抗病毒双链RNA及其温度敏感型凝胶制剂在治疗和预防HSV-1所致疾病中的应用

摘要

本发明公开了抗病毒双链RNA及其温度敏感型凝胶制剂在治疗和预防HSV-1所致疾病中的应用。本发明所提供的双链RNA，其一条链的序列为序列表中序列1，另一条链的序列为序列2；双链RNA的修饰物为将双链RNA经过2′氟代、2′甲氧基、硫代或2′脱氧化学修饰或胆固醇修饰得到的物质。实验证明，以双链RNA为活性成分的温度敏感型凝胶制剂抹于皮肤上，能抑制皮肤上皮细胞中外来的HSV-1的表达，从而能用于抑制HSV-1病毒的感染和和治疗HSV-1所致病变。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中抗病毒双链RNA及其温度敏感型凝胶制剂在治疗和预防HSV-1所致疾病中的应用。

背景技术

I型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染常常会导致口腔及生殖器黏膜产生疱疹和溃疡。人是HSV-1的唯一宿主，约80～90％的人群感染过HSV-1。HSV-1主要造成口腔炎和嘴唇的疱疹，但越来越多的研究发现，HSV-1也能导致生殖器疾病,而且是导致生殖器疾病更为常见的原因。一直以来,人们普遍认为70％以上的生殖器疱疹是由2型单纯疱疹病毒(HSV-2)引起的。根据近10年来流行病学的调查,由HSV-1感染而导致的生殖器疱疹,正在逐年增加。来自美洲、欧洲和亚洲的最新数据表明,HSV-1的感染已经成为导致生殖器疱疹的重要原因。当病毒DNA穿过核膜进入细胞核后，HSV-1infectedcellPolypeptide0(ICP0)最早被转录和翻译。成熟的ICP0进入细胞核后能结合多种及早期基因的启动子，以促进其基因表达。另外，ICP0还能通过抑制干扰素调节因子IRF3和IRF7的活性来抑制抗病毒细胞因子干扰素(IFN)的表达。为了促进HSV-1能顺利的复制，ICP0通过抑制RNAaseL的表达来抑制被病毒感染的细胞发生细胞凋亡过程。除此之外，在病毒感染后期，ICP0会出核进入细胞质和新合成的其他蛋白和病毒DNA一起组成新的病毒颗粒。ICP27是另一种极早期蛋白，它主要是参与调控病毒蛋白的转录，mRNA的出核过程。HSV-1的另一个重要蛋白是肌酐激酶(TK),它在病毒DNA的合成过程中其重要作用。此外，在病毒从潜伏期复发的过程中，TK是第一个被表达的基因，它可以促进其他极早期基因和早期基因的表达。目前用于临床治疗HSV-1感染性疾病的药物主要是口服核苷类药物，如阿昔洛韦。当阿昔洛韦进入细胞后首先必须被HSV-1的TK三磷酸化成有活性的形式才能发挥抑制病毒的复制的作用。根据研究表明，近年来临床上出现的HSV-1对阿昔洛韦有抗性的病例中正是由于TK基因的突变导致的。此外服用这些核苷类药物会产生多种副作用，如损害神经系统和消化系统。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何治疗和/或预防HSV-1所致疾病。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了双链RNA、所述双链RNA的修饰物或与所述双链RNA相关的生物材料在下述a1)或a2)中的应用：

a1)制备治疗和/或预防HSV-1所致疾病产品；

a2)治疗和/或预防HSV-1所致疾病；

所述双链RNA，名称为siRNA，其一条链的序列为序列表中序列1，另一条链的序列为序列2；

所述生物材料为下述B1)-B10)中的任一种：

B1)编码所述双链RNA的DNA分子或cDNA分子；

B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；

B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述DNA分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系。

上述应用中，所述双链RNA的修饰物可为将所述双链RNA经过2′氟代、2′甲氧基、硫代或2′脱氧化学修饰或胆固醇修饰得到的物质。

上述应用中，所述双链RNA的修饰物可为对所述双链RNA的U和C进行2′甲氧基修饰得到的物质，其中A和G均未被修饰。

上述应用中，B2)所述的含有编码所述双链RNA的DNA分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达dsRNA21的DNA，该DNA不但可包括启动所述双链RNA转录的启动子，还可包括终止所述双链RNA转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述双链RNA表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述应用中，所述转基因动物细胞系不包括繁殖材料。

