新型隐球菌荚膜多糖GXM多克隆抗体及其制备方法

摘要

本发明提供一种针对新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体，按如下步骤制得，用灭活的新型隐球菌菌体作为免疫原免疫动物，经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体；将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质，得到新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱；将初步纯化的多克隆抗体经免疫亲和层析柱纯化后，得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。用本发明方法制备得到的多克隆抗体效价高、纯度高的特点，在医疗和科研领域应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及抗体及其制备方法，特别涉及用于针对新型隐球菌荚膜多糖葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(Glucuronoxyloma-nnan，GXM)抗原的一种多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

新型隐球菌(CrytococcusNeoformans)是对人类健康危害很大的条件致病性真菌之一，常感染免疫能力低下或免疫能力缺陷的患者，并导致隐球菌病，常因不能及时发现或误诊而延误治疗，病死率很高。

目前国际上对新型隐球菌的检测方法主要包括以下几种：印度墨汁染色法，当采用墨汁染色时，背景着色而菌体本身不着色，由此检测细菌或真菌的荚膜，该法敏感性差，阳性检出率约55％；血培养或脑脊液培养等体液培养的方法，该法为隐球菌检测的金标准，但敏感性差，阳性检出率约75％；此外，还包括新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫学检测法，用特异性针对新型隐球菌荚膜多糖抗原GXM的单克隆抗体实现对新型隐球菌的检测，检测血液和脑脊液的敏感性分别能达到87％和97％。

免疫学检测方法灵敏度和特异性都较前两种方法有明显的优势，正逐渐成为新型隐球菌检测的常用方法，利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测。例如在隐球菌性脑膜炎的早期诊断方法中，可采用乳胶凝集法(WangH，YuanX，ZhangL.Latexagglutination:Diagnosetheearlycryptococcusneoformanstestofcapsularpolysaccharideantigen[J].Pakistanjournalofpharmaceuticalsciences，2015，28(1Suppl):307-311.)、ELISA法及胶体金法等。

免疫学检测领域，制备针对新型隐球菌荚膜多糖的抗体是开发抗原检测产品的关键。现有技术CN201210011792.3公开了一种针对新型隐球菌荚膜多糖的多克隆抗体，采用GXM抗原免疫动物，免疫动物体内提取的血清经纯化分离后得到多克隆抗体。该方法直接采用GXM抗原作为免疫原，然而，由于多糖类物质结构特殊、免疫原性差、结构类似，很多为半抗原，很难像蛋白免疫原一样容易得到抗体；此外，直接采用抗原作为免疫原，由于抗原的纯度和特异性无法保证，因此得到的多克隆抗体的性质也并不稳定。

因此，制备出稳定、高效、特异性高的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原GXM的抗体是本领域技术人员需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种稳定、高效、特异性高的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原GXM的多克隆抗体及其制备方法。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体，按以下步骤制得：

(1)用灭活的新型隐球菌菌体作为免疫原免疫动物，经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体；

(2)将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质，得到新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱；

(3)步骤(1)得到的初步纯化的多克隆抗体经步骤(2)得到的免疫亲和层析柱纯化后，得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。

优选的，所述步骤(1)中，将灭活的新型隐球菌菌体进行破碎，用破碎后的新型隐球菌菌体作为免疫原；更优选的，可采用反复冻融法、超声破碎法、高速离心法、高速组织捣碎法和渗透压差法中的一种或几种进行破碎；更优选的，采用反复冻融法和/或超声破碎法进行破碎。

优选的，所述步骤(1)中，动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或多种。

优选的，所述步骤(1)中，免疫采用皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法中的一种；所述的免疫的免疫剂量依照动物的种类确定，优选为10-1000μg/只/次。

优选的，为获得较好的免疫效果，所述步骤(1)中，每隔5-9天(优选6-8天，更优选为7天)测定免疫后动物的血清效价；免疫次数优选为3-5次，例如4次。

优选的，所述步骤(1)中，分离纯化的方法包括饱和硫酸铵盐析法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、羟基磷灰石层析法、凝胶层析法等。优选的，采用饱和硫酸铵盐析法进行分离纯化。

在本发明一个具体的实施方式中，所述步骤(1)具体包括：用反复冻融法和超声破碎法将灭活的新型隐球菌菌体进行破碎，用破碎后的新型隐球菌菌体免疫动物；测定免疫后动物的血清效价，从免疫后的动物体内取血；用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，得到初步纯化的多克隆抗体。

