引物组及其应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗传多样性分析的方法

摘要

本发明公开了一种利用一组SSR引物鉴定陆地棉种质资源的方法及核心引物组合属于分子遗传技术领域。该组引物包括陆地棉A,D亚基因组各13条染色体的186对SSR核心引物。这些引物退火温度基本一致，均匀分布在26条染色体上，条带清晰，扩增效果比较好，能有效区分不同陆地棉种质间的差异，可作为棉花种质资源鉴定，分子指纹分析的核心引物。该方法对棉花种质资源的遗传多样性分析，指纹图谱构建，品种真伪性，纯度鉴定等都具有现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及引物组及其应用、利用该引物组进行棉 花种质资源遗传多样性分析的方法。

背景技术

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平 遗传多态性的直接的反映，能稳定遗传，可反映生物的个体和群体特征。与其它几种遗传标 记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优点是：大多数分 子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎 是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自 DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。 分子标记是检测种质资源遗传多样性的有效工具,分子标记技术不仅能够检测物种内的遗 传多样性,而且可以对物种间的遗传多样性进行比较。因此利用分子标记进行检测,选育出 具有外源目标性状基因、尽可能不带或少带不利基因、且遗传达到平衡的新种质,对现代作 物改良将是十分重要的。

SSR(Simplesequencerepeat，简称SSR)也叫微卫星DNA，是建立在PCR基础上的 第二代分子标记。SSR标记的多态性主要依赖于基本单元重复次数的变异，而这种变异在生 物群体中是大量存在的。与其它标记相比，SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态 性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量大，操作简便，重复性好，因此已广泛应用于、 基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。SSR在棉花基因 组中的分布是十分广泛的。SSR分子标记技术在棉花种质资源的鉴定上具有非常广阔的应 用前景。

种质资源(germplasm)，亦称遗传资源(geneticresources)或基因资源(gene resources),它是指一切具有一定种质或基因的生物类型的总称,棉花种质资源所有的遗 传物质均存在于各个品种之中,所以我国习惯称棉花种质资源。我国国家棉花中期库目前 已搜集整理棉花种质资源8000多份，其中陆地棉有7000多份，这些宝贵的资源材料都保存 在本所的国家中期库里。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种引物组及其应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗 传多样性分析的方法。本发明利用419份有代表性的陆地棉种质资源材料，获得了186对条 带清晰，多态性高，扩增效果好的SSR引物，旨在为棉花种质资源鉴定，遗传多样性分析，品 种指纹图谱的构建等提供核心引物。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了用于陆地棉种质资源鉴定的引物组；

所述引物组由上游引物和下游引物组成，如表1所示。

本发明还提供了所述引物组在棉花种质资源鉴定中的应用。

本发明还提供了所述引物组在棉花种质资源遗传多样性分析中的应用。

本发明还提供了一种棉花种质资源遗传多样性分析的方法，包括如下步骤：

步骤1：提取获得样品的总DNA；

步骤2：以步骤1获得的总DNA为模板，以如权利要求1所述的引物组进行扩增，电泳 检测，显色，进行多态性统计分析。

在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中所述多 态性统计分析为按0，1进行统计，用Jaccard系数计算成对品种间遗传相似性，在遗传相似 系数基础上利用非加权平均UPGMA法对所有供试材料建立树状图，相似系数和聚类分析用 NTSYS2.1软件完成。

在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤2 中所述扩增的10μL反应体系包括10×PCR(含20mMMg²⁺)1μL，dNTP(10mM)0.2μL，Taq酶 (2.5U/μL)0.2μL，去离子无菌水6.1μL，上游引物(5μM)0.75μL，下游引物(5μM)0.75μL，模板 DNA(50ng/μL)1μL。

在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤2 中所述扩增的反应程序为95℃变性2min；94℃变性40s，57℃退火45s，72℃延伸60s，共30个 循环；72℃延伸7min。

在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤1 中所述提取为：取棉花叶片针叶一片，放入2mL离心管中，同时装入一粒钢珠，放在液氮里冷 冻0.5h；取出离心管放入研磨仪中研磨2次，每次30S；研磨后取出钢珠，加700ul60℃水浴预 热的提取液；60℃水浴40-60min,每10min摇动离心管；取出离心管，加入等体积的氯仿-异 戊醇混合物，氯仿与异戊醇的体积比为24：1，混合；12,000g，离心10min；取上清，置于2ml离 心管，加等体积的氯仿-异戊醇混合物，氯仿与异戊醇的体积比为24：1；混合；12,000g，离心 10min；取上清，置于2ml离心管，加0.6倍体积的异丙醇；缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀， 静置10min；倒去上清或钩出DNA到1.5ml的离心管中，用70％乙醇洗2～3次，无水乙醇洗一 次，真空干燥；加500uLTE溶解DNA，保存于-20℃冰箱备用。

