同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的试剂盒及多重PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的试剂盒及多重PCR检测方法，属于农业生物技术领域。本发明根据广亲和基因S5对非广亲和的差异，以及直立穗基因DEP1对非直立穗的差异，设计两基因的功能标记，通过优化PCR反应体系及程序，建立了能同步检测广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的多重PCR方法，一次PCR反应即能检测两个目标基因，较单一的PCR方法操作更加简便、高效、灵敏和经济，该方法适合广亲和和直立穗种质资源的筛选、鉴定与分子聚合育种，对提高聚合育种分子选择效率、降低成本有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的试剂盒，同时还涉及同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的多重PCR方法，属于农业生物技术领域。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，稻谷产量占粮食作物的40％左右。提高水稻产量，对保障国家粮食安全有重大的意义。中国水稻产量的提高主要有两个时期：第一个时期是20世纪50年代，兴起了矮化育种，第二个时期是20世纪70年代以来杂交水稻的广泛推广。水稻专家陈温福认为杂种优势利用与理想株型相结合的超高产育种，必将是未来水稻产量提高的突破点。

水稻有籼亚种和粳亚种，籼、粳亚种间杂交会产生很强的杂种优势，但是亲缘关系较远，F1代普遍出现育性较低的现象，给杂种优势的利用带来了极大不便。如何克服籼粳杂交稻之间的不亲和性，一直是水稻育种工作的研究重点。日本学者池桥宏发现某些水稻材料具有籼粳亚种间杂交的能力，认为这些材料含有广亲和基因，提出了广亲和理论。2008年水稻广亲和基因S5被图位克隆，正常基因S5编码天冬酰胺酶，但是籼稻和粳稻S5存在2bp碱基的差异，籼粳杂交后F1代编码的氨基酸序列发生改变，使得杂种F1不育，而广亲和品种S5翻译起始位点的上游缺失69bp碱基，下游缺失67bp碱基，这两个大片段的缺失导致该酶的功能丧失，进而不会影响籼粳杂交F1代的育性。可见，广亲和基因S5的存在为籼粳亚种间的基因交流提供了桥梁。

直立穗是水稻高产品种的理想株型之一，直立穗型水稻穗长较短、着粒密度大、叶片较直、叶夹角小、群体结构好，有利于光能利用率的提高和水稻光合产物的积累。2009年控制水稻直立穗型和穗粒数的多效基因DEP1从东北超级稻品种沈农265中图位克隆，该基因共有5个外显子和4个内含子，编码的多肽具有与磷脂乙醇酰胺结合蛋白相似的功能，由于该基因在第5外显子上缺失637bp碱基，并插入了12bp碱基，造成转录提前终止，使得水稻穗变密，枝梗数和穗粒数增加，水稻产量大幅增加。

籼粳稻杂种优势利用与直立穗理想株型相结合的超高产育种工作，要求育种工作者对包含水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的种质资源进行筛选和鉴定，但是田间表型选择周期长、精确度低，而传统单一基因分子标记选择的操作较为繁琐。公布号CN102304587A的发明专利公开了一种快速鉴定水稻直立穗的方法，包括：采用一对特异扩增水稻直立穗控制基因qpe9-1的PCR分子标记引物InDel-E5扩增水稻品种或分离群体的DNA，若扩增出732bp一条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的纯合体，若扩增出1357bp一条特征条带，说明是不含直立穗基因的纯合体，若同时扩增出732bp、1357bp两条特征条带，说明该植株是含有直立穗基因的杂合体。该方法能快速、准确地鉴定直立穗品种和单株，但是不能同时对广亲和基因和直立穗基因进行筛选鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的试剂盒。

同时，本发明再提供一种同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的多重PCR方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的试剂盒，包含广亲和基因S5的特异性引物和直立穗基因DEP1的特异性引物；

所述广亲和基因S5的特异性引物为：

S5-F：5′-GGCAATATGATATGACCAGCAC-3′，

S5-R：5′-ATGTAGCGAAGACAAAGGGAGT-3′；

所述直立穗基因DEP1的特异性引物为：

DEP1-F：5′-TTTCGGTGGATCGGGTAT-3′，

DEP1-R：5′-CGTGACACCGCTAATCGT-3′。

具体的，该试剂盒还可以包含2×EsTaqMasterMix、DNAMarker、ddH₂O等。

同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的多重PCR方法，包括以下步骤：以水稻基因组DNA为模板，利用广亲和基因S5的特异性引物和直立穗基因DEP1的特异性引物进行多重PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后，根据特征条带判定结果；

所述广亲和基因S5的特异性引物为：

S5-F：5′-GGCAATATGATATGACCAGCAC-3′，

S5-R：5′-ATGTAGCGAAGACAAAGGGAGT-3′；

所述直立穗基因DEP1的特异性引物为：

DEP1-F：5′-TTTCGGTGGATCGGGTAT-3′，

DEP1-R：5′-CGTGACACCGCTAATCGT-3′。

所述多重PCR扩增的反应体系为：2×EsTaqMasterMix10μL，250～300ng/μL水稻基因组DNA2μL，60ng/μL广亲和基因S5的特异性引物S5-F、S5-R各1μL，60ng/μL直立穗基因DEP1的特异性引物DEP1-F、DEP1-R各1μL，ddH₂O4μL，总体积20μL。