优选的，所述步骤(2)中，所述亲和层析基质选自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠；更优选为蛋白A微珠。

优选的，所述步骤(2)中，所述新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原与亲和层析基质的比例为：每1mL亲和层析基质结合1-4mg新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原。

优选的，所述步骤(2)中，采用双功能结合剂将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质，所述双双功能结合剂选自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羟基丁二酰亚胺、乙酰基碘，优选二甲基庚二酸酯。

在本发明一个具体的实施方式中，所述步骤(2)具体包括如下步骤：

将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原溶于碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液中，并与亲和层析基质混合成匀浆，其中，每1mL蛋白A微珠结合1-4mg新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原；

用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液洗涤得到的匀浆，并离心，得到抗原与亲和层析基质的混合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积；

用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液重悬得到的抗原与亲和层析基质的混合物，向得到的混悬液中加入二甲基庚二酸酯，室温孵育20-40min，并混匀，液固分离，得到亲和层析基质-抗原交联复合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积，二甲基庚二酸酯在混悬液中的终浓度为10-30mmol/L；

用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗涤得到的亲和层析基质-抗原交联复合物；

将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物重悬于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中，室温孵育1.5-2.5h，混匀；

将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物填充入层析柱中，制得新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱。

优选的，所述步骤(3)具体包括如下步骤：

用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；

将步骤(1)初步纯化的抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体上样；

用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱；

用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；

采用分段洗脱法，连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，分别收集洗脱组分，得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。

在本发明一个具体实施方式中，所述结合缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种，优选为PBS缓冲液；所述预洗脱缓冲液为碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液选自0.1M甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为3.0。

在本发明一个具体的实施方式中，检测各洗脱组分中的多克隆抗体含量，将浓度高的多克隆抗体洗脱组分合并。此外，可用10-25倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，使所述免疫亲和层析柱再生，当加入0.01％硫柳汞时，免疫亲和层析柱可长期保存于4℃的环境中。

本发明还提供了一种抗新型隐球菌荚膜多糖抗原GXM的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)用灭活的新型隐球菌菌体作为免疫原免疫动物，经分离纯化后得到初步纯化的多克隆抗体；

(2)将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质，得到新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱；

(3)步骤(1)得到的初步纯化的多克隆抗体经步骤(2)得到的免疫亲和层析柱纯化后，得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。

优选的，所述步骤(1)中，将灭活的新型隐球菌菌体进行破碎，用破碎后的新型隐球菌菌体作为免疫原；更优选的，可采用反复冻融法、超声破碎法、高速离心法、高速组织捣碎法和渗透压差法中的一种或几种进行破碎；更优选的，采用反复冻融法和/或超声破碎法进行破碎。

优选的，所述步骤(1)中，动物选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪、驴中的一种或多种。

优选的，所述步骤(1)中，免疫采用皮下注射法、脾内注射法、静脉注射法、腹腔注射法中的一种；所述的免疫的免疫剂量依照动物的种类确定，优选为10-1000μg/只/次。

优选的，为获得较好的免疫效果，所述步骤(1)中，每隔5-9天(优选6-8天，更优选为7天)测定免疫后动物的血清效价；免疫次数优选为3-5次，例如4次。

优选的，所述步骤(1)中，分离纯化的方法包括饱和硫酸铵盐析法、辛酸沉淀法、DEAE离子交换层析法、羟基磷灰石层析法、凝胶层析法等。优选的，采用饱和硫酸铵盐析法进行分离纯化。

在本发明一个具体的实施方式中，所述步骤(1)具体包括：用反复冻融法和超声破碎法将灭活的新型隐球菌菌体进行破碎，用破碎后的新型隐球菌菌体免疫动物；测定免疫后动物的血清效价，从免疫后的动物体内取血；用饱和硫酸铵盐析法进行纯化，得到初步纯化的多克隆抗体。

优选的，所述步骤(2)中，所述亲和层析基质选自蛋白A微珠、蛋白G微珠、活性微珠；更优选为蛋白A微珠。

优选的，所述步骤(2)中，所述新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原与亲和层析基质的比例为：每1mL亲和层析基质结合1-4mg新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原。

优选的，所述步骤(2)中，采用双功能结合剂将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原交联于亲和层析基质，所述双双功能结合剂选自二甲基庚二酸酯、羰基二咪唑、溴化氰、羟基丁二酰亚胺、乙酰基碘，优选二甲基庚二酸酯。

