在一些实施方案中，本发明的方法可以基于施用方法应用。举例 来说，对于同一多激酶抑制剂的每一预定药物施用方法，可以鉴别出 一组基因标记物，并且可以使用这些基因标记物确定特定受试者在使 用预定药物施用方法情况下是否对该多激酶起反应。施用途径的非限 制性实例包括粘膜、肠、肠胃外、透皮/透粘膜及吸入。在一个实施 方案中，粘膜途径是经由鼻、口咽、眼或泌尿生殖器粘膜。在另一实 施方案中，肠途径是经口、直肠或舌下。又在另一实施方案中，肠胃 外途径是动脉内、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下及粘膜下注 射或输注中的任一种。又在另一实施方案中，透皮/透粘膜途径是局 部的。又在另一实施方案中，吸入途径是鼻内、口咽、气管内、肺内 或透肺。

在一些实施方案中，本发明的方法可以基于药物组合应用。举例 来说，对于多激酶抑制剂与非多激酶抑制剂的每一预定药物组合，或 两种或更多种多激酶抑制剂的组合，可以鉴别出一组基因标记物，并 且可以使用这些基因标记物来确定特定受试者对于包含多激酶抑制 剂在内的药物组合是否起反应。

在一些实施方案中，本发明的方法可以基于制剂应用。举例来说， 对于给定多激酶抑制剂的每一预定药物制剂，可以鉴别出一组基因标 记物，并且可以使用这些基因标记物确定特定受试者在使用预定药物 配制物情况下是否对该多激酶起反应。

本发明的基因标记物和相关方法可以用于所有适合目的。在一些 实施方案中，其被用于前瞻性临床试验。在一些实施方案中，其被用 于临床治疗/预防实践中。

还提供了发现预测性基因标记物的方法。在一些实施方案中，这 些方法包括“类II期临床试验”研究。在一些实施方案中，这些方法包 括将一种或多种药物施加到源自于受试者的细胞并测量这些细胞中 一个或多个基因的表达谱。在一些实施方案中，该研究包括使用PDX 模型。在一些实施方案中，该研究包括使用生物信息学和统计学分析。 在一些实施方案中，使用了生物信息学和统计学分析来鉴别与药物反 应或药物抗性具有高相关性的一组特定基因标记物。可能的应用包括 但不限于：a)发现用于早期临床药物候选物的生物标记物；b)适用 于选择和扩增；c)针对销售药物的生命周期管理；d)适于发现新型 的“仿造(me-too)”药物。

在一些实施方案中，索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、凡德他尼、 帕唑帕尼、卡博替尼或其它多激酶抑制剂的功效是以一组PDX模型 测量。在一些实施方案中，每一组具有多只小鼠，即，至少3、4、5、 6、7、8、9、10或更多。在一些实施方案中，包括对照组和治疗组。 对照组仅接受媒介物。治疗组接受索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、 凡德他尼、帕唑帕尼、卡博替尼或其它多激酶抑制剂。

在一些实施方案中，对于每个PDX组，都通过％ΔT/ΔC来定量 药物功效，其中ΔT是治疗组的肿瘤体积变化并且ΔC是对照组的肿 瘤体积变化。在一些实施方案中，通过微阵列、RNAseq和/或RT-PCR 来分析1、2、3、4、5、6、7、8或更多个所测试的标记物基因的mRNA 表达水平。在一些实施方案中，通过免疫测定来分析标记物的蛋白质 水平。在一些实施方案中，标志分数基于标记物基因的表达或蛋白质 水平来计算，并且其预测能力通过决定系数(r2)及相关p值定量。 在一些实施方案中，较高r2值和/或较低p值指示较佳的预测能力。 在一些实施方案中，使用了至少小于0.05的p值来认为标志具有任 何预测能力。

以下实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制性 的。本申请通篇引用的所有参考文献、专利及公布的专利申请的内容， 以及附图和序列表都通过引用并入本文中。