所述多重PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃延伸8min，降至10℃保存。

所述凝胶电泳的条件为：琼脂糖浓度1％(含DNAgreen)，缓冲液1×TAE溶液，电压120V，电泳时间30min；在紫外灯下观察并照相保存。

所述根据特征条带判定结果的方法为：当扩增出321bp特征条带时，判定含有广亲和基因S5；当扩增出457bp特征条带时，判定不含广亲和基因S5；当扩增出1235bp特征条带时，判定含有直立穗基因DEP1；当扩增出1860bp特征条带时，判定不含直立穗基因DEP1。

本发明的有益效果：

本发明根据广亲和基因S5对非广亲和的差异，以及直立穗基因DEP1对非直立穗的差异，设计两基因的功能标记，通过优化PCR反应体系及程序，建立了能同步检测广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的多重PCR方法，以实现对水稻广亲和和直立穗性状的同时鉴定，对提高聚合育种分子选择效率、降低成本有重要的意义。

本发明构建的基于功能标记的同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的多重PCR方法，一次PCR反应能够检测两个目标基因，较单一的PCR方法操作更加简便、高效、灵敏和经济，适合广亲和和直立穗种质资源的筛选、鉴定与分子聚合育种。

附图说明

图1为广亲和基因S5中缺失片段及引物序列所处位置的示意图；

图2为直立穗基因DEP1中缺失片段及引物序列所处位置的示意图；

图3为实施例3中49份水稻材料的凝胶电泳图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。若无特殊指明，实施例中所用技术手段均为本领域技术人员熟知，所用仪器、试剂盒水稻材料均为市售或育种常见品种。

实施例1

同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的试剂盒，包含：广亲和基因S5的特异性引物和直立穗基因DEP1的特异性引物；

广亲和基因S5的特异性引物为：

S5-F：5′-GGCAATATGATATGACCAGCAC-3′，

S5-R：5′-ATGTAGCGAAGACAAAGGGAGT-3′；

直立穗基因DEP1的特异性引物为：

DEP1-F：5′-TTTCGGTGGATCGGGTAT-3′，

DEP1-R：5′-CGTGACACCGCTAATCGT-3′。

实施例2

同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的试剂盒，包含：2×EsTaqMasterMix(由EsTaqDNAPolymerase、PCRBuffer、Mg²⁺、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成)50mL，DNAMarker2000，ddH₂O100mL，以及广亲和基因S5的特异性引物(如SEQIDNO:1～2所示)和直立穗基因DEP1的特异性引物(如SEQIDNO:3～4所示)。

实施例3

同步检测水稻广亲和基因S5和直立穗基因DEP1的多重PCR方法，包括以下步骤：

1)材料准备

待鉴定材料为河南育种常用水稻资源，包括豫农粳6号、方欣1号、新丰2号、豫粳5号、新稻19、郑稻4号、郑稻1号、郑稻19、原稻108、竹单5号、光灿1号、新丰5号、红光粳1号、郑稻11号、白香粳、方欣4号、郑粳107、郑稻5号、郑稻18、镇稻88、豫粳6号、新稻18、水晶3号、黄金晴、淮稻9号、苏秀10号、南粳5055、淮稻6号、南粳42、镇稻99、盐丰2号、盐稻11、武运粳21、津稻372、南粳9108、连粳11号、武运梗23、淮稻8号、武运粳2845、武育糯6号、武育糯16号、郑旱9号、洛稻998、郑旱2号、郑旱6号、旱稻277、旱稻297、旱稻502和新旱2号，共49份；对照材料ck1～ck4依次为广亲和基因S5对照材料02428(含有广亲和基因S5)、非广亲和对照材料日本晴(不含广亲和基因S5)、非直立穗对照材料日本晴(不含直立穗基因DEP1)、直立穗基因DEP1对照材料武运粳8(含有直立穗基因DEP1)。

2)水稻基因组DNA提取

利用水培法培养水稻幼苗至1叶1心，采用常规SLS法提取各材料叶片DNA，具体步骤如下：取适量新鲜叶片于预冷的研钵中，用液氮研磨至粉末状，然后转移至2mL离心管中，加入600μLSLS提取液(65℃预热)，65℃水浴30min，每隔5min颠倒混匀数次；然后加入400μL氯仿:异戊醇(24:1)混合液，轻柔混摇15min，12000g离心8min；再将上清液转移至另一1.5mL无菌离心管中，加入等体积预冷(-20℃)的异丙醇，混匀后于-20℃静置30min；12000g离心10min后弃上清，用无水乙醇漂洗2次，短暂离心后除去残余乙醇，晾干；最后加入100μLTE缓冲液溶解DNA，贮存于-20℃备用。

