microRNA-22在毛发发育和雄激素诱导脱发中的应用

摘要

本发明揭示miR-22在毛发发育和雄激素诱导脱发中的作用机制，首次公开了miR-22在毛发发育和雄激素诱导脱发中的应用。同时，首次公开了过表达miR-22可以诱导脱毛或敲除miR-22可以拮抗雄激素引起脱发的体内研究方法，所述microRNA-22的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。

说明书

技术领域

本发明涉及microRNA的应用，具体地说，涉及microRNA-22在 毛发发育和雄激素诱导脱发中的应用。

背景技术

病理性脱发是指头发异常或过度的脱落。据统计，在人一生中 60-70％的人都会经历过度脱发的烦恼。年龄、激素、紫外线和化学刺 激等因素都会造成脱发。病理性脱发中最常见的是雄激素诱导的脱 发，称为雄激素源性脱发(AGA)。正常情况下，人85％-90％头发处 于生长期，不会脱落，只有少量处于静止期的毛发脱落下来。通常进 入静止期与新进入生长期的毛发不断处于动态平衡，故能维持正常数 量的头发。雄激素源性脱发是因为睾酮在5α-还原酶作用下形成双氢 睾酮(DHT)，双氢睾酮在一定的环境下可以诱导毛囊从生长期进入 退行期和静止期，从而抑制头部和太阳穴部位的头发生长导致脱发。 另一方面，DHT也可以促进腋毛和面毛的生长，这就是雄激素的悖论。 在头部，DHT作用于毛囊的真皮乳头，刺激TGFβ1、TGFβ2和Dkk1 表达，诱导毛囊从生长期提前进入退化期和静止期。这样，毛囊生长 期由正常的数年变为短短的数周或几天，导致毛发脱落。研究表明 AGA毛囊干细胞数量没有变化，但是活化的增殖的祖细胞数量明显减 少。干细胞的存在使治疗脱发和头发再生成为可能。雄激素受体(AR) 的多态性与AGA密切相关。然而，雄性激素源性脱发的分子机制至今 仍然没有完全揭示清楚。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是探索雄性激素 源性脱发的分子机制，发现了microRNA-22在毛发发育和雄激素诱导 脱发中的应用。

本发明的技术方案如下：

microRNA-22在毛发发育和雄激素诱导脱发中的应用，所述 microRNA-22的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

进一步地，所述应用为雄激素诱导microRNA-22过表达， microRNA-22过表达诱导毛发进入退行期而导致毛发脱落。

进一步地，所述应用为通过抑制microRNA-22表达，拮抗雄激素 DHT引起的脱发和毛发生长变慢。

本发明还提供了microRNA-22在制备雄激素诱导脱发的药物中 的应用，具体为提供一个具有潜在治疗雄激素诱导脱发的治疗靶点， 通过抑制microRNA-22表达，拮抗雄激素双氢睾酮(DHT)引起的脱 发和毛发生长变慢。

本发明利用雄激素双氢睾酮诱导脱毛小鼠模型和miR-22敲除小 鼠模型证实miR-22具有介导雄激素诱导脱发的方法，具体如下：

1)通过转基因技术获得K14-rtTA/miR-22双转基因小鼠。利用 Dox诱导miR-22过表达，发现miR-22过表达可以导致小鼠脱毛。

2)H/E染色技术显示miR-22过表达导致毛发从生长期提前进入退 化期。

3)利用免疫组化技术和BrdU追踪技术证实miR-22可以抑制毛囊 角质细胞的分化。

4)利用miR-22基因敲除小鼠，发现miR-22缺失可以延缓毛发进 入退化期。

5)在双氢睾酮诱导脱毛的小鼠模型里，miR-22缺失可以显著加 快小鼠的毛发生长。

本发明的有益效果在于：

本发明揭示miR-22在毛发发育和雄激素诱导脱发中的作用机制， 首次公开了miR-22在毛发发育和雄激素诱导脱发中的应用。同时，首 次公开了过表达miR-22可以诱导脱毛或敲除miR-22可以拮抗雄激素 引起脱发的体内研究方法。通过这种方法可以显著促进在雄激素存在 条件下的毛发生长，为治疗雄激素诱导脱发提供了新的解决方案。

附图说明

图1为本发明实施例1中real-timePCR结果图。

图2为本发明实施例2中Dox饲喂K14-rtTA/TRE-miR-22双阳小 鼠和K14-rtTA单阳小鼠在49天对小鼠进行的拍照。

图3为本发明实施例2中毛囊组织结构的显微镜拍照。

图4为本发明实施例3中毛囊组织结构的显微镜拍照。

图5为本发明实施例4中小鼠毛发生长状况拍照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1Dox在K14rt-TA/TRE-miR-22转基因小鼠皮肤组织中诱 导miR-22表达和miR-22的检测