实施例

实施例1.大量HCC模型对索拉非尼敏感或部分敏感。

捕捉人HCC致癌机制的实验模型对于评价HCC治疗并发现预测 患者反应的生物标记物至关重要。患者来源的异种移植物(PDX)模 型反映了患者的组织病理学和遗传型态(2-7)。目前，通过将未经历治 疗的患者的肿瘤组织片段移植到免疫受损小鼠中建立了一大组 HCC-PDX模型(名为或患者化身(patientavatar))。 在类临床试验的研究中，在一组随机的HCC-HuPrime上对索拉非尼 进行测试。该研究鉴别出“反应者和非反应者”。接下来，使用微阵列 GeneChip技术对这些模型的表达进行分析。通过应用统计学分析， 鉴别出了与反应相关的特定分子标志，或称为基因表 达标志仅由数个基因组成，可以预测HCC患者对索拉非尼的反应， 并且还适用于开发在诊所中用于患者分级的伴随诊断。这一标志可以 用作治疗可能是反应者的HCC患者的指导，同时避免对不可能是反 应者的那些患者进行治疗，由此使治疗益处最大，同时使个体化处理 减到最少。

经皮下移植将从未经过治疗的亚洲HCC患者的手术移除的肿瘤 组织移植到Balb/c裸小鼠体内，建立了一大组HCCPDX模型。HCC 移植的转化率是约20％，相较于结肠直肠癌(CRC)的高转化率属于 中等(8)，并且类似于NSCLC的转化率(9，10)。值得关注的是鉴别对 索拉非尼起反应或不起反应的模型。为此，测试了一组随机选择的 21个HCCHuPrime，用索拉非尼对其进行治疗。结果证实，如由％^ΔT/_Δc 所测量的，通过每日口服50mg/kg剂量索拉非尼治疗的HCC模型中 大多数对该治疗显示出不同程度反应(图1)(表1)。21个PDX中 有13个(62％)实现有效的肿瘤生长抑制，并且％^ΔT/_Δ＜40％(p＜0.05)。 另一方面，还存在对索拉非尼具有完全或部分抗性，属于非反应者或 弱反应者的模型，包括模型LI0334和LI0050，如图1中所示。

实施例2.HCC-PDX可以根据全基因表达谱分析分成三个主要类别

HCC是具有不同类型的疾病。有关患者肿瘤样本的全基因表达 谱分析揭露，HCC可以分成三个主要亚型。近来，转录组分析利用 不同临床参数以及细胞分化将HCC分成了三个主要类别¹。这些类别 是S1(类干细胞组，存在WNT路径和TGF-β的活化)、S2(MYC 和AKT活化)及S3(肝细胞分化)。据信，HCC-PDX由于维持原始 的患者组织病理学和遗传谱而成为预测性实验模型^2，3。本研究尝试通 过说明HCC化身在分类和生物特性方面具有与患者肿瘤类似的基因 组谱来测试这一假说。

首先，如先前所描述(9，10)，对于化身试验中使用的所有所描述 的HCC-PDX进行全基因表达谱分析。使用与用于分类临床患者样本 相同的算法评估“HCC-化身”与患者肿瘤的相似之处¹。二十二个 HCC-PDX模型可以分成3组，其中S1和S2更密切相关(参见表2)。 使用由该算法得到的572个基因，通过层次聚类和主分量分析(PCA) 获得相同的分类，不过存在两个例外。结果证实，所述HCC-PDX组 可以分成与患者样本相同的三个子类¹。

使用Luk等人开发的miRNA表达标准，将所述HCCPDX组分 成两类，即14q32.2-hi和14q32.2-lo。当与通过以上描述的mRNA谱 分析所确定的S1、S2、S3子类相比较时，S1属于14q32.2-lo，而S2/3 属于14q32.2-hi(LI1025、LI1078除外)(参见表2)。

表2.通过mRNA和miRNA谱分析对HCC分类

已发现，血清AFP与肿瘤AFP-mRNA水平存在较强的正相关性， 并且还与S2/3¹和14q32.2-hi⁴关联，这与先前的报导相符¹。已发现 六个类干细胞标记物与S1¹和14q32.2-hi⁴都不相关，由此不同于Luk 等人的报导⁴。如通过对c-MET抑制剂起反应所定义，c-MET活化似 乎仅在S1中观察到，这与先前的观察结果之一⁵相符，但与其它观 察结果不符⁴。当用多激酶抑制剂索拉非尼处理所有这些模型时，各 子类之间在肿瘤反应方面似乎不存在相关性(数据未示出)。目前正 在研究相关药物对分类的反应，以便研究这一分类的效用。然而，数 据表明，是良好的代表性患者肿瘤，并因此可能成为 预测性实验模型。

