带正电荷具有肝靶向作用的新型三氧化二砷制剂的制备方法

摘要

带正电荷具有肝靶向作用的新型三氧化二砷制剂的制备方法，属于生物医药技术领域，本发明以As

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种带正电荷具有肝靶向作用的新型三 氧化二砷制剂的制备技术。

背景技术：

三氧化二砷(As₂O₃)是中药砒霜的主要有效成分，其注射液最早用于治疗急性早幼 粒细胞白血病。研究发现，三氧化二砷不仅对急性早幼粒白血病疗效显著，对实体瘤也有着 较好的抑制作用。然而As₂O₃在体内半衰期较短，给药后会被快速清除；此外高剂量的As₂O₃会带来神经麻痹、肝功能衰竭等毒副作用，限制了其在临床上的应用。

发明内容

本发明的目的在于克服抗癌药物As₂O₃在使用过程中无靶向功能，而且体内半衰期 较短的缺陷，从而制备出一种带正电荷具有肝靶向功能的新型三氧化二砷制剂。

本发明的步骤如下：

1）将As₂O₃溶于氢氧化钠水溶液中，制成As₂O₃的氢氧化钠溶液；

2）将乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于三氯甲烷中，制成乳酸-羟基乙酸的氯仿溶 液；

3）在磁力搅拌下，将As₂O₃的氢氧化钠溶液加入到乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液中，然后 冰浴超声乳化，形成W/O初乳；

4）将聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖(PLC)溶解于乳化剂水溶液中，制成含聚乙二醇/乳糖 酸-壳聚糖的乳化剂水溶液；

5）将W/O初乳与含聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖的乳化剂水溶液混合，冰浴超声乳化形成 W/O/W复乳；

6）将W/O/W复乳与低浓度的乳化剂水溶液均匀混合后，蒸发除去有机溶剂，离心收集沉 淀、去离子水洗涤，冷冻干燥得载As₂O₃纳米粒(As₂O₃-PLGA/PLCNPs)。

本发明以As₂O₃的氢氧化钠溶液为内水相，以乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液为油相，先 以油相包封内水相，形成W/O初乳。再以含聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖的乳化剂水溶液为外水 相。采用可生物降解、生物相容性良好的乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）作为包封材料，采用 双乳化-溶剂挥发法制得As₂O₃-PLGA/PLCNPs。

本发明方法制备方法简单，制备得到的纳米粒尺寸均一，形貌可控，分散性好，包 封率、载药量高，在体外可稳定释放，在体内体外都表现出良好的抗肿瘤性能，体现了一定 的肝靶向功能，使As₂O₃能够直接靶向肝癌肿瘤部位并在肿瘤部位实现药物的可控释放，提 高治疗效果。

进一步地，本发明步骤1）中，所述As₂O₃的氢氧化钠溶液中As₂O₃含量为60mg/mL。

为了提高载药纳米粒的包封率及载药量，步骤2）中，所述乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA)含量为30mg/mL。

为了提高载药纳米粒的包封率及载药量，步骤3）中，所述As₂O₃的氢氧化钠溶液和 乳酸-羟基乙酸的氯仿溶液的混合体积比为1∶20。

步骤3）中，所述超声乳化时，超声功率为300W，超声时间为90s，以促进形成均匀 的W/O初乳液。

为了使聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖成功包覆在纳米粒的表面，制备带有正电荷的载 药纳米粒，步骤4）中，所用乳化剂为泊洛沙姆；所述乳化剂水溶液中聚乙二醇/乳糖酸-壳聚 糖的浓度为1mg/mL。

步骤5）中，超声乳化时，超声功率为500W，超声时间为180s，以形成分散均匀的 W/O/W复乳液。

为了进一步分散稳定W/O/W复乳，步骤6）中，所述低浓度的乳化剂水溶液为浓度 为0.9%(w/v)的泊洛沙姆水溶液。

另外，步骤4）中，所述聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖是按以下方法合成的：将1g壳聚 糖溶解于质量分数为2%的6mL醋酸中，再加入pH为4.7的20mLTEMED·HCL缓冲溶液，然 后分别加入3.83mgEDC和2.30mgNHS，30min后加入0.16mg聚乙二醇和1.43mg乳糖酸，在 反应体系的pH值为4-6的条件下，于35℃条件下搅拌反应，取得粗产物，将粗产物置于透析 袋中透析后，经冷冻干燥，得聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖。该合成方法可一步法将聚乙二醇和 乳糖酸修饰到壳聚糖上，获得双功能壳聚糖衍生物。