在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤2 中电泳检测为：8％的聚丙烯酰胺凝胶。具体顺序为：配制凝胶，丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺 (Acr:Bis30)6.7ml，5×TBE5ml，去离子水(dH2O)13.25ml，10％AP(10％过硫酸铵350μl，四 甲基乙二胺(TEMED)11μl。安装好电泳槽玻璃，灌胶，待胶凝固后，拔下梳子，灌胶，电泳1个 小时。

在本发明的一些具体实施方案中，棉花种质资源遗传多样性分析的方法中步骤2 的染色为放在乙酸和无水乙醇及纯水配制的固定液里固定7～8min，然后用硝酸银渗透液 渗透10min；纯水水洗两次后放在含有氢氧化钠、甲醛的显色液里显色，直到胶出现棕色带 为止，最后放在含有无水碳酸钠溶液中终止。把染好的胶放在观片灯上照相，按有带记为1， 无带记为0进行统计。

本发明公开了186对棉花核心SSR引物，平均分配在24条染色体上，这些引物多态 性好，条带清晰，可以直接用于棉花品种资源的鉴定，遗传多样性分析，杂交品种的纯度鉴 定，遗传图谱的构建等。省去了通常的实验过程中SSR引物的筛选过程，提高了实验效率。

本发明利用186对SSR核心引物鉴定陆地棉种质资源的方法，实验操作简单，结果 好，能有效地区别不同来源背景的种质资源材料，是一种值得推崇的种质资源鉴定的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示24个代表材料对引物NAU3899(靠近M)和NAU4064(远离M)的筛选结果；其中， 泳道M示Marker，泳道1～24分别是材料：冀棉8号，宝山大桃，中棉所12号，无极一枝花，南丹 巴地大花，中棉所16号，秦荔514，苏远04-3，军棉1号，鲁原343，中棉所17号，宿棉9108，乍得 3号，非洲棉E-40，澳SiV2，稀絮H10，中棉所81，辽阳多毛棉，岱字棉15号，Ari3697，TM-1，渝 棉1号，J02-247，中078；

图2示引物NAU1042对419个材料中的1～96号(材料名称见表3)的扩增图；从左至 右依次为泳道M、泳道1～96；其中，泳道M示Marker，大小依次为：50bp,100bp,150bp,200bp, 250bp,300bp,350bp400bp,500bp；泳道1～96分别示1～96号材料；

图3示引物NAU1042对419个材料中的97～192号(材料名称见表3)的扩增图；从左 至右依次为泳道M、泳道1～96；其中，泳道M示Marker，大小依次为：50bp,100bp,150bp, 200bp,250bp,300bp,350bp400bp,500bp；泳道1～96分别示97～192号材料；

图4示引物NAU1042对419个材料中的193～288号(材料名称见表3)的扩增图；从左 至右依次为泳道M、泳道1～96；其中，泳道M示Marker，大小依次为：100bp,150bp,200bp, 250bp,300bp,350bp400bp,500bp；泳道1～96分别示193～288号材料；

图5示引物NAU1042对419个材料中的289～384号(材料名称见表3)的扩增图；从左 至右依次为泳道M、泳道1～96；其中，泳道M示Marker，大小依次为：100bp,150bp,200bp, 250bp,300bp,350bp400bp,500bp；泳道1～96分别示289～384号材料；

图6示引物NAU1042对419个材料中的385～419号(材料名称见表3)的扩增图；从左 至右依次为泳道M、泳道1～34；其中，泳道M示Marker，泳道1～34分别示385～419号材料；

图7示24个材料筛选引物，扩增无多态性或效果不好的引物示意图；其中，引物分 别为NAU1295，NAU1301；

图8示24个材料筛选引物，扩增无多态性或效果不好的引物示意图；其中，引物分 别为NAU3325，NAU3501；

图9示419个材料的亲缘关系聚类图。

具体实施方式

本发明公开了一种引物组及其应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗传多样性 分析的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的 是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本 发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本 发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和 应用本发明技术。

本发明提供了陆地棉种质资源鉴定的186对SSR核心引物。

作为优选，所述的186对SSR引物其序列及染色体位置信息见表1。

作为优选，所述的186对SSR引物在棉花种质资源遗传多样性中的应用。

作为优选，所述的186对SSR引物在棉花种质资源鉴定中的应用。

作为优选，所述的186对SSR引物在棉花品种指纹图谱中的应用。

作为优选，所述的186对SSR引物在棉花种质资源遗传多样性分析的方法，所述的 方法包括如下步骤：

(1)DNA提取

利用改良的CTAB法，提取样品的总DNA。

(2)引物扩增和电泳

以步骤(1)提取的DNA模板，利用所述引物组进行PCR扩增，将步骤(2)的PCR产物进 行琼脂糖凝胶电泳检测，然后银染显色，最后进行多态性统计分析。

(3)数据按0，1进行统计，用Jaccard系数计算成对品种间遗传相似性，在遗传相似 系数基础上利用非加权平均UPGMA法对所有供试材料建立树状图，相似系数和聚类分析用 NTSYS2.1软件完成。