实施例3.鉴别预测对索拉非尼的反应的HCC基因表达标志。

使用基于线性回归的统计学方法，利用全基因表达水平和如以上 所描述通过％ΔT/ΔC所测量的索拉非尼治疗对HCC-PDX的影响来鉴 别预测性生物标记物(即，基因标志)。根据预先设置的统计标准， 包括p值＜0.0001，所有所测试的HCC-PDX的基因表达范围＞4倍， 在线性回归分析中无异常值，可以得出由展现良好预测性的8个基因 组成的标志(例如，图1和表3)。值得注意的是，具有较多基因的 标志将产生较佳的关联和较小p值，而在临床应用中具有较低实用价 值。预先设置的标准的严格性将决定标志基因的数目。

尽管这些标志基因仅仅是使用统计分析鉴别，并没有使用生物学 知识在该分析前后进行任何过滤，但这些标志基因可以用于预测受试 者对多激酶抑制剂的反应。若干基因与葡萄糖和果糖代谢有关。两个 基因在干扰素(IFN)介导的路径中(注意：正在使用聚乙二醇干扰 素α-2b加索拉非尼在患有不可切除或转移性透明细胞肾癌的患者中 进行I期临床试验，参见ClinicalTrials.gov标识符编号：NCT00589550， 通过引用全文并入本文中)。

材料和方法

患者肿瘤样本和在免疫受损小鼠中进行的移植.在河北医科大 学第四医院伦理审查委员会(InstitutionalReviewBoardsofHebei MedicalUniversityFourthHospital)批准并获得患者的知情同意的情 况下，通过与北京克罗恩转化医学研究所(BeijingKeluoen TranslationalMedicineInstitute)和河北医科大学第四医院合作，从诊 断为HCC的患者获得新鲜手术移除的肿瘤组织。如其他团体大体描 述的，将患者肿瘤片段皮下移植入免疫受损小鼠体内。简单地说，将 肿瘤切割成3×3×3mm3的片段并且皮下接种到小鼠(Balb/c裸小鼠， 6-8周龄，雌性，BeijingHFKBioscienceCo.Ltd.，Beijing，China)的 侧腹上。每周两次使用测径器监测肿瘤生长情况。由这些患者样本建 立的肿瘤模型称为第0代或P0，对其进行连续再移植以维持肿瘤， 这些后续数代称为P1、2、3…(＜10)。当肿瘤大小达到500-700mm3 (1/2长度×宽度²)时，收集肿瘤用于下一轮移植以进行肿瘤传代并 进行药理学、组织病理学、免疫组织学、细胞及分子分析的研究。所 有程序都是在CrownBioscienceSPF机构于无菌条件下进行。涉及实 验动物的所有研究都是严格遵照美国国立卫生研究院(National InstitutesofHealth)实验动物管理和使用指南的建议进行。实验方案 获得了CrownBioscience公司动物实验伦理委员会(CrownBioscience IACUCCommittee)的批准。

抗肿瘤活性评价.当肿瘤体积达到100-150mm3时，将小鼠随 机分成平均肿瘤体积类似的两组，每组5只小鼠。对照组在分组后立 即用媒介物对照(PBS，每周腹膜内注射，持续两周)治疗；治疗组 用以下各物之一治疗：西妥昔单抗(cetuximab)(每周腹膜内注射， 持续两周，每只小鼠1mg，MerckKGaA)、厄洛替尼(erlotinib)(每 日口服，50mg/kg，NanjingAngelPharmaceuticalCo.)、克里唑替尼 (crizotinib)(每日口服，50mg/kg，Selleckchem.com)。每周两次监 测肿瘤生长情况，并且计算％ΔT/ΔC值以评估肿瘤对治疗的反应(ΔT ＝治疗组中的肿瘤体积变化并且ΔC＝对照组中的肿瘤体积变化)。

关于肿瘤的IHC分析.使用标准免疫组织化学分析 来分析来自HuPrime模型的肿瘤组织。简单地说，根据标准组织学程 序，将组织固定于10％中性缓冲福尔马林中并包埋于石蜡中。在去除 石蜡并且再水合之后，在95℃下，用pH6.0的0.01M柠檬酸钠溶液 预处理3μm厚的组织切片30分钟，随后用兔抗人单克隆pERK或 pEGFR抗体(CellSignaling，Boston，USA)染色。使用UltraVisionLP 大体积检测系统HRP聚合物(1argeVolumeDetectionSystemHRP Polymer)(即用型)试剂盒(LabVision，Fremont，CA)检测阳性染色。 使用DAB作为显色底物，并且用Gill苏木精(FisherScientific，Fair Lawn，USA)对切片进行复染色。接着，由三位研究人员依据以下标 准以不知情方式独立地对测试试样进行评分：0分，未染色；1+，极 少染色；2+，中等染色；3+，强染色。通过以低倍镜(×100)扫描 肿瘤切片来鉴别强度最大的区域，接着使用配有DP71数字照相机的 OlympusBX51显微镜系统(Olympus，Melville，NY)在高放大倍率下 (×400)拍摄图像。