附图说明

图1为PLC的合成示意图。

图2为双乳化-溶剂挥发法合成As₂O₃-PLGA/PLCNPs的示意图。

图3为PLGA、PLC、As₂O₃-PLGA/PLCNPs的红外光谱图。

图4为As₂O₃-PLGA/PLCNPs的TEM图。

图5为图4的放大图。

图6为AFS测得的As₂O₃的标准曲线。

图7为药物As₂O₃从As₂O₃-PLGA/PLCNPs中的体外缓释曲线。

图8为As₂O₃对SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用效果图。

图9为As₂O₃-PLGA/PLCNPs对SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用效果图。

图10为As₂O₃-PLGA/PLCNPs空球对SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用效果图。

图11为接受不同药物治疗后小鼠肿瘤体积变化曲线(X±SD，n=5)图。

图12为静脉注射生理盐水后肿瘤病理学检测(HE染色)照片。

图13为静脉注射As₂O₃后肿瘤病理学检测(HE染色)照片。

图14为静脉注射As₂O₃-PLGA/PLCNPs后肿瘤病理学检测(HE染色)照片。

图15为静脉注射生理盐水后肾脏器官病理学检测(HE染色)照片。

图16为静脉注射As₂O₃后肾脏器官病理学检测(HE染色)照片。

图17为静脉注射As₂O₃-PLGA/PLCNPs后肾脏器官病理学检测(HE染色)照片。

具体实施方式

一、制备As₂O₃-PLGA/PLCNPs：

1、合成聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖PEG/LA-CS(简称：PLC)：

称取1g壳聚糖(CS)溶解于6mL醋酸(2%)中，加入20mLTEMED·HCL缓冲溶液 (pH=4.7)稀释，搅拌20min，然后分别加入3.83mgEDC和2.30mgNHS，30min后加入0.16mg 聚乙二醇(mPEG)和1.43mg乳糖酸(LA)，35℃下搅拌反应36h，反应过程中严格控制pH 4-6，反应过程如图1所示。粗产物置于透析袋中透析4天，冷冻干燥即可得到聚乙二醇/乳糖 酸-壳聚糖(PLC)。

2、制备As₂O₃-PLGA/PLCNPs：

如图2所示：

(1)将As₂O₃溶于氢氧化钠质量百分数为4%的氢氧化钠水溶液中，配成As₂O₃含量为60 mg/mL的As₂O₃的氢氧化钠溶液，作为内水相。

(2)将乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于三氯甲烷中，制成PLGA浓度为30mg/mL 的PLGA氯仿溶液，作为油相。

(3)在磁力搅拌下，将内水相加入到PLGA氯仿溶液中，然后冰浴超声乳化(超声条 件：300W，90s)，形成W/O初乳。

(4)将聚乙二醇/乳糖酸-壳聚糖(PLC)溶解于9%的泊洛沙姆水溶液中(外水 相)，制得溶液中PLC浓度为1mg/mL的PLC乳化剂水溶液。

(5)将W/O初乳与PLC乳化剂水溶液混合，冰浴超声乳化(超声条件：500W，180 s)，形成W/O/W复乳。

(6)将W/O/W复乳与0.9%(w/v)泊洛沙姆水溶液均匀混合后，蒸发除去有机溶剂， 离心收集沉淀、去离子水洗涤，冷冻干燥得As₂O₃-PLGA/PLCNPs。

二、As₂O₃-PLGA/PLCNPs的表征及性质：

1、红外表征

图3为PLGA、PLC、As₂O₃-PLGA/PLCNPs的红外光谱图，在As₂O₃-PLGA/PLCNPs谱图中， 1760cm^-1处出现了PLGA中C=O(羧基)的特征吸收峰，2997cm^-1处为甲基中C-H的伸缩振动 峰，2947cm^-1处为亚甲基中C-H的伸缩振动峰，且1180cm^-1处出现C-O的伸缩振动，表明 了纳米粒中-COO-的存在；此外，3544cm^-1处出现的宽峰为PLC中O-H的伸缩振动与N-H伸缩 振动吸收峰的重叠峰，由此可以说明As₂O₃-PLGA/PLCNPs成功制备。

2、纳米粒形貌及电位

图4为As₂O₃-PLGA/PLCNPs的TEM，可以看出制备出的纳米粒呈规整球形，尺寸均一，表 面光滑无孔。通过动态光散射(DLS)对纳米粒粒径大小以及分散性进行测量。制备的As₂O₃- PLGA/PLCNPs粒径较小，在~200nm，分布均匀，分散系数(PDI)为0.197±0.008。

将图4放大后，从图5可以明显看出，纳米粒表面被一层PLC薄膜包裹，结果与红外 谱图相一致。经检测As₂O₃-PLGA/PLCNPs表面带正电荷(+28.9±0.3)mV，进一步印证了 PLC表面包裹。

3、包封率和载药量

As₂O₃的标准曲线使用原子荧光光谱仪(AFS)进行测定，绘制As₂O₃的标准曲线，如图6 所示。所得标准曲线的线性方程为：Y=8.87821X+35.3255，R²=0.997461。其中Y表示荧光强 度，X表示As₂O₃的质量浓度(ng/mL)。经计算，As₂O₃-PLGA/PLCNPs包封率为91.68%± 1.42%，载药量为72.0±1.24%。