上述应用中，所述HSV-1所致疾病可为口腔和/或生殖器疱疹和/或溃疡。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述双链RNA、所述双链RNA的修饰物或所述生物材料在下述b1)、b2)、b3)或b4)中的应用：

b1)制备抑制HSV-1复制产品；

b2)抑制HSV-1复制；

b3)制备抑制HSV-1的基因表达产品；

b4)抑制HSV-1的基因表达。

上述应用中，所述HSV-1的基因可为HSV-1的ICP0基因、ICP27基因和/或TK基因。

为解决上述技术问题，本发明还提供了利用所述双链RNA、所述双链RNA的修饰物或所述生物材料制备的温度敏感型凝胶制剂在前文所述a1)、所述a2)、所述b1)、所述b2)、所述b3)或所述b4)中的应用。

上述应用中，所述温度敏感型凝胶制剂对温度敏感，可在环境温度发生变化时凝固和/或熔化。所述温度敏感型凝胶制剂可包括所述双链RNA、所述双链RNA的修饰物或所述生物材料与温度敏感型凝胶；

所述温度敏感型凝胶可由泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、聚乙二醇-PLGA嵌段共聚物、纤维素衍生物和胶原蛋白中的一种或两种以上任意组合制备得到。所述温度敏感型凝胶在制备的过程中，可添加制备温度敏感型凝胶所需的辅料。所述泊洛沙姆188的浓度为50-350mg/ml，所述泊洛沙姆407的浓度为100-500mg/ml，所述聚乙二醇-PLGA嵌段共聚物的浓度为100-350mg/ml，所述纤维素衍生物的浓度为1-300mg/ml。所述的纤维素衍生物选自甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素中的一种或两种以上任意组合。所述胶原蛋白的浓度为50-100mg/ml，所述胶原蛋白选用鱼皮和/或猪皮提取的胶原蛋白。所述温度敏感型凝胶以水为溶剂。

上述应用中，所述温度敏感型凝胶制剂还可包括体内转染试剂，所述体内转染试剂可为mPEG-PCL-PPEEA、聚乙烯亚胺、线性聚乙烯亚胺、脂质体、转铁蛋白或叶酸。

上述应用中，所述温度敏感型凝胶中还可添加有增溶剂，所述增溶剂选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇、环糊精类、十二烷基硫酸钠和聚山梨酯类中的一种或两种种以上任意组合。其中乙醇的浓度可为50-350mg/ml，丙二醇的浓度可为50-350mg/ml，聚乙二醇的浓度可为100-350mg/ml，环糊精类的浓度可为10-360mg/ml，十二烷基硫酸钠的浓度可为5-50mg/ml，聚山梨酯类的浓度可为5-50mg/ml；所述聚乙二醇为选自PEG300、PEG400和PEG600中的一种或两种以上任意组合；所述环糊精类为选自α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精中的一种或两种以上任意组合；所述聚山梨酯类为选自吐温-80，吐温-60，吐温-85，吐温-40，吐温-20的一种或两种以上任意组合。

为了改善所述温度敏感型凝胶的口味，所述温度敏感型凝胶中可包括浓度为0.1-550mg/ml的矫味剂；所述矫味剂为选自蔗糖，山梨醇、甘露醇、木糖醇、丙二醇、甘油、薄荷油、薄荷脑、桔子香精和香蕉香精中一种或一种以上任意组合。

所述温度敏感型凝胶制剂的pH值为5.0-9.0；pH调节用试剂可为三乙醇胺和/或氢氧化钠和/或氢氧化钾。

上述试剂均可从Sigma等试剂公司购买。

所述温度敏感型凝胶制剂还可以包含其它药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的凝胶和双链核酸分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在抑制基因表达方面的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的其他例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如甘油、甘露糖醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等，其中较佳的载体选自生理盐水、甘油和磷酸盐缓冲盐水。

在一个优选实施例中，所述“药学上可接受的载体”是指体内转染试剂，如聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-b-PCL-b-PPEEA)，如聚乙烯亚胺(PEI)，jetPEI(线性聚乙烯亚胺)，脂质体，转铁蛋白，叶酸等。

