一种生物增色剂及其在水产动物养殖中的应用

摘要

本发明公开了一种生物增色剂，其原料组成为：红法夫酵母喷干粉60-80份、红法夫酵母冻干粉8-12份、乳酸菌发酵产物8-12份、抗菌肽4-8份、石粉2-4份、谷氨酰胺0.5-1.5份。本发明还公开了该生物增色剂的制备方法和在水产动物养殖中的应用。本发明的生物增色剂以红法夫酵母为有效成分，营养价值丰富，蛋白含量高且富含多种微量元素及辅酶，还富含虾青素，并配以多种营养物质，作为水产动物养殖用增色剂，具有增色效果稳定的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物增色剂及其在水产动物养殖中的应用，属于水产动物养殖技术领域。

背景技术

随着人工养殖业的迅猛发展，环境的变迁，食物链的改变，使水产养殖动物的体色发生了不同程度的改变。在自然状态下生长的鱼虾色彩鲜艳、肉质鲜美，而在人工集约化养殖条件下，由于大量使用人工配合饲料，鱼、虾、蟹的养殖周期缩短，只能获得少量的自然水生生物，而饲料中有效色源少且成分不稳定，导致鱼、虾、蟹的体色变淡，斑点叉尾鮰“变白”、“变花”甚至“变黑”；黄桑鱼“变白”、“变黑”；黄鳝、泥鳅“发红”；鳊变成“金鱼”；鲤、鲫“变黑”、“变红”；青鱼“发白”；草鱼“金黄”等等。这些异常体色降低了养殖鱼类的商品价值，给养殖者带来了经济损失。因此，如何改善养殖水产动物的体色，使之与野生鱼虾的体色相接近，一直是水产养殖领域里重要的研究和实践课题。

水产动物能够呈现出的斑澜色彩，主要由类胡萝卜素决定，也与黑色素、鸟嘌呤等色素基团有关，但水产动物本身不能合成类胡萝卜素，因而必需从食物中摄取类胡萝卜素。着色剂按来源一般分为两种，即天然着色剂和合成着色剂。天然着色剂是指一些富含类胡萝卜素和叶黄素等黄、红、紫色的动物及其提取物，如糠虾、鳞虾等；植物及其提取物，如玉米、胡萝卜、苜薯粉、橘皮等；微生物及其提取物，如酵母、光合细菌中的红螺菌、微型藻中的杜氏藻等；螺旋藻及其提取物。在现代集约化养殖条件下，水产动物摄食天然饵料(富含类胡萝卜素)的机会越来越少，因此，在饲料中添加类胡萝卜素作为着色剂，对养殖鱼类体色进行调控，已引起研究工作者的广泛重视。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种生物增色剂及其在水产动物养殖中的应用。该生物增色剂以红法夫酵母为有效成分，营养价值丰富，蛋白含量高且富含多种微量元素及辅酶，还富含虾青素，并配以多种营养物质，作为水产动物养殖用增色剂，具有增色效果稳定的优点。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种生物增色剂，其原料组成为：

红法夫酵母喷干粉60-80份、红法夫酵母冻干粉8-12份、乳酸菌发酵产物8-12份、抗菌肽4-8份、石粉2-4份、谷氨酰胺0.5-1.5份。

优选的，该生物增色剂的原料组成为：

红法夫酵母喷干粉70份、红法夫酵母冻干粉10份、乳酸菌发酵产物10份、抗菌肽6份、石粉3份、谷氨酰胺1份。

优选的，所述红法夫酵母喷干粉和红法夫酵母冻干粉，是由红法夫酵母在酵母培养基上进行发酵培养得发酵液，将发酵液分别经喷干和冻干制备而成。

所述红法夫酵母为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC33064，具有高产虾青素功能的酵母菌株。

所述酵母培养基的原料组成为：葡萄糖1.5％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.02％、氯化钠2.0％、氯化钙0.02％、谷氨酸0.06％，均为质量百分比。本发明对酵母培养基的组成进行了优化筛选，经大量实验对比后发现，采用上述组成的酵母培养基，红法夫酵母产虾青素的量和生物量都比较高，而且还降低了生产成本。

