异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法

摘要

本发明公开了一种异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法，该法采用高效液相色谱法，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷为对照，以甲醇∶0.05％磷酸＝40～60∶50～50为流动相。实验证实，本发明的含量测定方法精密度高、重现性好、稳定性好、回收率高，测定结果准确，完善了异叶爬山虎药材的质量检测，为异叶爬山虎药材质量标准的建立奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于中药药材质量控制技术领域，尤其涉及一种异叶爬山虎药材中槲皮素3-O- β-D-葡萄糖苷的含量测定方法。

背景技术

异叶爬山虎为葡萄科爬山虎属异叶爬山虎(Parthenocissusheterophylla(BI.) Merr.)的干燥茎叶，分布于广西、安徽、浙江等地区。具有祛风除湿，通龙路、火路、 止血，解毒等功效。广西民间多用于风湿痹痛、偏头痛、风湿疮毒、骨折等病症的治疗。 目前，关于异叶爬山虎的研究，仅见异叶爬山虎果皮中红色素的研究，关于其药理活性及 化学成分、含量测定方法的研究尚未见报道。

申请人前期试验表明异叶爬山虎药材中主要含有黄酮类成分，而黄酮类化合物普遍具 有较好的抗氧化活性，采用比色法测定异叶爬山虎不同萃取部位对二苯基苦酰肼基自由基 [DPPH]的清除作用，说明其具有抗氧化活性。对异叶爬山虎抗氧化活性部位-乙酸乙酯萃 取部位的化学成分进行深入研究，采用多种色谱柱分离方法，分离得到6个化合物，分别 为豆甾-4-烯-3-酮、胡萝卜苷、芹菜素、木犀草素、槲皮素、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷。 其中，槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷具有治疗心肌缺血、缺氧的生理活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种准确、可靠、稳定的异叶爬山虎药材中槲皮素 3-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法，以确保异叶爬山虎药材的质量，保证其临床用药的 安全、有效、稳定。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D- 葡萄糖苷的含量测定方法，采用高效液相色谱法，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷为对照， 以甲醇∶0.05％磷酸＝40～60∶50～50为流动相。

色谱条件与系统适用性实验为：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.05％磷酸＝40～ 60∶50～50为流动相；流速为1～2ml·min^-1；柱温为25～40℃；检测波长为258～370nm； 理论板数应不低于3000。

色谱条件与系统适用性实验为：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.05％磷酸＝46∶54 为流动相；流速为1ml·min^-1；柱温为25℃；检测波长为258nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备按以下操作进行：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品，用 甲醇制成0.02～0.20mg·ml^-1溶液。

对照品溶液浓度为0.20mg·ml^-1。

供试品溶液的制备按以下操作进行：取异叶爬山虎药材粉末2.0g，精密称定，置具塞 锥形瓶中，加甲醇15ml，超声40min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.45μm 微孔滤膜，即得。

测定按以下操作进行：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL，注入高 效液相色谱仪，测定，即得。

测定按以下操作进行：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液 相色谱仪，测定，即得。

槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷系异叶爬山虎药材中的活性成分，为确保异叶爬山虎药材 的质量，保证其临床用药的安全、有效、稳定，发明人选定槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷作 为异叶爬山虎药材含量测定的指标，通过对异叶爬山虎药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷 的含量进行定量研究，建立了一种异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量测 定方法。该法采用高效液相色谱法，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷为对照，以甲醇∶0.05％ 磷酸＝40～60∶50～50为流动相。实验证实，本发明的含量测定方法精密度高、重现性好、 稳定性好、回收率高，测定结果准确，完善了异叶爬山虎药材的质量检测，为异叶爬山虎 药材质量标准的建立奠定了基础。

附图说明

图1是槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷对照品的高效液相色谱图。

图2是异叶爬山虎药材的高效液相色谱图。

具体实施方式

一、异叶爬山虎药材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定方法研究

1.仪器与试药

1200系列高效液相色谱仪(美国Agilent)，inersilC18色谱柱(4.6mm×250mm， 5μm)，BS110S型1/10万电子分析天平(梅特勒公司)。DFY-500粉碎机(浙江省温岭市林 大机械有限公司)，9200S超声波清洗器(上海)。

异叶爬山虎药材(采自七个不同产地)；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品(自制)， 纯度98.0％，¹³CNMR、¹HNMR、MS谱图数据与文献一致；甲醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂 为分析纯。

2.色谱条件的选择

在进行槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷色谱条件的选择时，尤其对检测波长及流动相系统 进行了选择。最后确定的色谱条件为：inersilC18(4.6＊250mm，5μm)色谱柱；甲醇∶0.05％ 磷酸(46∶54)为流动相；流速为1ml·min^-1；柱温为25℃；检测波长为258nm。

(1)检测波长的选择

对槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷进行全波长扫描，结果显示其在258nm有最大吸收，故 选择258nm为检测波长。

(2)流动相的选择

考察了不同比例乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸水为流动相对分离效果的影响。结果 表明，甲醇-0.05％磷酸(46∶54)较合适，可使样品中目标峰与杂质峰达到分离，峰型较 好，故选为流动相。