所述温度敏感型凝胶制剂以蒸馏水为溶剂。

所述温度敏感型凝胶制剂中，所述小核酸的含量为2.25-340μg/ml，优选40-340μg/ml，最优选85-340μg/ml或40-95μg/ml或85-95μg/ml；温度敏感型凝胶的体积百分比浓度为75-90％。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述双链RNA、所述双链RNA的修饰物、所述生物材料或所述温度敏感型凝胶制剂。

本发明中，所述产品可为药物。

实验证明，本发明的双链RNA、双链RNA的修饰物及双链RNA的修饰物与温度敏感型凝胶混合制成的温度敏感型凝胶制剂可以抑制HSV-1的复制及HSV-1中基因的表达，进一步可以抑制HSV-1所导致的疾病。发明人在实验中发现本发明的温度敏感型凝胶制剂，能大幅度的增加小核酸的转染效率，并且小核酸不容易降解，药效增强。表明，可利用本发明的双链RNA、双链RNA的修饰物及其相关的温度敏感型凝胶制剂治疗HSV-1所导致的疾病。

本发明将双链RNA的修饰物与温度敏感型凝胶混合制成小核酸温度敏感型凝胶制剂，具有如下优点：

1)室温下为液态，能涂抹于皮肤上，接触体温3-5分钟后，在皮肤粘膜表面形成厚度均匀的凝胶膜，该凝胶机械强度大，凝胶体系不易溃塌，生物黏附性强，可牢固黏附于腔道粘膜持续时间长，并保持适当的湿润度，使制剂中的小核酸或质粒DNA能在转染试剂的辅助下进入皮肤粘膜的细胞。通过调节温度敏感型凝胶的配方，可改变凝胶中孔隙的大小，起到分子筛的作用，小分子的小核酸能自由进出，而大分子的蛋白酶难以进入凝胶，从而保护小核酸不被降解，小核酸的化学修饰也进一步增强了小核酸的稳定性。

2)温度敏感型凝胶制剂根据其组方的调整可制备出不同的凝胶温度,通常情况该凝胶在室温为液态，不同的温度状态可满足不同的部位及临床需求,本制剂技术可使临床上达到给药方便，患者使用到病变部位分散效果好，可如水一样渗透到体内指定腔道。

本发明所提供的小核酸温度敏感型凝胶制剂在体外实验中能抑制HSV-1ICP0的表达，单纯疱疹病毒(HSV-1)的复制，及多个HSV-1病毒基因的表达，包括HSV-1ICP27及HSV-1TK的表达。本发明所提供的小核酸温度敏感型凝胶制剂在体外实验中能抑制HSV-1感染所致的细胞病变。用所述小核酸温度敏感型凝胶制剂抹于皮肤上，能抑制皮肤上皮细胞中外来的HSV-1的表达，从而能用于抑制HSV-1病毒的感染和和治疗HSV所致病变。

作为新型小核酸类的药物，化学合成并修饰的所述寡聚核酸不易被降解，有较长的效应半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。另外，小核酸与温度敏感型凝胶混合制成小核酸温度敏感型凝胶制剂，能大幅度的增加小核酸的转染效率，并且小核酸不容易降解，药效增强。

附图说明

图1为本发明的小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制HSV-1ICP0的表达。A:mRNA水平；B:蛋白质水平。

图2为本发明的小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制单纯疱疹病毒(HSV-1)的复制。A:蚀斑实验；B:免疫荧光实验

图3为小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制对其他HSV-1病毒基因表达的影响。A:mRNA水平；B:蛋白水平。

图4为小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制HSV-1感染所致的细胞病变。

图5为小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制HSV-1病毒的感染和和治疗HSV-1所致病变的效果图。在治疗第3天和第6天,小核酸温度敏感型凝胶制剂治疗组(SI组)皮肤损伤明显改善，而阴性对照组(NC组)还有明显皮肤损伤。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的线性聚乙烯亚胺(Jet-PEI)为北京达科为生物技术有限公司产品，产品目录号为PT-201-10G。

