经靶向修饰的IL-1家族成员

摘要

本公开涉及一种经修饰的白介素-1(IL-1)家族成员细胞因子，其对其细胞因子受体具有降低的活性，其中所述白介素-1家族成员细胞因子是特异性地递送至靶细胞。优选地，IL-1家族成员细胞因子是突变体，更优选它是对IL-1受体具有低亲和力的突变体IL-1，其中所述突变体IL-1是特异性地递送至靶细胞。靶向优选是通过使所述经修饰的IL-1家族成员细胞因子融合至靶向部分、优选抗体或抗体样分子而实现。本公开另外涉及此类经靶向修饰的IL-1家族成员细胞因子用于治疗疾病的用途。

说明书

本发明涉及一种经修饰的白介素-1(IL-1)家族成员细胞因子，其对其细胞因子受体具有降低的活性，其中所述白介素-1家族成员细胞因子是特异性地递送至靶细胞。优选地，IL-1家族成员细胞因子是突变体，更优选它是对IL-1受体具有低亲和力的突变体IL-1，其中所述突变体IL-1特异性地递送至靶细胞。靶向优选是通过使经修饰的IL-1家族成员细胞因子融合至靶向部分、优选抗体或抗体样分子而实现。本发明另外涉及此类经靶向修饰的IL-1家族成员细胞因子用于治疗疾病的用途。

白介素-1(IL-1)家族由11个在结构上相关的家族成员(IL-1α、IL-1-β、IL-1Ra、IL-18、IL-33以及IL-1F5至IL-1F10)组成，其属于最有效的免疫系统信号传导分子，通过一组紧密相关的受体起作用。所有IL-1受体具有类似的活化模式：在配体结合至一级受体亚单位(即对于IL-1α和β来说的IL-1R1、对于IL-18来说的IL-18R以及对于IL-33来说的ST2)后，第二受体亚单位被募集(即对于IL-1α和β来说的IL-1RAP、对于IL-18来说的IL-18RAP以及对于IL-33来说的IL-1RAP)并且经由并列放置受体亚单位的胞质Toll/IL-1受体(TIR)结构域而起始信号传导。二聚化TIR结构域为MYD88衔接蛋白提供对接平台，其经由招募其他中间物而引起促炎性核因子-κΒ(NF-κΒ)和分裂素活化的蛋白激酶(MAPK)通道的活化。IL-1家族成员主要由先天免疫细胞产生并且在免疫反应期间作用于多种细胞类型(关于综述参见Sims和Smith,2010)。

T淋巴细胞是主要IL-1家族靶细胞之一并且使尤其IL-1α和IL-1β对不同T细胞亚群的扩增和分化的影响加强，特定而言，已充分确定了CD8+T细胞(Ben-Sasson2011；Ben-Sasson,2013)和Th17细胞(Sutton等人,2006；Acosta-Rodriguez等人,2007；Dunne等人,2010；Shaw等人,2012)。Th17细胞的特征为产生IL-17并且在自体免疫性疾病和慢性炎症中起重要作用(综述于Wilke等人,2011中)。在T细胞亚群之中，Th17细胞表达最高水平的IL-1R，并且IL-1在Th17启动中起重要作用。

IL-18作为IFNγ-诱导细胞因子最为著名，其对Th1细胞和自然杀伤(NK)细胞具有有效作用(Okamura等人,1995；Takeda等人1998)。此外，IL-18增强嗜中性粒细胞功能(Leung等人,2001)。若干报导证实在动物模型中的IL-18抗肿瘤作用(Micallef等人,1997；Loeffler等人,2008；Wigginton等人,2002；Zaki等人,2010)，并且重组人类IL-18治疗近来进入临床试验，以评估其治疗晚期癌症的功效(Robertson等人,2008)。与IL-18相反，IL-33主要作用于Th2细胞(Schmitz等人,2005)和肥大细胞(Allakhverdi等人,2007)，并且近来显示作用于CD8+T细胞以驱动抗病毒反应(Bonilla等人,2012)。其他IL-1家族成员未更充分表征，但总起来说不同IL-1家族成员对不同T细胞亚群或其他细胞类型具有特异性并且因此具有不同治疗应用。