优选的，所述乳酸菌发酵产物为戊糖片球菌PP(PediococcuspentosaceusPP)经发酵培养得到的发酵产物；戊糖片球菌PP已于2012年02月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2012029；记载在申请人的一项发明专利“一种提高动物生长性能的乳酸菌半固体发酵产品及工艺”(CN102599348B)中。上述戊糖片球菌是一种重要的有益菌，对机体具有重要的生理作用。在其生长代谢过程中能产生乳酸、细菌素等，降低肠道pH，从而抑制致病菌的生长繁殖；同时还能黏附于肠道上皮细胞，同病原微生物争夺有限的营养物质和生态位点，起到占位性保护作用等。该菌株克服了外界环境耐受能力差的弊端，作为有效的微生态制剂能够通过消化道中的低pH且具有较强的定植能力发挥其生物学功能。本发明将上述戊糖片球菌应用于生物增色剂中，可以改善水产动物的体内微生态环境，维护消化道健康。

本发明还提供该生物增色剂的制备方法，步骤为：将各组分混合均匀，即得。

该生物增色剂在水产动物养殖中作为增色用饲料添加剂的应用也是本发明的保护范围。

上述应用中，具体的应用方法为：将该生物增色剂按质量分数为1-3‰的比例添加到水产动物饲料中，30天为一个投喂周期或长期投喂。

本发明还提供一种水产动物养殖增色用饲料，是由在水产动物基础饲料中按质量分数为1-3‰添加上述生物增色剂制备而成。

本发明的有益效果：

(1)本发明的生物增色剂以红法夫酵母为有效成分，营养价值丰富，蛋白含量高且富含多种微量元素及辅酶，还富含虾青素，并配以多种营养物质，可以作为水产动物养殖用增色剂，具有增色效果稳定的优点。

(2)本发明的生物增色剂中，红法夫酵母以冻干粉和喷干粉两种形式加入，其中，冻干粉中的活菌数高，但制备成本也高；喷干粉中活菌数相对较低，但满足了营养需求同时制备成本低。综合考虑生物增色剂中的活菌数和生产成本，本发明对红法夫酵母冻干粉和喷干粉的加入量进行了优化，使生物增色剂的增色效果和制备成本之间得到了很好的平衡。

(3)本发明的生物增色剂中，对红法夫酵母的种类进行了筛选，优选保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC33064的红法夫酵母，其产虾青素的能力显著优于其他菌株。

(4)本发明的生物增色剂中所富含的虾青素可直接为水产动物所利用完成色素积累过程，直接起到增色作用，另一方面其所富含的营养物质保证了水产动物的营养需求提高了水产动物的免疫力，所添加的抗菌肽也能够起到提高机体抗病能力的作用，同时谷氨酰胺会起到维护消化道健康的作用，从营养和提高免疫的角度为水产动物创造了维护体色的最佳条件。本发明的生物增色剂从直接和间接两方面作用于水产动物体色维护，效果显著持久。

附图说明

图1：10x镜下鳞片扇区面积；

图2：40x镜下色素细胞；

图3：投喂42d后在白化彩鲫鳍条基部出现色素积累；

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：不同酵母菌株产虾青素能力比较和酵母培养基的配方优化

1材料与方法

1.1试验用菌种

粘红酵母(N)、深粘红酵母(SN)、海洋红酵母(H)、红酵母(R8)为山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院现有酵母菌。

红法夫酵母(R5)为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC33064，具有产虾青素功能的酵母菌株。

1.2不同酵母菌株产虾青素能力比较

以酵母培养基的基础配方作为发酵培养基，对不同的酵母菌株进行发酵培养，采用二甲基亚砜法测定其产虾青素的能力。

酵母培养基的基础配方：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.0％，酵母膏0.5％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.01％，氯化钠1.0％；均为质量百分比。