下述实施例中的C57小鼠为广东省医学实验动物中心产品。

实施例1、本发明小核酸的制备

本发明的小核酸为人工合成，序列如下：

siRNA：其正义链序列为序列表中序列1(5'GCCCAGAGGUUCCUCUUUA3')，其反义链序列为序列表中序列2(5'UAAAGAGGAACCUCUGGGC3')；该双链核酸在U和C碱基上采用2′甲氧基修饰。

实施例2、温度敏感型凝胶的制备及其效果检测

一、温敏感型凝胶的制备

温敏感型凝胶的组分及其浓度：

二、按照上述组分浓度配制小核酸温度敏感型凝胶，具体方法如下所述：

1)称取170.0g泊洛沙姆407与2.0g羟丙基甲基纤维素(HPMCE-50lv，上海卡乐康公司，LotNo:TK16012401)，加入蒸馏水500ml(4℃左右)，搅拌5min，置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解，得亲水凝胶的澄明溶液。

2)取5.0g胶原蛋白(购自湖北康宝泰精细化工有限公司)加入蒸馏水50ml,室温,搅拌5min,放置等用。

3)取10.0gHP-β-CD加入100ml蒸馏水溶解，加热至50℃溶胀等待用。

4)取207.5g1，2-丙二醇加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀，在搅拌状态下，将步骤2)、3)的溶液缓缓加入，搅拌混合均匀，用蒸馏水定容至1L，搅拌混匀，用氢氧化钠调节pH值至6.80，120℃灭菌30min，冷却至4℃，将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml)，即得温度敏感型凝胶。

三、温度敏感型凝胶的效果实验

温度敏感型凝胶的胶凝温度的测定：量取10份按照步骤1制备的温度敏感型凝胶样品5ml，于西林瓶中，将温度计插入凝胶溶液中，置水浴中缓缓加温，升温速率约为每1-2min升高1℃。将西林瓶倾斜90度，观察内容物不流动时的温度，即定义为胶凝温度。每个样品平行测定三次，结果取其平均值。测得其平均胶凝温度为34.7±0.2℃。

实施例3、温度敏感型凝胶的制备及其效果检测

一、温度敏感型凝胶的制备

温度敏感型凝胶的组分及其浓度：

二、配制上述组分浓度温度敏感型凝胶，具体方法如下所述：

1)称取170.0g泊洛沙姆407与5.0g甲基纤维素，加入蒸馏水500ml(4℃左右)，搅拌5min，置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解，得亲水凝胶的澄明溶液。

2)取5.0g胶原蛋白加入蒸馏水50ml,室温,搅拌5min,放置等用。

3)取20.0gHP-β-CD加入200ml蒸馏水溶解，加热至50℃溶胀等待用。

4)取207.5g1，2-丙二醇加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀，在搅拌状态下，将步骤2)、3)的溶液缓缓加入，搅拌混合均匀，用蒸馏水定容至1L,用氢氧化钠调节pH值至8.10，120℃灭菌30min，冷却至4℃，将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml)，即得温度敏感型凝胶。

三、温度敏感型凝胶的效果实验

按照实施例1中步骤2的步骤1)的方法测定步骤1制备的温度敏感型凝胶的胶凝温度，结果表明骤1制备的温度敏感型凝胶的胶凝温度胶凝温度为34±1℃。

实施例4、温度敏感型凝胶的制备及其效果检测

温度敏感型凝胶的制备

一、温度敏感型凝胶的组分及其浓度：

二、配制上述组分浓度小核酸温度敏感型凝胶，具体方法如下所述：

1)称取170.0g泊洛沙姆407，加入蒸馏水500ml(4℃左右)，搅拌5min，置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解，得亲水凝胶的澄明溶液。

2)取25.0gHP-β-CD加入200ml蒸馏水溶解，加热至50℃溶胀等待用。

3)取155.63g1，2-丙二醇加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀，在搅拌状态下，将步骤2)的溶液缓缓加入，搅拌混合均匀，用蒸馏水定容至1L，搅拌混匀，用氢氧化钠调节pH值至7.90，120℃灭菌30min，冷却至4℃，将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml)，即得温度敏感型凝胶。