除具有间接抗肿瘤活性之外，经由活化T细胞和NK细胞，IL-1家族成员显示具有直接细胞抑制性质，这在人类黑素瘤细胞上得到最有说服力地证实(Morinaga等人,1990；Usui等人,1991；Rangnekar等人,1992)。

鉴于若干IL-1家族成员在炎性过程中的贡献，临床兴趣一直以来主要是以发展IL-1拮抗策略为方向(Dinarello等人,2012)。尽管如此，受控制的激动性IL-1活性的开发可应用于不同生理/病理过程中，其中免疫刺激作用将是所需的。关于IL-1在免疫刺激治疗中的使用的主要担忧问题之一是其在全身施用时的严重毒性。然而，当IL-1作用可限于所选细胞群体时，毒性问题可得以解决，这展示出治疗前景。

举例来说，虽然鉴于Th17在诸如多发性硬化、类风湿性关节炎以及炎性肠道疾病(Wilke等人,2011)等自体免疫病状中的病原作用，阻断Th17反应已受到广泛关注，正常Th17功能对针对包括结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(Khader等人,2007)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(Ye等人,2001)以及百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)(Higgins等人,2006)的一系列病原体的保护性免疫来说是不可缺少的。由于IL-1β刺激Th17功能，所述想法已上升至使用IL-1β作为T细胞佐剂来增强对弱毒疫苗的反应(Ben-Sasson等人,2011)。其他应用可以是使IL-1β或IL-33靶向CD8+T细胞群体以增强抗病毒反应或使IL-18靶向Th1细胞或NK细胞以促进抗肿瘤活性。

令人惊讶地，我们发现有可能设计IL-1家族修饰，其在活化受体方面具缺陷，但当融合至靶向部分时，通过在细胞表面的浓集效应恢复其对所选细胞类型的活性。IL-1突变体对其同源受体具有降低的亲和力，并且因此不能有效结合并且活化其受体。然而，通过使它们融合至靶向部分(诸如纳米抗体(nanobody))，突变体IL-1家族成员在表达由靶向部分识别的细胞表面靶标的细胞上的活性得以恢复。因为活化仅限于所选靶向细胞类型，所以不产生大的全身性毒性。

本发明的第一方面是靶向构建体，其包含以对细胞因子受体的亲和力降低为特征的经修饰的IL-1家族成员细胞因子，以及靶向部分。IL-1家族成员细胞因子是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL18、IL-36Ra、IL-36α、IL-37、IL-36β、IL-36γ、IL-38以及IL-33(也分别表示为IL-1F1、IL-1F2、IL-1F3、IL-1F4、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1F10和IL-1F11)。对于关于IL-1家族的综述，参见Dinarello(2011)。经修饰的IL-1家族细胞因子意指IL-1家族细胞因子已被改变，以改变对其受体的亲和力，并且作为最终结果，与通常结合至受体的内源性野生型细胞因子相比，经修饰的IL-1家族细胞因子具有降低的受体亲和力和随之发生的降低的生物活性。此类修饰可以是降低普通野生型细胞因子的活性的修饰，或者它可以是增加同源性、非内源性IL-1家族细胞因子(诸如但不限于对IL-1家族细胞因子受体不具活性的另一种类的IL-1家族细胞因子)的亲和力的修饰。修饰可以是本领域技术人员已知的降低或增加活性的任何修饰，包括但不限于化学和/或酶促修饰，诸如聚乙二醇化和糖基化、融合至其他蛋白质以及突变。优选地，所述修饰是突变，甚至更优选地它是降低IL-1家族细胞因子的亲和力的突变。如在此所用的降低的亲和力和随之发生的降低的生物活性意味经修饰的IL-1家族细胞因子的生物活性与通常结合于受体的IL-1家族细胞因子相比小于IL-1家族细胞因子的生物活性的70％，甚至更优选小于IL-1家族细胞因子的生物活性的60％，更优选小于IL-1家族细胞因子的生物活性的50％，更优选小于IL-1家族细胞因子的生物活性的40％，更优选小于IL-1家族细胞因子的生物活性的30％，更优选小于IL-1家族细胞因子的生物活性的20％，更优选小于IL-1家族细胞因子的生物活性的10％，最优选地小于IL-1家族细胞因子的生物活性的1％。优选地，经修饰的IL-1家族细胞因子是野生型IL-1家族细胞因子的突变体并且活性可与野生型IL-1家族细胞因子相比。亲和力和/或活性可通过本领域技术人员已知的任何方法来测量。