1.3酵母培养基的配方优化

以虾青素和生物量为评价指标，通过正交试验优化酵母培养基的配方组成。

虾青素的测定方法：二甲基亚砜法；

生物量的测定方法：将发酵液用蒸馏水离心(4000r/min，15min)洗涤三次后，105℃烘干24小时，称重，单位mg/mL。

表1正交设计配方组成

1.4破壁酶的筛选

采用复合酶法破壁与二甲基亚砜法测定的虾青素相比较，判定破壁率。

表2破壁用酶正交设计配方

2试验结果

2.1不同酵母菌的产虾青素能力

表3菌株产虾青素能力筛选

由表3可以看出，菌株编号为CICC33064的红法夫酵母(R5)的产虾青素能力明显优于其他酵母菌株。

表4生物量和虾青素产量随时间变化趋势

由表4可以看出，各酵母菌随着培养时间的延长合成虾青素的量逐步提高，但红法夫酵母(R5)合成速度明显快于其他菌株，因此将R5最终确定为用于制备生物增色剂的目标菌株。

2.2酵母培养基的配方优化结果

表5配方优化结果

由表5可知，配方5和配方7效果较好，但配方5在成本上低于配方7，因此最终确定酵母培养基的配方为配方5，即葡萄糖1.5％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.02％、氯化钠2.0％、氯化钙0.02％、谷氨酸0.06％，均为质量百分比。

2.3破壁酶的筛选结果

表6复合酶破壁结果

由表6可知，配方5的破壁率可达85％，效果较好，确定其为复合破壁酶的组方。

实施例2：生物增色剂的制备

1原料组成

由以下重量份的原料组成：

红法夫酵母喷干粉70份、红法夫酵母冻干粉10份、乳酸菌发酵产物10份、抗菌肽6份、石粉3份、谷氨酰胺1份。

其中，红法夫酵母喷干粉和红法夫酵母冻干粉，是由红法夫酵母在酵母培养基上进行发酵培养得发酵液，将发酵液分别经喷干和冻干制备而成。发酵培养和喷干、冻干操作均为现有技术中的常规技术手段。

红法夫酵母为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC33064，具有产虾青素功能的酵母菌株。

酵母培养基的原料组成为：葡萄糖1.5％、蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.02％、氯化钠2.0％、氯化钙0.02％、谷氨酸0.06％，均为质量百分比。

乳酸菌发酵产物为戊糖片球菌PP(PediococcuspentosaceusPP)经发酵培养得到的发酵产物；戊糖片球菌PP已于2012年02月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO：M2012029。

抗菌肽为山东宝来利来生物工程股份有限公司的产品，商品名称：抗菌肽CEC-38。

2制备方法

按上述重量份称取原料，混合均匀，即得。

实施例3：生物增色剂的制备

原料组成:

红法夫酵母喷干粉60份、红法夫酵母冻干粉12份、乳酸菌发酵产物8份、抗菌肽8份、石粉2份、谷氨酰胺1.5份。

制备方法同实施例2。

实施例4：生物增色剂的制备

原料组成:

红法夫酵母喷干粉80份、红法夫酵母冻干粉8份、乳酸菌发酵产物12份、抗菌肽4份、石粉4份、谷氨酰胺0.5份。

制备方法同实施例2。

实施例5：生物增色剂在水产动物养殖中的应用

1材料与方法

1.1试验动物的饲养

试验用彩鲫，平均体重(9±0.5)g，暂养于室内水族箱(0.9m×0.5m×0.5m)中，有效水体积为100L。以充分曝气除氯的自来水作为水源，水温控制在(24±1)℃，24h持续充氧；日投喂量为鱼体重的1.5％，早、中、晚定时投喂。经过14d的适应训练后将试验鱼按体重随机分为4组，分别为对照组(CK)、试验组Ⅰ(YⅠ)、试验组Ⅱ(YⅡ)、竞品组(L)，每组25尾，分别于14d、28d、42d、56d、60d采样。

1.2增色剂的添加量(YⅠ、YⅡ为本发明实施例2制备的生物增色剂的两个剂量组)

表7生物增色剂添加量(每公斤基础日粮)