三、小核酸温度敏感型凝胶的效果实验

按照实施例1中步骤2的步骤1)的方法测定步骤1制备的小核酸温度敏感型凝胶的胶凝温度，结果表明骤1制备的小核酸温度敏感型凝胶的胶凝温度胶凝温度为34±1℃。

实施例5、温度敏感型凝胶的制备及其效果检测

一、温度敏感型凝胶的组分及其浓度：

处方组成：

二、配制上述组分浓度温度敏感型凝胶，具体方法如下所述：

1)称取160.0g泊洛沙姆407，加入蒸馏水500ml(4℃左右)，搅拌5min，置于4℃条件下使其充分溶胀、分散均匀、溶解，得亲水凝胶的澄明溶液。

2)取甲基纤维素(MC)5.0g/L与十二烷基硫酸钠10g/L加入蒸馏水200ml，加热至50℃溶解。

3)取103.75g1，2-丙二醇、30g甘油加入步骤1)制得的凝胶溶液中搅拌混合均匀，在搅拌状态下，将步骤2)的溶液缓缓加入，搅拌混合均匀，用蒸馏水定容至1L，搅拌混匀，用氢氧化钠调节pH值至6.80，120℃灭菌30min，冷却至4℃，将其分装于灭菌处理容器中(每瓶5ml)，即得温度敏感型凝胶。

三、温度敏感型凝胶的效果实验

按照实施例1中步骤2的步骤1)的方法测定步骤1制备的温度敏感型凝胶的胶凝温度，结果表明骤1制备的温敏凝胶的胶凝温度胶凝温度为35±1℃。

实施例6、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制HSV-1ICP0的表达

一、小核酸温度敏感型凝胶制剂的制备

按照下述方法制备小核酸温度敏感型凝胶制剂：

1)将siRNA溶解于无RNA酶的无菌水中，配成siRNA浓度为0.27μg/μl的小核酸溶液。

2)将50μl步骤1)的小核酸溶液加入75μl的10％(质量百分含量)的葡萄糖溶液中，然后用25μl的无RNA酶的无菌水补充体积到150μl，得到溶液1；将2μl的线性聚乙烯亚胺(Jet-PEI)加入73μl的10％(质量百分含量)的葡萄糖溶液中，然后用75μl的无RNA酶的无菌水补充体积到150μl，得到溶液2。将溶液1与溶液2混合后于室温静置15分钟，得到300μl的小核酸jet-PEI混合液。

3)将步骤2)得到的小核酸jet-PEI混合液和实施例3的温度敏感型凝胶按1：9的体积比充分混匀得到小核酸温度敏感型凝胶制剂(将其称为siRNA凝胶制剂1)。该小核酸温度敏感型凝胶制剂中siRNA核酸含量为4.5μg/ml。

制备只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂(将其称为siCRTL凝胶制剂1)作为阴性对照，随机序列小核酸：Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAATT。

二、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制HSV-1ICP0的表达。

实验重复三次：

将siRNA凝胶制剂1加入细胞培养皿中，37度放5分钟，使凝胶凝固。将HeLa细胞(昆明细胞库,保藏编号为KCB86019YJ)接种到凝胶表面，每个6孔板孔加入40万个细胞，用1.5mlDMEM/10％FBS培养，24小时后接种HSV-1(中国科学院武汉病毒研究所)，4小时后收集细胞，提取总RNA和蛋白，分别进行RT-PCR检测和westernbotting检测。RT-PCR引物为HSV-1-ICP0primer：Forward:CCCACTATCAGGTACACCAGCTT，Reverse:CTGCGCTGCGACACCTT。westernbotting检测的抗体为抗HSV-1ICP0抗体(Abcam(ab6513))和抗beta-actin抗体(Proteintech(60008-1-Ig))。

PCR反应条件：94℃，5分钟预变性，94℃30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环，72℃延伸10分钟。

结果如图1所示，与只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂(siCRTL凝胶制剂1)相比，本发明所研发的小核酸温度敏感型凝胶制剂(siRNA凝胶制剂1)能有效的抑制HSV-1ICP0的表达(图1中A和B)。图1中siRNA为siRNA凝胶制剂1，siCTRL为siCRTL凝胶制剂1。