3.供试品提取条件的选择

(1)提取溶剂的选择

考察了甲醇、60％乙醇及95％乙醇作为提取溶剂，结果表明甲醇的提取效率较高。

(2)提取方法的选择

对超声提取40min，热回流提取1h，索氏提取4h，三种提取方法提取率进行比较，提 取率基本一致，考虑超声提取方法操作简便、省时，故选择超声提取。

(3)提取时间的选择

超声提取30min，40min，60min，对三者的提取率进行比较，发现30min提取率稍低， 40min与60min提取率基本一致。

最终选择供试品提取方法为加入甲醇，超声提取40min。

4.线性关系考察

分别精密吸取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液0.5ml，1.0ml，2.0ml，4.0ml， 5.0ml于5ml量瓶中，加甲醇溶液至刻度。分别进样10μl，按上述色谱条件测定峰面 积。分别重复进样3次；以对应的对照品浓度为横坐标，其峰面积平均值为纵坐标，绘制 标准曲线。得回归方程Y＝14.774X-13.525(r＝0.9999)，线性范围0.02～0.20mg·mL^-1。

5.精密度试验

精密吸取上述槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷照品溶液各10μl，连续进样6次，峰面积 的RSD为1.42％。

6.重复性实验试验

精密称取同异叶爬山虎样品共6份，按前述供试品的制备方法制备，测定槲皮素3-O- β-D-葡萄糖苷含量的RSD分别为0.56％。

7.稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液分别于0，2，4，6，8，24h进样，测定槲皮素-3-O-β-D- 葡萄糖苷含量的RSD分别为0.67％，表明供试液在24h内稳定。

8.加样回收率试验

采用加样回收法，取已知含量的样品，精密称定，分别精密加入一定量的槲皮素-3-O- β-D-葡萄糖苷，按照前述供试品的制备方法来制备供试液，按照上述测定方法进行测定， 计算回收率，结果见表1。

表1加样回收率试验(n＝6)

9.样品测定

按前述制备供试品和对照品溶液，分别进样，记录色谱图(图1和图2)，计算槲皮素 -3-O-β-D-葡萄糖苷的含量，结果见表2。

表27批药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷含量测定结果(％)

样品编号 来源产地 采集日期 峰面积 槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷 1 广西宁川县 2024-5-17 356.5 0.04 2 广西玉林1 2014-5-18 247.9 0.02 3 广西天峨县 2014-5-21 412.3 0.04 4 广西天峨县八腊乡 2014-5-21 284.7 0.02 5 广西玉林2 2014-5-1 326.2 0.02 6 广西贵港 2014-6-18 726.5 0.06 7 广西来宾 2014-2-19 1382 0.07

二、本发明含量测定方法的应用

应用例1

异叶爬山虎药材来自广西贵港市，参照本发明方法，按照《中国药典》2015版一部附 录VID高效液相色谱法测定，具体如下：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.05％磷酸＝46∶54为 流动相；流速为1ml·min-1；柱温为25℃；检测波长为258nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，用甲醇制成 0.20mg·ml^-1溶液。

供试品溶液的制备：取异叶爬山虎药材粉末(过40目)2.0g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，加甲醇15ml，超声40min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.45μm 微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

结果：本例异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量为0.06％。

应用例2

异叶爬山虎药材来自广西来宾市，参照本发明方法，按照《中国药典》2015版一部附 录VID高效液相色谱法测定，具体如下：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.05％磷酸＝48∶52为 流动相；流速为1ml·min^-1；柱温为30℃；检测波长为270nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，用甲醇制成 0.20mg·ml^-1溶液。

供试品溶液的制备：取异叶爬山虎药材粉末(过40目)2.0g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，加甲醇15ml，超声40min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.45μm 微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

结果：本例异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量为0.07％。

应用例3

异叶爬山虎药材来自广西天峨县，参照本发明方法，按照《中国药典》2015版一部附 录VID高效液相色谱法测定，具体如下：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.05％磷酸＝40∶60为 流动相；流速为1ml·min^-1；柱温为25℃；检测波长为332nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，用甲醇制成 0.20mg·ml^-1溶液。

供试品溶液的制备：取异叶爬山虎药材粉末(过40目)2.0g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，加甲醇15ml，超声40min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.45μm 微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

结果：本例异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量为0.04％。

应用例4

异叶爬山虎药材来自广西玉林市，参照本发明方法，按照《中国药典》2015版一部附 录VID高效液相色谱法测定，具体如下：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.05％磷酸＝50∶50为 流动相；流速为1ml·min^-1；柱温为30℃；检测波长为258nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，用甲醇制成 0.20mg·ml^-1溶液。

供试品溶液的制备：取异叶爬山虎药材粉末(过40目)2.0g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，加甲醇15ml，超声40min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.45μm 微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

结果：本例异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量为0.02％。

应用例5

异叶爬山虎药材来自广西宁川县，参照本发明方法，按照《中国药典》2015版一部附 录VID高效液相色谱法测定，具体如下：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇∶0.05％磷酸＝47∶53为 流动相；流速为1ml·min^-1；柱温为30℃；检测波长为270nm；理论板数应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，用甲醇制成 0.20mg·ml^-1溶液。

供试品溶液的制备：取异叶爬山虎药材粉末(过40目)2.0g，精密称定，置具塞锥形 瓶中，加甲醇15ml，超声40min，放冷，用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.45μm 微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

结果：本例异叶爬山虎药材中槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷的含量为0.04％。