在本发明一个具体的实施方式中，所述步骤(2)具体包括如下步骤：

将新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原溶于碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液中，并与亲和层析基质混合成匀浆，其中，每1mL亲和层析基质结合1-4mg新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原；

用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液洗涤得到的匀浆，并离心，得到抗原与亲和层析基质的混合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积；

用0.1-0.3mol/L的硼酸钠溶液重悬得到的抗原与亲和层析基质的混合物，向得到的混悬液中加入二甲基庚二酸酯，室温孵育20-40min，并混匀，液固分离，得到亲和层析基质-抗原交联复合物，其中，硼酸钠溶液pH值为8.0-9.5，用量为5-15倍亲和层析基质体积，二甲基庚二酸酯在混悬液中的终浓度为10-30mmol/L；

用0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液洗涤得到的亲和层析基质-抗原交联复合物；

将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物重悬于0.1-0.25mol/L的乙醇胺溶液中，室温孵育1.5-2.5h，混匀；

将得到的亲和层析基质-抗原交联复合物填充入层析柱中，制得新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱。

优选的，所述步骤(3)具体包括如下步骤：

用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；

将步骤(1)初步纯化的抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体上样；

用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱；

用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；

采用分段洗脱法，连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，分别收集洗脱组分，得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。

在本发明一个具体实施方式中，所述结合缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种，优选为PBS缓冲液；所述预洗脱缓冲液为碳酸盐缓冲液或醋酸-醋酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液选自0.1M甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为3.0。

在本发明一个具体的实施方式中，检测各洗脱组分中的多克隆抗体含量，将浓度高的多克隆抗体洗脱组分合并。此外，可用10-25倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱，使所述免疫亲和层析柱再生，当加入0.01％硫柳汞时，免疫亲和层析柱可长期保存于4℃的环境中。

本发明还一方面提供一种用于检测新型隐球菌的试剂盒，所述试剂盒包括如本发明所述的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原的多克隆抗体或者如本发明所述的制备方法制备得到的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原的多克隆抗体。

优选的，所述试剂盒还包括稀释剂，所述稀释剂选自生理盐水、磷酸盐缓冲液，PBS缓冲液，Tris-HCl缓冲液，硼酸盐缓冲液，琥珀酸盐缓冲液，或柠檬酸缓冲液中的一种或多种。

优选的，所述试剂盒还可包括一种或多种药学上可接受的药物载体和/或赋形剂，其在使用时通常可冻干保存。

优选的，所述试剂盒还可包括酶标试剂，显色剂，终止液，洗涤液等。

本发明采用新型隐球菌灭活菌体作为免疫原产生多克隆抗体，并采用新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原对多克隆抗体进行特异性纯化，本发明得到的多克隆抗体为国内首例使用免疫亲和层析提纯的抗新型隐球菌荚膜多糖抗原的多克隆抗体，填补了国内空白。实验证明，用本发明所述方法制得的多克隆抗体具有效价高，特异性好的特点，且多克隆抗体性质稳定，有很强的应用前景。

附图说明

图1显示了兔IgG型多克隆抗体的SDS-PAGE检测的结果。

图2显示了兔IgG型多克隆抗体的效价测定的结果。

具体实施方式

本发明中所述“新型隐球菌”(CrytococcusNeoformans)又名溶组织酵母菌(TorulaHistolytica)，是土壤，鸽类，牛乳、水果等的腐生菌，也可存在人口腔中，可侵犯人和动物，一般为外源性感染，但也可能为内源性感染，对人类而言，它通常是条件致病菌。

本发明中所述“新型隐球菌荚膜多糖葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖抗原”，“新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原”，“荚膜多糖GXM抗原”，“GXM抗原”可依照上下文语义互换使用。

本发明中所述“抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体”、“抗荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体”和“多克隆抗体”可依照上下文语义互换使用。

本发明所使用的新型隐球菌荚膜多糖抗原GXM由丹娜(天津)生物科技有限公司提供。

实施例1：初步纯化的抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原(以下简称GXM抗原)的多克隆抗体的制备

一、用反复冻融法和超声破碎法将灭活后新型隐球菌(ATCC，菌株编号：208821)进行破碎。

具体方法为：

(1)液体培养基中加入甲醛溶液，使甲醛终浓度为3.7％，于4℃放置24h灭活孢子。

(2)灭活后的新型隐球菌菌体4℃4000rpm离心10min，去上清。

(3)加入液氮用灭菌的研钵研磨破碎3-5次，加水，冰浴下使用探头式超声破碎30min。

(4)进行BCA蛋白定量和苯酚硫酸法糖定量。

二、免疫动物

(1)将破碎的灭活的新型隐球菌菌体与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.01-1mg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。