实施例7、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制单纯疱疹病毒(HSV-1)的复制

按实施例6的步骤一中所描述的方法配制小核酸温度敏感型凝胶制剂(将其称为siRNA凝胶制剂2)，小核酸jet-PEI混合液与温度敏感型凝胶的比例为1：9(体积比)，温度敏感型凝胶使用实施例4制备的温度敏感型凝胶。该小核酸温度敏感型凝胶制剂中的为siRNA，浓度为4.5μg/ml。按照上述方法制备只含实施例6中随机序列寡聚核酸的凝胶制剂(将其称为siCRTL凝胶制剂2)作为阴性对照。

蚀斑实验，实验重复三次：将本实施例的siRNA凝胶制剂2加入细胞培养皿中，37度放5分钟，使凝胶凝固。再将HeLa(昆明细胞库,保藏编号为KCB86019YJ)接种到凝胶表面，每个6孔板孔加入40万个细胞，用1.5ml添加终质量百分比10％FBS的DMEM培养基培养，24小时后用HSV-1病毒(毒株名：hsvlsz2055，保有编号：hsvlsz2055，深圳市疾病预防控制中心)感染细胞，24小时后收集上清液，将其称为上清A。向培养贴壁的Vero细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)中加入收集的上清A100μl，孵育1小时后，加入0.6％的琼脂，37℃孵育2天，可以肉眼看到小而白的斑点(该斑点即为噬斑(图2中A)。计算单个明显可辨的噬斑来检测滴度(见表1)。

结果如图2中A和表1所示，结果表明，本实施例的siRNA凝胶制剂2明显抑制HSV-1病毒的繁殖。图2中siRNA为siRNA凝胶制剂2，siCTRL为siCRTL凝胶制剂2。

表1.滴度检测结果

siRNA凝胶制剂siCRTL凝胶制剂斑点计数14101病毒滴度1.4×10⁶1.0×10⁷

免疫荧光实验，实验重复三次：将本实施例的siRNA凝胶制剂2加入细胞培养皿中，37度放5分钟，使凝胶凝固。再将HeLa(昆明细胞库,保藏编号为KCB86019YJ)接种到凝胶表面，每个6孔板孔加入40万个细胞，用1.5ml添加终质量百分比10％FBS的DMEM培养基培养，24小时后用HSV-1病毒(毒株名：hsvlsz2055，保有编号：hsvlsz2055，深圳市疾病预防控制中心)感染细胞。感染12小时细胞经固定后加入抗HSV-1表面糖蛋白的抗体(Abcam,ab9533))孵育1小时后加入二抗，再孵育1小时后在荧光显微镜下观看。

结果如图2中B所示，结果表明，本实施例的siRNA凝胶制剂2明显抑制HSV-1病毒的繁殖。图2中siRNA为siRNA凝胶制剂2，siCTRL为siCRTL凝胶制剂2。

实施例8、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制HSV-1病毒其他基因的表达

一、小核酸温度敏感型凝胶制剂的制备

将实施例7的siRNA凝胶制剂2加入细胞培养皿中，37度放5分钟，使凝胶凝固。将HeLa细胞(昆明细胞库,保藏编号为KCB86019YJ)接种到凝胶表面，每个6孔板孔加入40万个细胞，用1.5mlDMEM/10％FBS培养，24小时后接种HSV-1(中国科学院武汉病毒研究所)，4小时后收集细胞，提取总RNA和蛋白，分别进行RT-PCR检测和westernbotting检测。RT-PCR引物为HSV-1ICP27：Forward:CGATGACTTACTGGCGGGTGT，Reverse:GCGTCGGTCACGGCATAA；HSV-1TKprimer：Forward:CGATGACTTACTGGCGGGTGT，Reverse:GCGTCGGTCACGGCATAA。westernbotting所用抗体为抗HSV-1ICP27抗体(Abcam(ab31631))、抗HSV-1TK抗体(SantaCrμz(sc-28037))和抗beta-actin抗体(Proteintech(60008-1-Ig))。用实施例7的siCRTL凝胶制剂2作为对照。

PCR反应条件：94℃，5分钟预变性，94℃30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行30个循环，72℃延伸10分钟。

结果如图3所示，与只含随机序列寡聚核酸的凝胶制剂(siCRTL凝胶制剂2)相比，本发明所研发的小核酸温度敏感型凝胶制剂(siRNA凝胶制剂2)能有效的抑制HSV-1ICP27和TK基因的表达(图3中A和B)。图3中siRNA为siRNA凝胶制剂2，siCTRL为siCRTL凝胶制剂2。

