一种单克隆抗体Q314及应用

摘要

本发明公开了一种单克隆抗体Q314及应用。本发明保护的单克隆抗体Q314，为一种IgG抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基和第116-135位氨基酸残基；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-72位氨基酸残基和第109-121位氨基酸残基。本发明对于埃博拉病毒扎伊尔亚型的防控具有重大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体Q314及应用。

背景技术

埃博拉病毒是迄今为止人类所知的最致命传染性病毒之一，平均病死率高达50％ 左右。由于埃博拉出血热的高致死率，以及目前尚未有任何预防或治疗方法可在临床 上广泛使用。埃博拉病毒被列为生物安全第四级(BiosafetyLevel4)病毒，同时被 视为是生物恐怖主义的工具之一。

2014春季年开始在西非各国暴发的埃博拉疫情引起了全世界的广泛关注。截止至 2015年2月27日，埃博拉病毒确诊和疑似病例已经达到23825人，死亡人数达到9660 人，美国和一些欧洲国家已经有输入性的传播，并有死亡病例。因此，防控埃博拉病 毒是全球所有国家的头等大事。然而令所有人焦虑的是：到目前为止还没有一个被批 准的埃博拉病毒疫苗和药物上市。由美国和加拿大联合开发的应急性治疗药物ZMapp 是目前唯一在模式动物和小规模病人临床验证有效的药物。我国目前尚没有类似的应 急药物，一旦有中国公民感染埃博拉病毒，后果不堪设想。紧急研制埃博拉病毒抗体 对于我国乃至全球埃博拉病毒疫情的防控具有重要的意义，同时对社会的稳定和谐有 着深远的影响。

发明内容

本发明的目的是提供一种单克隆抗体Q314及应用。

本发明保护的单克隆抗体Q314，为一种IgG抗体，由轻链和重链组成；所述重链 中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第45-52位 氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基和第116-135位氨基酸残基；所述轻链中的轻链 可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5自N末端第45-52位氨基酸残 基、第70-72位氨基酸残基和第109-121位氨基酸残基。

所述重链可为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列3自N末端第20-474位氨 基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列3所示的蛋白质。

所述轻链可为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列5自N末端第20-234位氨 基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列5所示的蛋白质。

本发明还保护编码所述IgG抗体的基因，其特征在于：

编码所述重链的基因为如下(1)或(2)或(3)：

(1)序列表的序列4自5’末端第889-2313位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列4自5’末端第946-2313位核苷酸所示的DNA分子；

(3)序列表的序列4所示的DNA分子；

编码所述轻链的基因为如下(4)或(5)或(6)：

(4)序列表的序列6自5’末端第889-1593位核苷酸所示的DNA分子；

(5)序列表的序列6自5’末端第946-1593位核苷酸所示的DNA分子；

(6)序列表的序列6所示的DNA分子。

本发明还保护所述IgG抗体在制备用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应 用。

本发明还保护一种用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为所述 IgG抗体。

本发明还保护所述IgG抗体在制备用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应 用。

本发明还保护一种用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为所述 IgG抗体。

本发明还保护所述IgG抗体在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引 起的埃博拉出血热的药物中的应用。

本发明还保护一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引起的埃博拉出血 热的药物，其活性成分为所述IgG抗体。

埃博拉病毒扎伊尔亚型又称扎伊尔埃博拉病毒，英文缩写为EBOV。

本发明利用EBOV的GP△m蛋白作为钓饵，从免疫猴的外周血单个核细胞中筛选抗 体生成的记忆B细胞，得到可同GP△m蛋白特异结合的单克隆抗体。通过EBOV假型病 毒侵染模型，筛选得到了具有中和活性同时具有良好的特异性的的单克隆抗体。

本发明对于扎伊尔埃博拉病毒的防控具有重大的应用价值，将产生深远的社会意义。

附图说明

图1为抗体对EBOV的中和活性的结果。

图2为抗体对VSV的中和活性的结果。

图3为抗体对HIV的中和活性的结果。

图4为抗体对SUDV的中和活性的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

质粒pcDNA3.1(+)：Invitrogen公司，产品目录号V790-20。293T细胞：盖德， CRL-11268。恒河猴：蓝岛生物。PMD18T载体：Takara，产品目录号D101A。VeroE6细 胞：vircell公司，产品目录号VCV6。

质粒pNL4-3R-E-luciferase(骨架质粒)：参考文献:HeJ,ChoeS,WalkerR,Di MarzioP,MorganDO,LandauNR.JVirol69:6705–6711,1995.。

实施例1、抗体的发现

一、GP△m蛋白的制备

1、构建重组质粒

(1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

序列表的序列2所示的双链DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质，其中开 放阅读框为序列2自5’末端第18-1451位核苷酸。序列表的序列1中，自N末端第1 至19位氨基酸残基组成信号肽，第472至477位氨基酸残基组成His₆标签。序列表 的序列1所示的蛋白质的预期分子量为200kDa。