1.利用含有2克/升Dox的水去饲喂3周龄的K14rt-TA/

TRE-miR-22双阳小鼠，同时饲喂K14rt-TA或TRE-miR-22单阳小鼠作 对照。在4周时杀死小鼠取样。

2.处死小鼠后，用去RNase酶的手术剪刀以及手术镊子取背部皮 肤组织放于经DEPC处理的1.5mL离心管中，向其中加入1mLLysis BindingBuffer，放入匀浆仪匀浆10-15min，直到组织完全裂解后，再 向上述匀浆液中添加100μLHomegenateAdditive，轻轻振荡几次，置 于冰上10min。

3.向上述混合液中添加1mL酚仿抽提液，轻轻振荡1min，10000g 离心5min，直到分层。

4.将上清液转移至2mL离心管中，向其中添加1.25倍体积的无水 乙醇，充分混匀后，室温放置。

5.将上述混合液加入到柱子中(每个柱子每次最多只能加入 700μL)，10000g离心15s，弃滤液，重复本次操作，直到滤过所有上 述混合液。

6.向柱子中添加700μLmiRNAWashSolutionI，离心15s(10， 000g)，弃去滤出液，并再次向其中加入500μLWashSolution2/3， 10000g离心15s，重复该操作一次后，空柱再次离心一次，去除残留 液体。

7.将柱子转移到2mLCollectionTube中，向其中加入50-100μL经 95℃预热的ElutionSolution，10000g离心30s，弃去柱子。使用 Nanodrop测离心管底部溶液浓度和纯度，-80℃保存待用。

8.反转录miR-22，按下列反应体系加样(15μL)，包括：引物， 3.0μL；dNTP，0.15μL；MautiscribeRTenzyme，1.0μL；10xRTBuffer 1.5μL；RNaseinhibitor，0.19μL；RNA样品，5.0μL(1-10ng)；DEPC 水，4.16μL。

反应条件：16℃，30min；42℃，30min；85℃，5min；最后保持 在4℃。

9.miR-22定量PCR，按照下列反应体系加样(20μL)，包括：TaqMan SmallRNAAssay，1.0μL；ProductfromRTReaction，1.33μL；TaqMan UniversalPCRMasterMix，10.0μL；DEPC水，7.67μL。

反应条件如下：

第一步，95℃，10min；

第二步，95℃，15s；60℃，1min；重复40次。

第三步，4℃，30min。

real-timePCR结果如图1所示，显示Dox诱导miR-22在K14-rtTA/ TRE-miR-22双阳小鼠的皮肤上显著上调25倍。

实施例2miR-22过表达诱导小鼠脱毛

1、利用含有2克/升Dox的水去饲喂1周龄的K14-rtTA/ TRE-miR-22双阳小鼠诱导miR-22表达，同时饲喂K14-rtTA或 TRE-miR-22单阳小鼠作对照。49天对小鼠进行观察和拍照。如图2所 示。结果表明，在小鼠出生后开始喂食Dox诱导， K14-rtTA/TRE-miR22双转基因小鼠在第49天出现明显的脱毛表型。

2、在小鼠出生后的第9，第17，第30，第35，第42，第46和第50 天，取小鼠后背的皮肤，固定在福尔马林里。然后，利用常见方法包 埋并制成组织切片。

3、进行H/E染色，利用显微镜观察毛囊组织结构并拍照。如图3 所示。毛囊在miR-22过表达小鼠中的组化分析：图3A显示，小鼠毛 发在第一和第二毛发周期中不同时间点的组织结构，显示miR-22过表 达可以促进毛囊提前进入退行期。图3B显示，毛囊中内根鞘分化细胞 的标记基因AE13，AE15，Gata3和Bapr1a在miR-22转基因小鼠中显 著下调。

实施例3

1、分别在第9，第18，第21和第26天取miR-22基因敲除小鼠的后 背皮肤，固定在福尔马林里。然后利用常用方法包埋并制成组织切片。

2、进行H/E染色，利用显微镜观察毛囊组织结构并拍照。如图4 所示。结果表明，毛囊在miR-22基因敲除小鼠中的组化分析，小鼠毛 发在第一毛发周期中不同时间点的组织结构，显示miR-22敲除可以延 迟毛囊进入退行期。

实施例4

1、取8-9周龄，同窝出生的miR-22敲除鼠和WT小鼠，剃去背部 毛发，然后背部皮下注射DHT，1mg/天，连续注射21天。

2、分别于DHT注射第1天和第21天，用照相机记录小鼠毛发生长 状况，如图5所示。结果表明，剃毛后背部皮下连续注射DHT21天后， WT小鼠毛发生长严重被抑制，而miR-22敲除鼠毛发生长受DHT影响 不大。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。