本发明的优选实施方案是一种靶向构建体，其包含以对白介素-1受体类型I(IL-1RI)和/或白介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)受体的亲和力降低为特征的突变体IL-1β，以及靶向部分。如在此所用的突变体IL-1β可以是对受体具有较低亲和力并且因此对促炎性转录因子NFκB的活化减少的任何突变体形式。与野生型IL-1β对受体的亲和力相比，突变体IL-1β对受体的亲和力可通过Scatchard作图分析和计算机拟合结合数据(例如Scatchard,1949)或如Brecht等人(1993)所描述在流通条件下通过反射干涉光谱学来测量。突变体IL-1β的活性典型地是使用生物分析(例如通过诱导细胞死亡)或通过测量受体下游的信号传导事件来测量。此类信号传导事件可以是NF-κβ的修饰或核移位，或所选报告基因的诱导。所述突变体可以是点突变体、缺失或插入突变体或其组合；一种蛋白质中可存在若干突变。优选地，所述突变体IL-1β是通过活性诱变获得，诸如但不限于通过聚合酶链反应扩增进行定点诱变。优选地，所述突变体IL-1β的生物活性小于野生型IL-1β的生物活性的70％，甚至更优选小于野生型IL-1β的生物活性的60％，更优选小于野生IL-1β的生物活性的50％，更优选小于野生IL-1β的生物活性的40％，更优选小于野生IL-1β的生物活性的30％，更优选小于野生IL-1β的生物活性的20％，更优选小于野生型的生物活性的10％，最优选地小于减小的野生型的1％(即编码序列已突变以获得突变体IL-1β的野生型IL-1β)。优选地，所述突变体是选自以下的突变体：A117G/P118G、R120X、L122A、T125G/L126G、R127G、Q130X、Q131G、K132A、S137G/Q138Y、L145G、H146X、L145A/L147A、Q148X、Q148G/Q150G、Q150G/D151A、M152G、F162A、F162A/Q164E、F166A、Q164E/E167K、N169G/D170G、I172A、V174A、K208E、K209X、K209A/K210A、K219X、E221X、E221S/N224A、N224S/K225S、E244K、N245Q(其中X可以是氨基酸中的任何变化，优选非保守变化)。甚至更优选所述突变选自R120A、R120G、Q130A、Q130W、H146A、H146G、H146E、H146N、H146R、Q148E、Q148G、Q148L、K209A、K209D、K219S、K219Q、E221S和E221K。最优选所述突变选自R120G、H146N、H146R、Q148E、Q148G和K209A。(编号基于人类IL-1β序列，基因库登录号NP_000567，版本号NP-000567.1，GI：10835145)。

IL-18突变的优选区域是Y37-K44、R49-Q54、D59-R63、E67-C74、R80、M87-A97、N127-K129、Q139-M149、K165-K171、R183和Q190-N191。最优选的是区域E67-C74和M87-A97(编号基于人类序列，基因库登录号AAV38697，版本号AAV38697.1，GI：54696650)。

IL-33突变的优选区域是I113-Y122、S127-E139、E144-D157、Y163-M183、E200、Q215、L220-C227和T260-E269(编号基于人类序列，基因库登录号NP_254274，版本号NP_254274.1，GI:15559209)