HCC-PDX的表达谱分析和基因拷贝数分析.从带有肿瘤的小鼠 收集新鲜的HCCHuPrime^TM肿瘤组织，速冻并在-80℃下储存，随后 用于遗传分析和基因组分析。对于基因谱分析，使用Trizol(Invitrogen， Carlsbad，CA)，根据制造商的说明书从冷冻的组织分离出总RNA， 并使用RNeasy微型柱(Qiagen)进行纯化。在Bioanalyzer(Agilent) 上评估RNA质量。仅使用具有高质量(RIN＞8)的RNA样本，遵循 标准方案(3’IVT表达试剂盒，用户手册，Affymetrix，P/N 702646Rev.8)在AffymetrixHG-U219阵列板上进行表达谱测定。利 用RMA算法将所有样本的原始CEL数据集标准化。探针集强度表示 为经Log(2)转化的值。对于使用SNP6.0芯片进行的 SNP/CNV测定，使用基因组DNA组织和血液分离试剂盒(Genomic DNATissueandBloodIsolationKit)(Qiagen)，遵循制造商的说明书 分离并纯化基因组DNA。DNA处理和芯片杂交遵循标准Affymetrix 方案(Genome-WideHumanSNPNsp/Sty6.0UserGuide， P/N702504，Rev.4)进行。对原始CEL数据进行质量控制并过滤以 去除低检出率样本，并且通过PICNIC和/或PennCNV方法进行基因 拷贝数分析。对于一些样本，通过qPCR测定相关基因拷贝数。简单 地说，通过基于SYBRGreen的定量PCR，使用MET特异性引物(SEQ IDNO：31，MET-F：GCTGGTGGTCCTACCATACATG；SEQIDNO： 32，MET-R：CTGGCTTACAGCTAGTTTGCCA)对所述基因组DNA 进行扩增。使用哺乳动物LINE-1反转座子基因作为参照物。在 chromo4系统上，使用OpticonMonitor3软件分析q-PCR数据以生成 原始数据。接着使用ΔCT相对定量方法处理这些原始数据。ΔCT＝(靶 基因的CT值)-(参考基因的CT值)。接着将ΔCT值转换成强度值 (POWER(ΔCT，-2))。所有数据都针对具有已知MET拷贝数的样本 的数据标准化以获得相对MET拷贝数。

讨论

肝细胞癌(HCC)是一种异质性癌症。唯一获得批准的靶向疗法 是索拉非尼单药疗法或索拉非尼与化学疗法的组合。然而，截至目前， 该治疗显示出的总体益处有限。不过，作为一种多激酶抑制剂，这在 很大程度上归因于高毒性以及低总体功效，因为缺乏可以鉴别能实际 从该治疗获益的可能的反应者以及能避免不必要的毒性的可能的非 反应者的患者分级。因此，开发此类个性化治疗计划将提高总体治疗 益处。不幸的是，截至目前，索拉非尼的临床实践仍然没揭露能支持 此类个性化治疗的有效生物标记物。

HCC-PDX捕捉每一患者的原始患者疾病生理学以及潜在的遗传 多样性(2)。这些实验模型可以被用作“患者代替者或异种移植患者 (xenopatient)(12)”以在临床开发开始之前测试药物候选物。一大组 建立的HCC-PDX或HCC-PDX文库可以表示疾病的异质性和多样 性。在可得到的情况下，可以使用其来对任何给定药物执行随机化类 II期临床试验研究。如所述报导中所描述，如果全面地分析这些模型， 那么此类试验不仅通过展现反应者％来揭露治疗的总体益处，而且还 潜在地揭露与这些反应者有关的有价值的生物标记物(或分子标志)。 这些生物标记物一旦在临床上得到验证，就可以潜在地用于患者分 级。

该报导依据充分控制的实验参数并且使用一组具有完整基因注 释的随机化HCC模型，描述了一项类临床试验研究。关于 试验数据的统计学分析明确地揭露了特定基因表达标志，即， HCC-Sorafenib-HuSignature^TM)。该标志可以用于在前瞻性临床试验和 临床治疗实践中鉴别很可能对索拉非尼起反应或不起反应的患者。