(2)用限制性内切酶BamHI和NotI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶 切产物。

(3)用限制性内切酶BamHI和NotI双酶切质粒pcDNA3.1(+)，回收约5400bp 的载体骨架。

(4)将步骤2回收的酶切产物和步骤3回收的载体骨架连接，得到重组质粒 pcDNA3.1-GP△m。根据测序结果，对重组质粒pcDNA3.1-GP△m进行结构描述如下：在 质粒pcDNA3.1(+)的BamHI和NotI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端 第11至1453位核苷酸所示的双链DNA分子。

2、构建重组细胞

将步骤1得到的重组质粒转染293T细胞，得到重组细胞。

3、制备GP△m蛋白

(1)取步骤2得到的重组细胞，在含2％胎牛血清的DMEM培养基培养72h，然后 4000rpm离心30min，收集上清液。

(2)亲和层析

亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；

亲和层析的柱填料：镍柱beads(购自Qiagen公司，产品目录号为30230)；

操作步骤：①将300mL步骤(1)得到的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育3小 时；②用100mL含20mM咪唑的上样缓冲液洗涤柱子；③用30mL含500mM咪唑的洗脱 缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。上样缓冲液即HEPEsbuffer。

(3)取步骤(2)得到的过柱后溶液，用30kD浓缩管(购自Merck公司，产品目 录号为UFC800396)进行浓缩，得到体积为1ml的浓缩液。

(4)凝胶过滤层析

凝胶过滤层析的层析柱规格：长度24cm，内径2cm；

凝胶过滤层析的柱填料：superdex200increase10/300GL(购自GEHealthcare 公司，产品目录号为28-9909-44)；

操作步骤：上样0.5ml步骤(3)得到的浓缩液，用流速为0.5ml/min的PBS缓冲 液(pH7.2、10mM)洗脱，收集保留体积为11ml的峰对应的过柱后溶液，即为GP△m 蛋白溶液。

二、从与GP△m蛋白特异结合的menoryB细胞中分离抗体可变区基因

1、将GP△m蛋白作为免疫原免疫恒河猴，然后取外周血并分离单个核细胞(PBMC)。

2、采用流式细胞仪分选能够特异性识别GP△m蛋白的B细胞 (CD3^-CD16^-CD235a^-CD19⁺CD27⁺CD38^-IgG⁺GP△mBCR⁺)。

3、取步骤2得到的B细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。

4、以步骤3得到的cDNA为模板，进行巢式PCR，将PCR扩增产物进行测序。

获得重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列。

三、获得抗体基因

将重链可变区上游与CMV片段、重链可变区下游与人IgG1的恒定区以及ployA 片段，进行overlappingPCR，得到可以表达完整重链的DNA片段。

将抗体轻链可变区上游与CMV片段、抗体轻链可变区下游与轻链κ/λ的恒定区以 及ployA片段，进行overlappingPCR，得到可以表达完整轻链的DNA片段。

Q314全长重链的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列 4所示。序列表的序列3中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细 胞外)，第20至144位氨基酸残基组成重链可变区，第145至474位氨基酸残基组成 重链恒定区。序列表的序列4中，第1至888位核苷酸组成CMV启动子，第889至2313 位核苷酸编码序列表的序列3所示的全长重链，第2314至2511位核苷酸为ployA片 段。

Q314全长轻链的氨基酸序列如序列表的序列5所示，其编码基因如序列表的序列 6所示。序列表的序列5中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细 胞外)，第20至128位氨基酸残基组成轻链可变区，第129位至234位氨基酸残基组 成轻链恒定区。序列表的序列6中，第1至888位核苷酸组成CMV启动子，第889至 1593位核苷酸编码序列表的序列5所示的全长轻链，第1594至1741位核苷酸为ployA 片段。

实施例2、抗体的制备

一、重组质粒的构建

将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入PMD18T载体，得到重链表达载体。

将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入PMD18T载体，得到轻链表达载体。

二、重组细胞的构建

将重链表达载体和轻链表达载体共转染293T细胞，得到重组细胞。

三、抗体的制备

1、取步骤二得到的重组细胞，在含2％胎牛血清的DMEM培养基培养72h，然后4℃、 4000rpm离心30min，收集上清液。

2、亲和层析

亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；

亲和层析的柱填料：proteinAbeads(Thermo，产品目录号10006D)；

操作步骤：①将300mL步骤(1)得到的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育16 小时；②用60ml结合缓冲液洗涤柱子；③用30mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过 柱后溶液。

结合缓冲液：取甘氨酸112.6g、氯化钠175.2g，溶于水并用水定容至1L，用氢 氧化钠调pH至8.0。

洗脱缓冲液：取甘氨酸7.5g，溶于水并用水定容至500ml，用盐酸调pH至3.0。

3、取步骤2得到的过柱后溶液，用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为PBS缓冲液 (pH7.2、10mM)，得到1ml蛋白浓度为2mg/ml的抗体溶液。

实施例3、抗体的效果

一、EBOV假病毒的制备

1、将人工合成的序列表的序列8所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+)的 BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA3.1-GP△muc。序列表的序列8所示 的双链DNA分子编码序列表的序列7所示的蛋白质(EBOV的GP△muc蛋白)。

2、将重组质粒pcDNA3.1-GP△muc和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细 胞，得到重组细胞。