优选地，所述靶向部分靶向在表达IL-1β受体的细胞，优选表达IL1-RI的细胞上所表达的标记物。在一个优选实施方案中，所述靶向部分定向于组织特异性标记物。

经修饰的IL-1家族成员键联至靶向部分。如在此所用的“键联”可以是通过共价键结来进行，或者它可以是通过亲和力结合来进行。如在此所用的“靶向部分”是可通过结合位点与结合分子之间的特异性相互作用使融合蛋白定向于在表达IL-1家族成员受体的细胞上的结合位点的结合分子。在一个优选实施方案中，所述结合分子是小化合物，其特异性结合于位于细胞外部的分子。在另一优选实施方案中，所述分子是糖结构，其定向于在细胞壁上表达的凝集素样分子。在另一优选实施方案中，所述结合分子是肽，其靶向肿瘤或炎症环境。此类肽是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于NGR和RGD肽(Yang等人,2011；WO2005054293)。在另一优选实施方案中，所述结合分子是包含结合域的蛋白质。此包括但不限于碳水化合物结合域(CBD)(Blake等人,2006)、凝集素结合蛋白、重链抗体(hcAb)、单域抗体(sdAb)、微型抗体(minibody)(Tramontano等人,1994)、骆驼重链抗体的可变域(VHH)、新抗原受体的可变域(VNAR)、亲和体(affibody)(Nygren等人,2008)、阿尔法体(alphabody)(WO2010066740)、经设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)(Stumpp等人,2008)、抗转运蛋白(anticalin)(Skerra等人,2008)、打结素(knottin)(Kolmar等人,2008)以及经工程改造的CH2结构域(纳米抗体(nanoantibody)；Dimitrov,2009)。优选地，所述靶向部分由单一多肽链组成并且未经翻译后修饰。甚至更优选地，所述靶向部分是纳米抗体。

靶向部分可以是本领域技术人员已知的任何靶向部分。在一个非限制性实例中，所述靶向部分可以是双特异性抗体，其对于一种特异性来说定向于靶细胞上的结合位点，而对于另一种特异性来说定向于所靶向的细胞因子或定向于融合至所述细胞因子的标签。在另一个非限制性实例中，靶向部分可化学键联至突变体白介素-1，或者它可以是重组融合蛋白。优选地，所述靶向构建体是重组融合蛋白。靶向部分可直接融合至突变体IL-1β，或者它可借助于接头片段，优选GGS接头进行融合。靶向部分可融合在突变IL-1β的氨基末端或在羧基末端；优选所述靶向部分融合在突变IL-1β分子的羧基末端尽头。靶向构建体可进一步包含其他结构域，诸如但不限于标签序列、信号序列、另一种细胞因子或抗体。

本发明的另一个方面是一种根据本发明用作药剂的靶向构建体。一个优选实施方案是一种根据本发明用于刺激免疫反应的靶向构建体。实际上，已知IL-1治疗可诱导抗原在B细胞上的表达(Killar等人,1989)；同样地，IL-18治疗加强细胞和体液免疫性(Kinoshita等人,2011)。同理，已证实IL-1作用于T细胞以增强体内免疫反应的量值(Ben-Sasson等人,2011；BenSasson等人,2013)。因此，本发明的一个优选方面是根据本发明在接种中用作佐剂的靶向构建体。根据本发明的靶向构建体在此方面中尤其有趣，因为普通野生型IL-1的促炎性效应使得IL-1照此应用是不可能的。

本发明的另一个方面是一种根据本发明用于治疗癌症的靶向构建体。实际上，Morinaga等人,1990；Usui等人,1991以及Rangnekar等人,1992已表明IL-1家族成员确实具有直接细胞抑制性质，这在人类黑素瘤细胞上得到最有说服力地证实。

附图简述

图1：IL-1β-纳米抗体融合蛋白的示意性图示

图2：在模拟转染细胞或用信号传导缺陷型Her2转染的细胞中，野生型和突变体Q148GIL-1Her2纳米抗体融合体(A)和其他所选突变体(B)对NFκB活性的诱导作用的浓度依赖性。

图3：在模拟转染细胞或用信号传导缺陷型Her2转染的细胞中，野生型和突变体(Q148G、L145A/L147A、F162A/Q164E)IL-1Her2纳米抗体融合体对内源性NF-κBp65的核移位的影响。