一般来说，该报导中例示的HuTrial/HuSignature^TM平台被设计成 通过采用一大组基因组确定的PDX模型并使用生物信息 学和统计学分析进行“类II期临床试验”研究来发现预测性标志。该方 法的基础在于，结果使得生物信息学家和生物统计学家能够鉴别与药 物反应或药物抗性具有高相关性的特定遗传标志。所得到的标志(“训 练集(trainingset)”)可以通过用另外的模型执行更多研究， 或在前瞻性临床试验研究(“测试集”)中进行进一步确定。该平台的 潜在应用包括：a)发现用于早期临床药物候选物的生物标记物；b) 适用于选择和扩增；c)针对销售药物的生命周期管理；d)适于发现 新型的“仿造”药物。

药物开发中最重要的成本动因是在后期临床研究中的高失败率 (13)。降低药物耗损是肿瘤学领域迫切需要的，其中药物通常不是因 为毒性而是因为缺乏功效而失败。药物如曲妥珠单抗(trastuzumab)、 伊马替尼imatinib)及吉非替尼(gefitinib)的成功开发证实，迫切需 要鉴别生物标记物以便选出最可能从药物治疗获益的患者。 HuTrial/HuSignature^TM平台将是用于使药物临床开发期间的耗损减到 最少的一个极为有效的工具。

患者来源的异种移植物(PDX)被认为是模拟患者肿瘤的实验模 型，或“患者化身”。使用一组21个肝细胞癌(HCC)患者来源的异 种移植物(PDX)进行类临床试验(类II期试验)，又称患者化身试 验，以测试其对多激酶抑制剂索拉非尼的反应。通过用50mg/kg剂 量索拉非尼治疗，21个PDX中有13个(62％)实现有效的肿瘤生长 抑制，并且ΔT/ΔC＜40％(p＜0.05)。对这些PDX的基因表达谱进行 分析以揭露可能预测对索拉非尼的反应的mRNA表达标志。该标志 可以潜在地用于开发能对专利治疗或个性化治疗进行分级的伴随诊 断方法。

实施例4.鉴别和使用基因标记物

在一组HCCPDX上测量索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、凡德 他尼、帕唑帕尼及卡博替尼的功效，这些PDX各自具有多只(至少 3只)小鼠并且对照组都接受媒介物。治疗组接受索拉非尼、舒尼替 尼、阿西替尼、凡德他尼、帕唑帕尼或卡博替尼。

对于每一PDX，都通过％ΔT/ΔC来定量药物功效，其中ΔT是治 疗组的肿瘤体积变化并且ΔC是对照组的肿瘤体积变化。通过微阵列、 RNAseq和/或RT-PCR来分析2、3、4、5、6、7、8或更多标记物基 因的mRNA表达水平或蛋白质水平。在一些实施方案中，标记物包 括SEC14L2、H6PD、TMEM140、SLC2A5、ACTA1、IRF8、STAT2 和/或UGT2A1。在一些实施方案中，可以包括其它标记物。

基于标记物基因的表达或蛋白质水平来计算标志评分，并且通过 决定系数(r2)及相关p值定量其预测能力。较高r2值和/或较低p 值指示较佳的预测能力。需要至少小于0.05的p值来认为标志具有 任何预测能力。在一些实施方案中，一个或多个特定标记物尤其适用 于预测受试者对特定多激酶抑制剂的反应性。

前述仅说明了本发明的原理。应理解，本领域技术人员将能够设 计本文未明确描述或显示，但能体现本发明原理的各种安排，并且这 些安排在本发明的精神和范围内。另外，本文中阐述的所有实施例和 条件性表述主要是意图帮助读者了解发明人所提出的本发明的原理 和概念，从而促进该技术，并且应当解释为不局限于这些具体阐述的 实施例和条件。

此外，本文中阐述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实 施例的所有陈述都打算涵盖其结构和功能等效物。另外地，预期这些 等效物包括目前已知的等效物和未来将开发的等效物，即，所开发的 执行相同功能的任何成分，不管结构如何。因此，本发明的范围不打 算限于本文所显示和描述的示例性实施方案。本发明的范围和精神是 由所附权利要求书体现。

除非另作定义，否则本文所使用的所有科技术语都具有与本发明 所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本 文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料来实施或测试 本发明，但本文描述的是优选的方法和材料。本文所引用的所有公布、 专利和专利公布都是通过引用全文并入本文中用于所有目的。

本文所论述的公布只是提供其在本申请提交日期之前的公开内 容。本文的任何内容都不应解释为承认本发明无权由于先前发明而先 于这些公布。

尽管已经结合本发明的具体实施方案来描述本发明，但应理解， 能够进一步修改并且本申请意图涵盖总体上遵循本发明的原理的本 发明的任何变更、应用或改编，并包括如在本发明所属领域内的已知 或常规实践范围内并且可以应用于此前所陈述的基本特征以及在以 上所附权利要求书范围内的与本发明的那些偏离。

参考文献

1.LlovetJM，RicciS，MazzaferroV，HilgardP，GaneE，BlancJF，etal.Sorafenibin advancedhepatocellularcarcinoma.NEnglJMed.2008；359：378-90.