3)引物设计

广亲和基因S5-n(NCBIGeneBank登录号：EU889293)与S5-i(NCBIGeneBank登录号：EU889295)、S5-j(NCBIGeneBank登录号：EU889294)的序列差异为翻译起始点即ATG上游缺失69bp碱基、下游缺失67bp碱基(见图1，图中虚线表示缺失碱基，箭头表示引物位置；02428是广亲和基因S5-n基因型，日本晴是S5-i和S5-j基因型，以上序列都是自然界存在的，非人工合成)，这两处缺失导致基因功能的丧失。利用Primer5在缺失位点的两侧设计引物，在ATG上游缺失位点的上游500bp内设计正向引物S5-F，在ATG下游缺失位点的下游500bp内设计反向引物S5-R，引物序列为：

S5-F：5′-GGCAATATGATATGACCAGCAC-3′，

S5-R：5′-ATGTAGCGAAGACAAAGGGAGT-3′。

直立穗基因DEP1(NCBIGeneBank登录号：ACI25446)与非直立穗基因(NCBIGeneBank登录号：FJ039904)的序列差异为在第5外显子上缺失637bp碱基，并插入了12bp碱基，共625bp碱基的缺失(见图2，图中虚线表示缺失碱基，圆点表示省略的共同序列，箭头表示引物位置；武运粳8是与非直立穗对照武运粳8相同基因型，作为对照可以互换，以上序列都是自然界存在的，非人工合成)，该缺失造成转录提前终止，使得水稻穗变密，枝梗数和穗粒数增加。利用Primer5在第5外显子缺失位点的上游500bp内设计正向引物DEP1-F，在第5外显子末端下游500bp内设计反向引物DEP1-R，引物序列为：

DEP1-F：5′-TTTCGGTGGATCGGGTAT-3′，

DEP1-R：5′-CGTGACACCGCTAATCGT-3′。

上述引物S5-F/S5-R、DEP1-F/DEP1-R均由苏州金智唯生物科技有限公司，均加ddH₂O配制为60ng/μL。

4)多重PCR扩增

以步骤2)提取的水稻基因组DNA为模板，利用广亲和基因S5的特异性引物S5-F/S5-R和直立穗基因DEP1的特异性引物DEP1-F/DEP1-R进行多重PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分析后，根据特征条带判定结果；

多重PCR扩增的反应体系为：2×EsTaqMasterMix10μL，水稻基因组DNA2μL，广亲和基因S5的特异性引物S5-F、S5-R各1μL，直立穗基因DEP1的特异性引物DEP1-F、DEP1-R各1μL，ddH₂O4μL，总体积20μL；

反应程序为：95℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，35个循环；最后72℃延伸8min，降至10℃保存；

凝胶电泳的条件为：琼脂糖浓度1％(含DNAgreen)，缓冲液1×TAE溶液，电压120V，电泳时间30min；在紫外灯下观察并照相保存(见图3，图3A、3B中，M代表DNAMarker，ck1～ck4依次代表广亲和基因S5对照材料02428、非广亲和对照材料日本晴、非直立穗对照材料日本晴、直立穗基因DEP1对照材料武运粳8，1～49依次代表待鉴定材料豫农粳6号、方欣1号、新丰2号、豫粳5号、新稻19、郑稻4号、郑稻1号、郑稻19、原稻108、竹单5号、光灿1号、新丰5号、红光粳1号、郑稻11号、白香粳、方欣4号、郑粳107、郑稻5号、郑稻18、镇稻88、豫粳6号、新稻18、水晶3号、黄金晴、淮稻9号、苏秀10号、南粳5055、淮稻6号、南粳42、镇稻99、盐丰2号、盐稻11、武运粳21、津稻372、南粳9108、连粳11号、武运梗23、淮稻8号、武运粳2845、武育糯6号、武育糯16号、郑旱9号、洛稻998、郑旱2号、郑旱6号、旱稻277、旱稻297、旱稻502、新旱2号)。

5)结果判定与分析

当扩增出321bp特征条带时，判定含有广亲和基因S5；当扩增出457bp特征条带时，判定不含广亲和基因S5；当扩增出1235bp特征条带时，判定含有直立穗基因DEP1；当扩增出1860bp特征条带时，判定不含直立穗基因DEP1。从图3可以看出，广亲和基因S5对照材料02428含有广亲和基因S5，而非广亲和对照材料日本晴不含广亲和基因S5，直立穗基因DEP1对照材料武运粳8含有直立穗基因DEP1，而非直立穗对照材料日本晴不含直立穗基因DEP1；同样的，在49份鉴定材料中，与对照02428带型相同，含有广亲和基因S5的水稻品种只有淮稻6号和旱稻277，表明河南目前的水稻育种材料中含有广亲和特性的非常少；与对照武运粳8带型相同，含有直立穗基因DEP1的水稻品种有33个，表明河南目前的水稻育种材料大部分具有直立穗特性。其中，淮稻6号同时聚合了广亲和基因和直立穗基因，具有较好的育种利用价值，可作为籼粳亚种杂交育种的亲本材料。