注：L竞品组是化学合成虾青素的纯品。

1.3增色剂的添加方法

按表7的添加量，将增色剂用水溶解后均匀喷洒到彩鲫全价饲料当中，通风处至半干后保存至4℃冰箱。

1.4测定的指标

着色指标：皮肤、鳞片、鳍条总类胡萝卜素的测定，皮肤色度的测定，色素细胞计数；

生长指标：体重、肝体指数；

免疫性能：脾脏指数、中肾指数；

1.5指标测定方法

肝体指数：肝胰脏重/体重；

脾脏指数：脾脏重/体重；

色素细胞计数：显微镜40x下找到色素细胞，统计一个视野下色素细胞数目进行计数。

色度：采用比色卡比色，记录色度值；

虾青素的测定：二甲基亚砜法；

2试验结果

2.1着色指标

2.1.1总类胡萝卜素

鳞片、皮肤、鳍条总类胡萝卜素含量测定结果，见表8。

表8鳞片、皮肤、鳍条总类胡萝卜素含量

注：同列具有同字母表示差异不显著(P＞0.05)，具有不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

从表8中可以看出，鳞片对总类胡萝卜素的积累规律是先降低然后再小幅度上升，在14d时，试验组Ⅰ、试验组Ⅱ、竞品组与对照组均无显著差异，在60d时均显著高于对照组；皮肤对总类胡萝卜素的显著性关系出现在28d，至60d时仅添加生物增色剂组显著高于对照组；鳍条总类胡萝卜素的显著性关系也出现在28d，至60d仅添加高剂量生物增色剂组显著高于对照组。分析原因可能是前期投放到白化桶中，由于鱼类有自动的体色调节机制，类似于动物的保护色，自动贴近生活环境的颜色，致使色素积累能力下降，出现白化趋势，由于色素的长期添加情况出现转好，但是由于在42d时，时间进入11月中旬，气温开始下降，摄食减少，摄入的生物增色剂等均减少，所以色素积累有呈下降趋势。总体，从各组之间的比较来看，生物增色剂添加组效果要好于竞品组，效果稳定，竞品组添加的虾青素属于化学合成虾青素，自身虽有增色能力，但是化学合成的虾青素成分单一，且合成过程中会有一些无法去除的有害物质，长期使用会影响鱼体机能，导致色素积累效果差。

2.1.2皮肤色度及色素细胞计数

表9皮肤色度及色素细胞计数均值

从表9中可以看出，经60d投喂，试验组Ⅰ(YⅠ)、试验组Ⅱ(YⅡ)的皮肤色度均值、色素细胞均值均高于对照组；从图1、图2也可以看出色素细胞个体和色素细胞密度均高于对照组，所形成的扇区面积也大于对照组，说明本品可以促进色素细胞发育、增殖。

2.2生长指标

2.2.1体重

表10各组体重变化

从表10中可以看出，试验组Ⅰ、试验组Ⅱ、竞品组与对照组均无显著性差异，但试验组Ⅰ和试验组Ⅱ体重是持续上升的趋势，仅竞品组和对照组出现了一个拐点，说明添加生物增色剂组无论是在低剂量还是高剂量组均可较好提高体重且效果稳定，高剂量生物增色剂组效果要优于低剂量组。

2.2.2肝体指数

表11各组肝体指数变化

从表11可以看出，试验组Ⅰ、试验组Ⅱ、竞品组的肝体指数与对照组均无显著性差异，但是均呈持续上升的趋势，且生物增色剂高剂量组效果最优。

2.3免疫指标

表12各组免疫指标

从表12可以看出，试验组Ⅰ、试验组Ⅱ、竞品组与对照组均无显著性差异，添加生物增色剂组效果稍优于竞品组和对照组，竞品组出现拐点的可能原因是：人工合成虾青素含有副产物，副产物的长期使用可能会导致鱼体免疫器官受损，限制免疫器官发育。而生物增色剂自身含有的天然虾青素及营养成分可以促进免疫器官发育，起到提高机体免疫力的作用。

2.4消化指标

2.4.1肠道消化酶

表13各组肠道消化酶变化

从表13可以看出，添加生物增色剂组在60d时，蛋白酶活性显著高于对照组和竞品组，淀粉酶仅添加高剂量生物增色剂组显著高于其他各组，说明添加生物增色剂可以显著提高消化酶活性且随剂量增加效果显著。