2.DingL，EllisMJ，LiS，LarsonDE，ChenK，WallisJW，etal.Genomeremodellingina basal-likebreastcancermetastasisandxenograft.Nature.2010；464：999-1005.

3.MarangoniE，Vincent-SalomonA，AugerN，DegeorgesA，AssayagF，deCremouxP，et al.Anewmodelofpatienttumor-derivedbreastcancerxenograftsforpreclinicalassays.Clin CancerRes.2007；13：3989-98.

4.NematiF，Sastre-GarauX，LaurentC，CouturierJ，MarianiP，DesjardinsL，etal. Establishmentandcharacterizationofapanelofhumanuvealmelanomaxenograffsderived fromprimaryand/ormetastatictumors.ClinCancerRes.2010；16：2352-62.

5.NematiF，DanielC，ArveloF，LegrierME，FrogetB，LivartowskiA，etal.Clinical relevanceofhumancancerxenograftsasatoolforpreclinicalassessment：exampleofin-vivo evaluationoftopotecan-basedchemotherapyinapanelofhumansmall-celllungcancer xenografts.AnticancerDrugs.2010；21：25-32.

6.FichtnerI，RolffJ，SoongR，HoffmannJ，HammerS，SommerA，etal.Establishmentof patient-derivednon-smallcelllungcancerxenograftsasmodelsfortheidentificationof predictivebiomarkers.ClinCancerRes.2008；14：6456-68.

7.HennesseyPT，OchsMF，MydlarzWW，HsuehW，CopeL，YuW，etal.Promoter methylationinheadandnecksquamouscellcarcinomacelllinesissignificantlydifferentthan methylationinprimarytumorsandxenografts.PLoSOne.2011；6：e20584.

8.ChenD，ShengGuo，JieCai，XiaomingSong，MengmengYang，JianyunDeng，Taiping Chen1，Jean-PierreWery1，YiyouChen1andQixiangLi.CetuximabresponseinCRCpatient- derivedxenograftsispredictedbyRASpathwayactivationratherthanKRASmutationstatus.in preparation；insubmission.

9.YangM，BaoenShan，QiaoxiaLi，XiaomingSong，JianyunDeng，JieCai，LikunZhang1， JunjieLu，ZhenjianDu，TaipingChen，Jean-PierreWery，YiyouChenandQixiangLi. Overcomingerlotinibresistancewithtailoredtreatmentregimeninpatientderivedxenografts fromAsianNSCLCpatients.IntJCancer.2012；Sep5.doi：10.1002/ijc.27813.[Epub aheadofprint].

10.YangM，JieCai，ShengGuo，XuesongHuang，JieYang，DaweiChen，JiahuaJiang， LikunZhang，XiaomingSong，TaipingChen，JeanPierreWery，YiyouChenandQixiangLi. Squamousnon-smallcelllungcancer(NSCLC-SCC)patient-derivedxenografts(PDX)from Asianpatientshavehighresponserate(RR)tocetuximabthanthosefromnon-SCCpatients. submitted.

11.LobodaA，NebozhynM，KlinghofferR，FrazierJ，ChastainM，ArthurW，etal.Agene expressionsignatureofRASpathwaydependencepredictsresponsetoPI3KandRASpathway inhibitorsandexpandsthepopulationofRASpathwayactivatedtumors.BMCMedGenomics. 2010；3：26.

12.AndreaBertottiGM，FrancescoGalimi，etal.AMolecularlyAnnotatedPlatformof Patient-DerivedXenografts(“Xenopatients”)IdentifiesHER2asanEffectiveTherapeuticTarget inCetuximab-ResistantColorectalCancer.CancerDiscovery.2011；1：508-23.

13.Paul.HowtoimproveR&DProductivity：ThePharmaceuticalIndustryGrandChallenge. NatureReviewsDrugDiscovery2010；9：203-14.

以上提到的参考文献各自通过引用并入本文中用于所有目的。