(4)所述的引物是从CottonGen数据库中，根据引物的染色体的位置，挑选出来，然 后用419个种质资源材料中的24个代表性的品种筛选出来。

SSR引物进行棉花种质资源鉴定的方法，其特征是所述方法包括如下步骤：

DNA的提取包括如下步骤：

1.取棉花叶片针叶一片，放入2mL离心管中，同时装入一粒钢珠，放在液氮里冷冻 半个小时。

2.用漏勺取出离心管放入研磨仪中研磨2次，每次30S。

3.研磨后取出钢珠加700ul提取液(60℃水浴预热)

4.60℃水浴40-60分钟(此过程中，每10分钟摇动离心管)

5.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢混匀(翻转离心管约50次)

6.放入离心机，12,000g，离心10分钟

7.取上清，置于2ml离心管，加等体积氯仿：异戊醇(24：1)。重复5、6步骤

8.取上清，置于2ml离心管，加0.6倍体积的冰冷异丙醇

9.缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀，静置10分钟。

10.倒去上清(或钩出DNA到1.5ml的离心管中)，用70％乙醇洗2-3次，无水乙醇洗 一次，真空干燥

11.加500uLTE溶解DNA，保存于-20℃冰箱备用。

所述步骤(2)的10μlPCR反应体系：10×PCR(含20mMMg2+)1μl，dNTP(10mM)0.2μl， Taq酶(2.5U/μl)0.2μl，去离子无菌水6.1μl，F.P.(5μM)0.75μl，R.P.(5μM)0.75μl，模板DNA (50ng/μl)1μl.

所述步骤(2)的PCR反应程序：95℃变性2分钟；94℃变性40秒，57℃退火45秒，72℃ 延伸60秒，共30个循环；72℃延伸7分钟。

所述步骤(2)的电泳检测为：8％的聚丙烯酰胺凝胶。具体顺序为：配制凝胶，丙烯 酰胺∶甲叉双丙烯酰胺(Acr:Bis30)6.7ml，5×TBE5ml，去离子水(dH2O)13.25ml，10％AP (10％过硫酸铵350μl，四甲基乙二胺(TEMED)11μl。安装好电泳槽玻璃，灌胶，待胶凝固后， 拔下梳子，灌胶，电泳1个小时。

所述步骤(2)的染色过程：1：放在乙酸和无水乙醇及纯水配制的固定液里固定7-8 分钟，然后用硝酸银渗透液渗透10分钟；纯水水洗两次后放在含有氢氧化钠、甲醛的显色液 里显色，直到胶出现棕色带为止，最后放在含有无水碳酸钠溶液中终止。

把染好的胶放在观片灯上照相。

多态性统计分析：数据按0，1进行统计，用Jaccard系数计算成对品种间遗传相似 性，在遗传相似系数基础上利用非加权平均UPGMA法对所有供试材料建立树状图，相似系数 和聚类分析用NTSYS2.1软件完成。

按有带记为1,无带记为0进行统计。

本发明利用186对SSR核心引物鉴定陆地棉种质资源的方法，实验操作简单，结果 好，能有效地区别不同来源背景的种质资源材料，是一种值得推崇的种质资源鉴定的方法。

本发明公开的一种引物组及其应用、利用该引物组进行棉花种质资源遗传多样性 分析的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

从国家棉花种质中期库中根据品种来源及特征挑选419份陆地棉种质，作为实验 材料。

用24个代表性的材料筛选本实验室的7500多对SSR引物。最后得到186对条带清 晰，易于统计的多态性的SSR引物。

用上述186对引物，对419份陆地棉种质，按照如下方法进行扩增、电泳并银染。

1.取棉花叶片针叶一片，放入2mL离心管中，同时装入一粒钢珠，放在液氮里冷冻 半个小时。

2.用漏勺取出离心管放入研磨仪中研磨2次，每次30S。

3.研磨后取出钢珠加700μL提取液(60℃水浴预热)

4.60℃水浴40-60分钟(此过程中，每10分钟摇动离心管)

5.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢混匀(翻转离心管约50次)

6.放入离心机，12,000g，离心10分钟

7.取上清，置于2ml离心管，加等体积氯仿：异戊醇(24：1)。重复5、6步骤

8.取上清，置于2ml离心管，加0.6倍体积的冰冷异丙醇

9.缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀，静置10分钟。

10.倒去上清(或钩出DNA到1.5ml的离心管中)，用70％乙醇洗2-3次，无水乙醇洗 一次，真空干燥

11.加500uLTE溶解DNA，保存于-20℃冰箱备用。

所述步骤(2)的10μLPCR反应体系：10×PCR(含20mMMg2+)1μL，dNTP(10mM)0.2μL， Taq酶(2.5U/μL)0.2μL，去离子无菌水6.1μL，F.P.(5μM)0.75μL，R.P.(5μM)0.75μL，模板DNA (50ng/μL)1μL.