图4：在表达鼠瘦素受体(mLR)或不表达鼠瘦素受体(无mLR)的细胞上，融合至抗鼠瘦素受体纳米抗体的野生型和5种不同IL-1突变体对NFκB活性的诱导作用。

图5：在模拟转染细胞或用信号传导缺陷型Her2转染的细胞中，融合至Her2纳米抗体的IL1双重突变体对NFκB活性的诱导作用的浓度依赖性。

实施例。

实施例的材料和方法

IL-1-纳米抗体融合蛋白的克隆。

针对鼠瘦素受体的4-10种纳米抗体描述于Zabeau等人(2012)和专利WO2006/053883中。抗Her2纳米抗体1R59B描述于Vaneycken等人(2011)中。在C端His标签存在的情况下，将两种纳米抗体在pMET7真核表达载体中克隆。经由基因合成产生编码成熟IL-1β蛋白的密码子最佳化序列，其前面是SigK前导肽，并且具备N端HA标签(InvitrogenGeneArt)。为产生IL-1β-纳米抗体融合蛋白，在pMet7中将IL-1β序列5'克隆至纳米抗体序列，其中13×GGS接头将细胞因子与纳米抗体部分隔开。(图1)

IL-1β突变体。

预期对IL-1R具有降低的结合亲和力的IL-1β突变体是基于文献和对已公开的与受体复合的人类IL-1β的晶体结构的分析进行选择。hIL-1β部分中的突变是使用表I中所示的诱变引物经由定点诱变(QuickChange,Stratagene)产生：

表I：突变体和所用的引物

*使用R120G作为模板产生双重/三重-突变体。**使用Q148G作为模板产生双重/三重-突变体。

lL-1β融合蛋白的制备。

IL-1β融合蛋白是在HEK293T细胞中制备。对于小规模制备，在6孔板中按每孔400000个细胞将HEK293T细胞接种于补充有10％FCS的DMEM中。在24小时之后，将培养基用血清减少的培养基(DMEM/5％FCS)代替并且使用线性PEI转染细胞。简言之，通过将1μg表达载体与5μgPEI组合于160μlDMEM中来制备PEI转染混合物，在室温下孵育10分钟并且逐滴添加至孔中。在24小时之后，将转染的细胞用DMEM洗涤并且用每孔1.5mlOptiMem使其分层，从而制备蛋白质。在48小时之后回收条件培养基，经0.45μ过滤器过滤并且储存于-20℃下。通过Elisa(R&DSystems)根据制造商的说明书测定条件培养基中的IL-1β含量。

NF-κB报告基因分析。

为评估IL-1R活化，我们使用稳定表达IL-1R的HEK-Blue^TMIL-1β细胞(Invivogen)并且用NF-κB荧光素酶报告基因将它们瞬时转染。简言之，将HEK-Blue^TMIL-1β细胞接种于96孔板中的培养基(DMEM/10％FCS)中(每孔10000个细胞)并且在第二天使用磷酸钙沉淀法用指示量的表达质粒和每孔5ng的3κB-Luc报告基因质粒进行转染(VandenBerghe等人,1998)。转染后24小时，将培养基用饥饿培养基(DMEM)替代，并且转染后48小时，用融合蛋白诱导细胞6小时。在诱导之后，将细胞裂解并且使用Promega荧光虫荧光素酶分析系统在BertholdcentroLB960光度计上测定裂解产物中的荧光素酶活性。

经由共焦显微镜分析NF-κΒ核移位。

对于共焦成像，将每孔10⁵个HEK293-T细胞(在6孔板中)接种于玻璃盖玻片(Zeiss)上，用聚L-赖氨酸(Sigma)包被。第二天，将细胞使用磷酸钙沉淀法用每孔200ng空载体或HER2Δcyt表达质粒进行转染。在48小时之后，将细胞用媒介物(培养基)或IL1-Her2纳米抗体融合蛋白(10ng/ml)处理30分钟。接着，将细胞用1×PBS冲洗并且在室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟。在用1×PBS洗涤三次之后，将细胞用含0.1％TritonX-100的1×PBS渗透化10分钟并且再在室温下在含1％BSA的1×PBS中阻断10分钟。然后将样品在37℃下与兔抗p65抗体(SantaCruzC20，1:800稀释)和小鼠抗Flag抗体(SigmaM2，1:2000)一起孵育1小时。在1×PBS中洗涤四次之后，将细胞在室温下与抗兔Alexa488和抗小鼠Alexa594荧光染料缀合的二级抗体(两者均1:800稀释)一起孵育1小时。在第二抗体孵育之后，将细胞在1×PBS中洗涤四次并且将核用DAPI(2μg/ml)染色。在1×PBS中的最终洗涤步骤之后，将盖玻片使用没食子酸丙酯进行封片。在OlympusIX-81激光扫描共焦显微镜上使用60×1.35NA物镜采集图像并且使用Fluoview1000软件进行分析。