(2)免疫过程中，免疫后每隔几天采血测效价1次，免疫次数不少于3次。

(3)血清效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，-20℃保存。

三、用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化

(1)取2mL抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4mL饱和硫酸铵溶液，4℃沉淀过夜。

(2)10000g低温离心10min，弃上清，将沉淀用2mLPBS溶解，缓慢滴加1mL饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h。

(3)10000g低温离心10min，弃上清，将沉淀用1mLPBS溶解，用PBS溶液4℃透析过夜。

实施例2：新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱的制备

(1)将GXM抗原溶于碳酸盐缓冲液中，按每毫升湿的蛋白A微珠结合4mgGXM抗原，将GXM抗原和蛋白A微珠混合成为稀薄的匀浆，在总量为10mL的碳酸盐缓冲液中加入大约2mL蛋白A微珠，室温孵育1h，轻轻摇动混匀。

(2)用5-15倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH8.0-9.5)洗涤匀浆2次，每次以3000g离心2min，或10000g离心30s，得到GXM抗原-蛋白A微珠的混合物。

(3)用5-15倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH8.0-9.5)重悬GXM抗原-蛋白A微珠的混合物，留取相当于10mL湿蛋白A微珠的样品，加入足量的二甲基庚二酸酯(固体)至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol/L；室温孵育30min，使结合在蛋白A微珠上的GXM抗原与蛋白A微珠基质发生交联，并轻轻混匀，留取相当于10mL交联微珠的样品，得到GXM抗原-蛋白A微珠交联复合物。

(4)用0.1-0.25mol/L乙醇胺(pH8.0)洗涤GXM抗原-蛋白A微珠交联复合物1次以终止交联反应，然后将其重悬于0.2mol/L乙醇胺溶液中，室温孵育2h，轻轻混匀，微珠用PBS洗涤后，重悬于PBS，加入硫柳汞保存。

(5)将GXM抗原-蛋白A微珠交联复合物转入合适的层析柱中，用PBS冲洗容器，收集残留的微珠。

实施例3：抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体的免疫亲和纯化

(1)用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱。

(2)将初步纯化的抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体上样，按每毫升柱体积大约1mL/h的流速，使样品流过层析柱，用蠕动泵控制流速。

(3)用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱。

(4)用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱。

(5)采用分段洗脱法，连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每一组分。

(6)检测每管的抗体含量，将浓度高的各管合并，得到抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体。

(7)用10-25倍柱床体积的起始缓冲液流经基质，使层析柱再生，加入0.01％硫柳汞保存于4℃的环境中。

实施例4：抗新型隐球菌荚膜多糖GXM抗原的多克隆抗体的检测

1.SDS-PAGE电泳检测

对实施例3制得的多克隆抗体进行SDS-PAGE电泳，对得到的凝胶进行考马斯亮蓝染色。

(1)配制浓度8％的SDS-PAGE凝胶，制胶；

(2)每孔加10μL实施例3制得的单克隆抗体样品；

(3)60V恒压电泳10min后120V恒压电泳大约1h，至溴酚蓝条带距胶板下边缘1cm时停止电泳；

(4)考马斯亮蓝染色1h；

(5)4℃脱色过夜；

(6)拍照并观察。

实验结果见图1(pAb泳道为多克隆抗体，M泳道为蛋白Marker)。由图中可看出，在25KD和50KD分子量区有清晰明显的条带，说明抗体纯度很高。

2.效价测定

用间接ELISA法对本发明实施例3制得的多克隆抗体的抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为PBS溶液，多克隆抗体分别稀释16,000、32,000、64,000、128,000、256,000、512,000、1,024,000倍，以抗体溶液的OD值大于阴性对照OD值的2倍为阳性判定标准。检测结果见表1和图2。

表1

从检测结果可知，本发明多克隆抗体效价很高，大于1:1×10⁶。

本说明书上文中结合具体实施方式对本发明进行了阐释，但应理解，这些描述和阐释只是为了更好地理解本发明，而不构成对本发明的任何限定。本领域技术人员在阅读了本申请说明书之后可对本发明的具体实施方式进行必要的改动而不脱离本发明的精神和范围。