质粒pNL4-3R-E-luciferase中含有HIV-1病毒基因组的全部基因(与野生HIV-1 病毒基因组的差异仅在于envelope基因发生了移码)。重组质粒pcDNA3.1-GP△muc 和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染宿主细胞，可以表达EBOV假病毒。EBOV假病毒 只有病毒颗粒表面的膜蛋白是GP△muc蛋白，其他均为HIV-1病毒的成分，只能在被 感染的细胞中复制基因组并表达荧光素酶报告基因，不能再产生有感染性的病毒颗粒。 GP△muc蛋白与EBOV的GP蛋白相比，差异仅在于缺失了一段mucin-likedomain区 域，缺失此区域能明显提高假病毒进入易感细胞的能力。

3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。

4、完成步骤3后，取培养上清，即为EBOV假病毒的病毒液(简称EBOV病毒液)。

5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测EBOV病毒液中的病毒滴度。

二、单克隆抗体的中和活性检测

1、取实施例2制备的抗体溶液，用PBS缓冲液(pH7.2、10mM)进行倍比稀释， 得到抗体稀释液。

2、取96孔细胞培养板，每孔加入100微升抗体稀释液和50微升EBOV病毒液， 使得混合体系中的抗体浓度为50μg/ml、16.67μg/ml、5.56μg/ml、1.85μg/ml、 0.62μg/ml、0.21μg/ml、0.07μg/ml或0.02μg/ml(以蛋白浓度计)，37℃静置孵 育1小时。用等体积PBS缓冲液(pH7.2、10mM)代替抗体稀释液，作为病毒对照。用 等体积含10％胎牛血清的DMEM培养基代替EBOV病毒液，作为细胞对照。

3、完成步骤2后，取所述细胞培养板，每孔接种100微升VeroE6细胞悬液(用 于制备细胞悬液的溶剂为含10％胎牛血清的DMEM培养基，细胞悬液中的VeroE6细胞 浓度为2×10⁵个细胞/ml)，37℃静置孵育64小时。

4、完成步骤3后，取所述细胞培养板，吸弃上清，每孔加入150微升裂解液(微 格拉斯生物技术，货号T003，按说明书操作)，37℃静置孵育5分钟。

5、完成步骤4后，取所述细胞培养板，检测荧光素酶活性。

荧光强度结果见表1(每个处理设置三个复孔，表1的第二列、第三列和第四列 分别列出了三个复孔各自的值)。

表1荧光强度的结果

病毒对照 453716 416989 515392 细胞对照 955 1081 1105 抗体浓度为0.02μg/ml 364894 394164 435084 抗体浓度为0.07μg/ml 285880 452374 372691 抗体浓度为0.21μg/ml 276280 344517 349392 抗体浓度为0.62μg/ml 165486 226710 239484 抗体浓度为1.85μg/ml 88493 114894 106588 抗体浓度为5.56μg/ml 53684 46488 62804 抗体浓度为16.67μg/ml 37203 31339 37770 抗体浓度为50μg/ml 27627 18904 28058

中和活性(％)＝[1-(试验组的荧光强度-细胞对照的荧光强度)/(病毒对照的荧 光强度-细胞对照的荧光强度)]×100％。

中和活性的结果见图1。

利用Prism5软件计算中和活性为50％时的抗体浓度，即抗体的IC₅₀值，抗体的 IC₅₀值为0.78μg/ml。

实施例4、抗体的特异性

一、VSV假病毒的制备(VSV即疱疹性口炎病毒)

1、将人工合成的序列表的序列9所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+)的 BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列9所示的双链DNA分子编 码VSV的壳G糖蛋白。

2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得 到重组细胞。

3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。

4、完成步骤3后，取培养上清，即为VSV假病毒的病毒液(简称VSV病毒液)。

5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测VSV病毒液中的病毒滴度。

二、HIV假病毒的制备

1、将人工合成的序列表的序列10所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+) 的BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列10所示的双链DNA分 子编码HIV-1CNE30的GP蛋白。

2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得 到重组细胞。

3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。

4、完成步骤3后，取培养上清，即为HIV假病毒的病毒液(简称HIV病毒液)。

5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测HIV病毒液中的病毒滴度。

三、SUDV假病毒的制备(SUDV即埃博拉病毒苏丹亚型)

1、将人工合成的序列表的序列11所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+) 的BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列11所示的双链DNA分 子编码SUDV的GP△muc蛋白。

2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得 到重组细胞。

3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。

4、完成步骤3后，取培养上清，即为SUDV假病毒的病毒液(简称SUDV病毒液)。

5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测SUDV病毒液中的病毒滴度。

四、单克隆抗体的中和活性检测

用VSV病毒液、HIV病毒液或SUDV病毒液代替EBOV病毒液，其它同实施例3的 步骤二。

抗体对VSV病毒的中和活性的结果见图2。

抗体对HIV病毒的中和活性的结果见图3。

抗体对SUDV病毒的中和活性的结果见图4。

结果表明，实施例二制备的抗体溶液对VSV病毒、HIV病毒和SUDV病毒的中和活 性均为20％以下，为阴性结果。