实施例1：IL-1β-配体和IL-1β-纳米抗体融合蛋白。

图1示出了用表I中描述的WThIL-1β或hIL1β突变体构建的IL-1β-纳米抗体融合蛋白的方案。

实施例2：在表达Nb靶标的细胞上所选突变体IL-1β-纳米抗体融合体的IL-1β活性得以恢复。

使野生型IL-1β和45种IL-1β突变体(表I)融合至充分表征的识别Her2的纳米抗体(1R59B)。将IL-1β-纳米抗体融合蛋白在HEK-Blue^TMIL-1β细胞上进行测试，用NF-κΒ报告基因质粒(每孔5ng)和Her2Δcyt(信号传导缺陷型)表达质粒(每孔2ng)进行瞬时转染。将细胞用IL-1β-Her2纳米抗体融合体处理6小时(剂量反应在0,4至250ng/ml范围内)。如图2A中所证实，IL-1β-Q148G-Her2纳米抗体融合体与WTIL1-β-Her2纳米抗体融合体相比展示降低的活化NF-κΒ的能力。重要地，Q148G突变体靶向表达Her2Δcyt的细胞使其活性恢复，并且产生关于NF-κβ活化的剂量反应曲线，其完全平行于模拟转染细胞上的WTIL-1β的剂量反应曲线。由此图还清楚的是WTIL-1βHer2纳米抗体融合体的强靶向效应。融合至Her2纳米抗体的另外六种IL-1β突变体(R120G、Q131G、H146A、H145A/L147A、F162A/Q164E和K208E)观测到类似的“通过靶向活化”的效应(图2B)。

为获得关于“通过靶向活化”概念的其他证据，我们接下来探索了我们是否可经由共焦显微镜目视观察在表达Her2的细胞中IL-1β-Her2纳米抗体融合体对NF-κΒ的选择性活化。我们通过分析NF-κΒ核移位测量了内源性NF-κΒ的活化。如由图3清楚的，在不表达Her2的细胞中，仅WTIL-1β-Her2纳米抗体融合体促进内源性NF-κΒ的移位。然而，在模拟转染细胞中，其不促进可检测NF-κΒ移位，在还对于Her2呈染色阳性的细胞中，三种所测试的突变体IL1-β-Her2纳米抗体融合体触发NF-κΒ核移位，指示其仅作用于所靶向的细胞。

为评估对于不相关的膜蛋白来说使用纳米抗体“通过靶向活化”的概念是否还起作用，我们将WTIL-1β和五种失能(disabled)IL-1β突变体(R120G、Q131G、H146A、Q148G、K209A)融合至先前表征的识别mLR的纳米抗体(4-10)。使用HEK-Blue^TMIL-1β细胞进行类似于关于IL-1β-Her2纳米抗体融合体(图2)所报导的实验，用mLR表达质粒(每孔10ng)进行瞬时转染。类似于由Her2纳米抗体融合蛋白所获得的结果，与WT融合体相比，所有经研究的突变体IL-1β纳米抗体融合体(在12.5ng/ml下测试)显示降低的活化不表达mLR的细胞上的NF-κΒ的能力。然而，通过mLR纳米抗体部分靶向使所选突变体的活性部分恢复(图4)。

因为上文所描述的IL-1β突变体保留显著的残余生物活性，所以我们将不同突变组合以获得具有降低的基础活性的双重/三重突变体。测试了九种双重/三重突变体(参照表I突变体46至54)，并且由这些突变体来看，六种突变体蛋白质(Q131G/Q148G、Q148G/K208E、R120G/Q131G、R120G/Q131G、R120G/H146A、R120G/K208E、R120G/F162A/Q164E)在Her2-阴性细胞上不展示残余活性(使用与图2中相同的分析来测量NF-κΒ)，而在过表达Her2Δcyt的细胞上部分恢复的活性是显而易见的(图5)。