所述步骤(2)的PCR反应程序：95℃变性2分钟；94℃变性40秒，57℃退火45秒，72℃ 延伸60秒，共30个循环；72℃延伸7分钟。

所述步骤(2)的电泳检测为：8％的聚丙烯酰胺凝胶。具体顺序为：配制凝胶，丙烯 酰胺∶甲叉双丙烯酰胺(Acr:Bis30)6.7ml，5×TBE5ml，去离子水(dH₂O)13.25ml，10％AP (10％过硫酸铵350μL，四甲基乙二胺(TEMED)11μL。安装好电泳槽玻璃，灌胶，待胶凝固后， 拔下梳子，灌胶，电泳1个小时。

所述步骤(2)的染色过程：放在乙酸和无水乙醇及纯水配制的固定液里固定7-8分 钟，然后用硝酸银渗透液渗透10分钟；纯水水洗两次后放在含有氢氧化钠、甲醛的显色液里 显色，直到胶出现棕色带为止，最后放在含有无水碳酸钠溶液中终止。

把染好的胶放在观片灯上照相。

多态性统计分析：数据按0，1进行统计，用Jaccard系数计算成对品种间遗传相似 性，在遗传相似系数基础上利用非加权平均UPGMA法对所有供试材料建立树状图，相似系数 和聚类分析用NTSYS2.1软件完成。

按有带记为1，无带记为0进行统计。

其中，表1是186对引物的核苷酸序列及在染色体上的信息【这些引物来自于 CottonMicrosatelliteDatabase(CMD)网站(http://www.cottonssr.org)】；表2是用来 筛选引物的12个代表材料；表3是应用实例的419份陆地棉种质资源；表4为图7、图8中无多 态性或者扩增效果比较差的引物：图7的引物为NAU1295，NAU1301；图8的引物为NAU3325和 NAU3501。

表1186对引物的核苷酸序列及在染色体上的信息

表212个筛选引物的代表材料

品种编号 品种名称 品种编号 品种名称 1 冀棉8号 13 乍得3号 2 宝山大桃 14 非洲棉E-40 3 中棉所12号 15 澳SiV2 4 无极一枝花 16 稀絮H10 5 南丹巴地大花 17 中棉所81 6 中棉所16号 18 辽阳多毛棉 7 秦荔514 19 岱字棉15号 8 苏远04-3 20 Ari3697 9 军棉1号 21 TM-1 10 鲁原343 22 渝棉1号 11 中棉所17号 23 J02-247 12 宿棉9108 24 中078

表3应用实例所用的419份陆地棉材料

表4图7、图8中所用引物

引物名称 前引物序列 前引物序列 NAU1295 TTTCAAGGCCTCTTTTGTGT AAAGGAAACAAGCATCCAAG 16 -->NAU1301 AAACCCCGATTAGACATCAA CAAGTGTGCTCTCTGCAATG NAU3325 AGGCCTTTTTCATGAATGC GACAGGCACAAAGTTTGATTT NAU3501 AAACTCAAAATCTAGCCCTTCA TTCCCCTCCAGTAGGATACA

利用PopGen3.2对186对引物的扩增结果进行分析，186对具有多态性位点的SSR引 物在419份陆地棉材料中共扩增出895个等位基因，其中多态性等位基因数763个，占 85.3％。每对引物等位基因变幅是2～9个，平均为3.9个，Shannon多样性指,数(I)为0.628, PIC值平均为0.533,说明所选用的186对SSR引物在419份陆地棉中具有较高水平的多态性。

采用Genemarker3.2对419个陆地棉品种进行UPGMA聚类分析，(见图3)结果419个 材料分成了6组，第一组，第二、三组和第五组包括的品种比较混杂，不能明确界定；第二组 主要以老品种为主，其中包括中棉所12衍生品种；第四组主要是远缘杂交和品质优良的品 种；第六组以棕色棉和早熟主推品种为主。

与对照组图7、图8的引物组相比，实验筛选出的这186对多态性的SSR引物能具有 较高的多样性，并能够把本实验所用的419个陆地棉进行分类，较好地反映出了陆地棉材料 的遗传多样性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。