实施例9、小核酸温度敏感型凝胶制剂抑制HSV-1病毒所致的细胞病变

按实施例6的步骤一中所描述的方法配制小核酸温度敏感型凝胶制剂(将其称为siRNA凝胶制剂3)，小核酸jet-PEI混合液与温度敏感型凝胶的比例为1：9(体积比)，温度敏感型凝胶使用实施例5制备的温度敏感型凝胶。该小核酸温度敏感型凝胶制剂中的为siRNA，浓度为4.5μg/ml。按照上述方法制备只含实施例6中随机序列寡聚核酸的凝胶制剂(将其称为siCRTL凝胶制剂3)作为阴性对照。

将siRNA凝胶制剂3加入细胞培养皿中，37度放5分钟，使凝胶凝固。再将HeLa细胞(昆明细胞库,保藏编号为KCB86019YJ)接种到凝胶表面，每个6孔板孔加入40万个细胞，用1.5ml添加终质量百分比10％FBS的DMEM培养基培养，24小时后用HSV-1病毒(毒株名：hsvlsz2055，保有编号：hsvlsz2055，深圳市疾病预防控制中心)感染细胞，24小时后用显微镜下拍照Hela细胞。

结果如图4所示，在siCRTL凝胶制剂3组，细胞经病毒感染后，会出现死亡及溶合，与只含转染随机序列的阴性对照凝胶制剂相比，小核酸温度敏感型凝胶制剂(siRNA凝胶制剂3)明显抑制HSV-1病毒所致的细胞病变。

实施例10、小核酸温度敏感型凝胶制剂可以抑制HSV-1病毒的感染和治疗HSV-1所致病变

一、小核酸温度敏感型凝胶制剂的制备

按照下述方法制备小核酸温度敏感型凝胶制剂：

1)将siRNA溶解于无RNA酶的无菌水中，配成siRNA浓度为0.27μg/μl的小核酸溶液。

2)将17.5μl步骤1)的小核酸溶液加入17.5μl的10％(质量百分含量)的葡萄糖溶液中，然后用无RNA酶的无菌水补充体积到35μl，得到溶液3；将8.7μl的线性聚乙烯亚胺(Jet-PEI)加入17.5μl的10％(质量百分含量)的葡萄糖溶液中，然后用无RNA酶的无菌水补充体积到35μl，得到溶液4。将溶液3与溶液4混合后于室温静置15分钟，得到小核酸jet-PEI混合液。

3)将步骤2)得到的小核酸jet-PEI混合液和实施例2的温度敏感型凝胶按1：6的体积比充分混匀得到小核酸温度敏感型凝胶制剂(将其称为siRNA凝胶制剂4)。该小核酸温度敏感型凝胶制剂中siRNA核酸含量为81.63μg/ml。

按照上述方法制备只含实施例6中随机序列寡聚核酸的凝胶制剂(将其称为siCRTL凝胶制剂4)作为阴性对照。

二、小核酸温度敏感型凝胶制剂治疗HSV-1所致的皮肤粘膜损伤

实验重复三次：

每只C57小鼠于胸正中部接种10⁵感染复数的HSV-1。待出现病变后分成实验组和对照组，每组2只。用siRNA凝胶制剂4涂抹实验组有皮损的表面皮肤,每天进行一次涂抹，共涂抹3次。用siCRTL凝胶制剂4涂抹对照组有皮损的表面皮肤,每天进行一次涂抹，共涂抹3次。对比各组的病变变化情况，涂抹了siRNA凝胶制剂4(图5中SI组)的病变恢复情况要明显好于涂抹了siCRTL凝胶制剂4的阴性对照NC组(图5中NC组)。图5中标出了治疗3天后和治疗6天后的皮肤病变情况，1和2均为小鼠编号，在治疗第3天和第6天,小核酸温度敏感型凝胶制剂治疗组(SI组)皮肤损伤明显改善，而阴性对照组(NC组)还有明显皮肤损伤。结果可见经过涂抹小核酸温度敏感型凝胶制剂能明显加速皮病变的恢复，缩短HSV-1感染所致的皮肤粘膜损伤病程。