这些数据总起来说表明通过使非活性突变体IL-1β融合至识别细胞表面受体的纳米抗体来部分靶向非活性突变体IL-1β可有可能通过经膜浓集作用促成的受体相互作用使其在纳米抗体靶细胞上的活性恢复。可使用识别不同类别的膜蛋白的纳米抗体实现通过靶向活化的事实表明“通过靶向活化”概念的广泛适用性。

因为这些数据提供关于使突变体IL-1家族成员靶向所选细胞类型从而使其仅在这些靶细胞上的活性恢复的能力的概念的证据，所以制备了允许使IL-1家族成员靶向生理学相关的IL-1β靶细胞的纳米抗体。鉴于IL-1家族成员作为T细胞和NK细胞活化剂的重要作用，将纳米抗体设计成使IL-1特异性地靶向T细胞和NK细胞亚群。更具体地说，研制了靶向主要表达于Th17细胞上的CCR6的纳米抗体以及靶向细胞毒性T细胞上的CD8的纳米抗体，并且使其融合至IL1家族成员，优选IL-1β。

实施例3：IL-1β-纳米抗体融合体对由原代人类T细胞产生IL-17的影响。

原代人类T细胞是分离自血沉棕黄层。首先，通过lymphoprep密度梯度离心分离PBMC，并且将O/N与0.5ng/mlrhIL-2一起孵育以进行回收。接着，使用全T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)根据制造商的说明书分离T细胞。简言之，将T细胞再悬浮(1×10⁶/ml)于补充有10％FCS和CD3/CD28活化微珠粒的RPMI-1640(MiltenyiBiotec)中。接着，将细胞(100μl/孔)涂铺于U型底96孔板中并且用指示浓度的IL-1β变体刺激96小时。用PMA/离子霉素(两者均在100nM下)再刺激6小时之后，回收上清液并且通过Elisa(R&DSystems)测定IL-17水平。其他细胞因子是经由Luminex技术评估。

对于所选突变体IL-1β-纳米抗体融合体(例如使用靶向CCR6的纳米抗体)，通过使用流式细胞术方法的细胞内染色来评估靶细胞特异性IL-17和IFNγ产生。

另外，为确证对Th17群体的选择性，经由使用Flag标签和所选CD标记物的双重染色继之以流式细胞术分析来测量对PBMC亚群的结合。

最后，在人类Th17细胞功能的临床相关体外模型中，评估IL-1β-纳米抗体融合体的佐剂活性。鉴于对针对百日咳博德特氏菌的更有效疫苗(或现有疫苗的佐剂)的需要，我们确定了在初始T细胞与经百日咳博德特氏菌处理的单核细胞衍生的树突细胞(MDDC)的共培养模型中所选融合蛋白是否增强人类Th17反应。自血沉棕黄层分离人类MDDC(使用单核细胞分离试剂盒II,MiltenyiBiotec)，用不同比率的百日咳博德特氏菌处理48小时并且然后与原初同种异体T细胞共培养12天。在用抗CD3/抗CD28再刺激之后，使用Elisa/Luminex技术(参照上文)确定上清液中的细胞因子型态。

实施例4：IL-1β-纳米抗体融合体对CTL的影响

为评估IL-1β-CD8纳米抗体融合体是否可特异性地增强CD8+T细胞的功能，通过lymphoprep密度梯度离心自血沉棕黄层分离人类PBMC并且用与wt或突变体IL1β-CD8Nb融合体组合的CD3/CD28活化微珠粒(MiltenyiBiotec)刺激24小时。通过进行针对活性(磷酸化)NF-κΒ和IFNγ的细胞内染色来评估这些融合蛋白对CD8+T细胞活化的影响。此外，为研究IL-1β-纳米抗体融合体是否影响CTL脱粒，使PBMC(2×10⁶个细胞/ml)在与增加剂量的IL-1β融合蛋白组合的植物血球凝集素(PHA，1μg/ml)和IL-2(100IU/ml)存在下分化48小时。接着，为诱导脱粒，将细胞用CD3/CD28dynabeads刺激3小时并且通过流式细胞术加以分析。脱粒是经由检测细胞表面CD107a来进行测量，所述细胞表面CD107a是一种充分确定的自然杀伤活性标记物。在对白细胞汇集物进行的所有流式细胞术分析中，包括抗CD8染色以允许监测IL-1β-CD8Nb作用的细胞类型特异性。