(1)As₂O₃-PLGA/PLCNPs体外控制释放

图7为As₂O₃在As₂O₃-PLGA/PLCNPs中的体外缓释曲线，可以看出，As₂O₃-PLGA/PLCNPs 可在体外持续释放药物15天，药物累计释放率达72.83%，可实现药物的控制释放。

三、As₂O₃-PLGA/PLCNPs的抗肝肿瘤性能：

为了评估As₂O₃-PLGA/PLCNPs的抗肝肿瘤性能，分别考察了纳米粒体内、体外抗肿瘤 作用。

1、体外抗肿瘤性能

采用As₂O₃、As₂O₃-PLGA/PLCNPs和As₂O₃-PLGA/PLCNPs空球分别对SMMC-7721肝癌细 胞的抑制作用，结果如图8、9、10所示。

从图8可见：As₂O₃可以抑制SMMC-7721细胞的生长，随时间的延长及药物浓度的增 大，抑制效果增强，作用72h后药物的半抑制浓度(IC₅₀)为0.96±0.033μgAs₂O₃/ml。

从图9中可以看出，As₂O₃-PLGA/PLCNPs对SMMC-7721细胞具有明显的抑制作用，随 时间的延长及药物浓度的增大，抑制效果增强，作用72h后药物的半抑制浓度(IC₅₀)为0.47 ±0.017μgAs₂O₃/mL，低于As₂O₃溶液的IC₅₀，说明纳米粒对肝癌细胞的生长有着更强的抑 制作用。

从图10可见：当PLGA/PLCNPs空球与细胞共同培养72h后，细胞存活率高于85%， 说明载体本身无细胞毒性作用。

2、体内抗肿瘤性能

以HEPG-2细胞注射雄性Bale/c裸鼠腋区皮下建立动物肿瘤模型，考察As₂O₃-PLGA/PLC NPs体内抗肿瘤性能。图11为接受不同药物治疗后小鼠肿瘤体积变化曲线，在一个试验周期 结束后，As₂O₃-PLGA/PLCNPs组小鼠肿瘤体积为1.602±0.524mm³，远低于生理盐水(NS)模 型组(2.262±0.546mm³)，对肿瘤抑制率达34.19%。

除此之外，我们在整个治疗周期结束后通过组织病理学对处死后获得的瘤组织进 行检测进一步评价药物传输系统对肿瘤抑制作用的影响。

图12、13、14分别为接受不同药物治疗后(A:NS;B:As₂O₃;C:As₂O₃-PLGA/PLC NPs)肿瘤病理学检测(HE染色)照片。

空白对照组肿瘤细胞异型性明显，表现为细胞大，胞浆较丰富，多边形，细胞核大、 深染、核分裂像易见。肿瘤细胞弥散分布，肿瘤细胞坏死略占肿瘤组织2/4左右，多数坏死为 凝固性坏死，即肿瘤细胞坏死，细胞核消失，但细胞轮廓存留，间质有少量血管，无明显出 血。肿瘤组织与坏死部分交界处可见少量炎细胞浸润。As₂O₃及As₂O₃-PLGA/PLCNPs治疗组 肿瘤细胞形态结构基本同空白对照组，但边缘部肿瘤细胞排列呈条索状，但是As₂O₃-PLGA/ PLCNPs治疗组肿瘤坏死程度轻于空白对照组及As₂O₃对照组，说明经As₂O₃-PLGA/PLCNPs 治疗后肿瘤增长速度变慢，恶性程度降低。这些表现表明治疗组对肿瘤细胞起到了较好的 抑制作用。

为了进一步验证As₂O₃-PLGA/PLCNPs的肝肿瘤靶向性能，对实验小鼠处死后肾脏 器官的病理组织进行分析，实验结果如图15、16、17所示。空白对照组中：肾脏由皮质，髓质 和肾乳头组成，各部位结构清晰，肾小球无萎缩或增大，球囊腔清晰，肾小管上皮细胞中度 水肿变性，主要表现为细胞增大、胞浆疏松淡染，细胞轮廓欠清，腔缘不整齐。管腔内未见管 型，有脱离的颗粒样物。对于As₂O₃和As₂O₃-PLGA/PLCNPs治疗组，肾组织结构及变性细胞的 形态学改变如空白对照组，但是As₂O₃组中肾小管上皮细胞重度水肿变性，而As₂O₃-PLGA/ PLCNPs组中肾小管上皮细胞轻度水肿变性。由此可说明，As₂O₃-PLGA/PLCNPs对肝肿瘤细 胞有一定的靶向性，减少在肾脏组织的积累，降低药物对肾脏的毒副作用。

综上所述，As₂O₃-PLGA/PLCNPs对肝肿瘤部位具有一定的靶向作用，可有效提高治 疗效果，并降低对其它组织的毒副作用。