最后，为评估IL-1β-CD8纳米抗体融合体是否促进体内抗肿瘤活性，将C57BL/6小鼠皮下注射TC1肿瘤细胞，其由HPV16产生E6和E7抗原性致癌蛋白。此模型先前用于证实IL-1β促进CD8+T细胞介导的抗原特异性抗肿瘤反应(Ben-Sasson,2013)。简言之，在肿瘤注射之后四天，将小鼠用含有与DOTAP和LPS组合的HPV16E7_49-57肽的疫苗并且在存在或不存在WT或突变体IL-1β-CD8Nb融合体或IL-1β-GFPNb融合体的情况下进行免疫。监测免疫后18天内的肿瘤大小。

实施例5：体内实验-疫苗佐剂作用。

在第一系列实验中，将C57BL/6小鼠用不同剂量的WT和突变体IL-1β-纳米抗体融合体以及未融合的IL-1β进行静脉内/腹膜内处理，以监测急性毒性。在处理后的不同时间通过尾部静脉穿刺收集静脉血，并且通过Luminex分析确定血清中的细胞因子型态。此外，在所选白细胞亚群中经由流式细胞术分析确定细胞内细胞因子水平(IL-17，IFNγ)和IL-1R的活化(如通过测量磷酸化NF-κB水平所评估)。

当最佳剂量已确定时，在鼠接种方案中评估其佐剂活性。简言之，将C57BL/6小鼠用无细胞百日咳疫苗(Pa)进行腹膜内免疫。Pa疫苗由每小鼠5μg的纯化重组解毒百日咳毒素(PT9K/129G)+丝状血凝素(FHA)(根据Brereton等人,2011的组合物)组成。在免疫之后24小时，腹膜内或静脉内施用所选突变体IL1β-Nb或PBS。在28天之后对动物进行加强免疫。将一组动物在第二次免疫之后14天时处死并且分离脾细胞并且在体外用培养基或FHA再刺激3天。经由Luminex技术测定培养物上清液中的细胞因子水平(IL-17、IFNγ、IL-2、IL-10、IL-5、IL-4等)。将第二组小鼠在加强免疫后第14天用百日咳博德特氏菌激发并且在激发后2h和5天以及10天时处死。分离肺并且肺匀浆中的CFU将在Bordet-Gengou琼脂平板上定量。如脾细胞上清液中一般，测定肺匀浆中的细胞因子水平。此外，在免疫之前对血液进行取样(自尾部静脉)并且然后每14天测定血清中的百日咳博德特氏菌特异性IgG水平。

实施例6：IL-1β-纳米抗体融合体的直接抗肿瘤作用

为研究所选IL1-纳米抗体融合体的直接抗肿瘤活性，我们使用人类A375黑素瘤细胞，其被证实对IL-1诱导的细胞抑制效应高度敏感(Morinaga等人,1990)。为使突变体IL-1家族成员靶向A375细胞，产生了表达高亲和力纳米抗体已可用的细胞表面标记物(即CD20)的稳定A375克隆。与亲本A375细胞相比，此细胞系对突变体IL1-纳米抗体融合体的抗增殖作用的敏感性是使用XTT增殖分析在体外进行研究。突变体IL-1-纳米抗体融合体的体内抗肿瘤活性是使用A375异种移植模型进行研究。简言之，将无胸腺裸鼠用A375细胞(亲本或表达用于靶向的表面标记物)进行皮下接种并且监测用PBS或突变体IL1-纳米抗体融合体处理的动物的肿瘤生长持续四周。

实施例7：IL18的原理的延伸：在肿瘤模型中的应用

为评估IL1家族成员的间接抗肿瘤活性，使用MethA同基因小鼠肉瘤模型根据先前用于证实IL-18的抗肿瘤活性的方案进行实验，以阐述所选突变体IL-18-纳米抗体融合体的功效(Micallef等人,1997)。这些实验中所用的IL18变体由融合至靶向具有杀肿瘤性质的免疫细胞(即CTL、NK细胞)的纳米抗体的突变体IL-18组成。将小鼠用构建体处理，并且当与模拟处理对照相比时注意到肿瘤显著减小。

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