法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-12-31
授权
授权
2016-06-22
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P17/04 申请日:20160315
实质审查的生效
2016-05-25
公开
公开
技术领域
本发明生物化学分离合成技术领域,特别涉及一种间接制备D-异抗坏血酸钠的方法。
背景技术
D-异抗环血酸(Erythorbicacid,EA),又名赤藻糖酸或阿拉伯抗坏血酸,是L-抗坏血酸钠的一种旋光异构体,简称异Vc。D-异抗环血酸及其钠盐(Sodiumerythorbate,EN)具有很强的还原性,防腐抗氧的效果大大优于维生素C,对热的稳定性也比维生素C强,而价格只有维生素C的1/2。异抗坏血酸及其钠盐是安全、有效的食品添加剂,广泛应用于各类食品中。异抗坏血酸钠为白色或微黄色针状晶体,无臭,味略咸,在空气中较稳定,遇光色渐变暗,在水中易溶,在甲醇、已醇中微溶解。D-异抗坏血酸钠的制备方法主要有间接发酵法、直接发酵法和酶法。目前工业生产上采用间接发酵法即发酵与合成相结合进行生产。
2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconicacid,2-KGA)是食品添加剂(抗氧化剂)D-异抗坏血酸及其钠盐工业化生产过程中的关键中间体。2-KGA分子式为C6H10O7,分子量为194。2-KGA外观上为白色细微结晶体,稍带咸味,无嗅,易溶于水且水溶液略显酸性,具有旋光性,其比旋光度为[α]25D=-88°。2-KGA的产生菌分布较为广泛,多数菌株为野生型,分属于假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(serratia)和醋酸杆菌属(Acetobacter)。
目前国内外2-KGA生产菌通常采用假单胞菌属的菌株,该种菌株的发酵液经过酯化等处理得到的D-异抗坏血酸钠得率和纯度较低。开发一种D-异抗坏血酸钠得率高且纯度高的方法意义重大。
申请公布号为“CN104830712A”的中国发明专利“一种产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌株”公开了采用粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SDSPY-136菌株发酵产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为N0.10548,保藏时间:2015年2月9日。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明提供了一种采用产高纯度2-酮基-D-葡萄糖酸的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SDSPY-136菌株的发酵液制备D-异抗环血酸的方法。
本发明的技术方案为:
一种间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法,以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SDSPY-136菌株的发酵液为原料,经发酵液预处理、2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯化反应、转换反应得D-异抗坏血酸粗钠盐;再经精制纯化得D-异抗坏血酸钠产品;所述粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SDSPY-136菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏编号为CGMCCNo:10548,其保藏时间为:2015年2月9日。
作为优选方案,所述间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法,具体步骤为:
1)菌种发酵
按照8-12%的接种量将所述粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SDSPY-136菌株的种子液接种到发酵培养基中,在29-31℃、400-600r/min条件下发酵培养30-40h,得到2-酮基-D-葡萄糖酸发酵液;
2)发酵液预处理
所述2-酮基-D-葡萄糖酸发酵液离心后所得清夜中加入浓硫酸,然后在50-95℃的水浴条件下,向酸化后的清夜中加入活性炭,搅拌脱色;脱色后滤除活性炭,所得滤液过阳离子交换树脂柱,由阳离子交换树脂柱除杂后收集的处理液减压蒸馏,得固形物含量为70-90%得2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液;
3)甲酯化反应
向所述2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液中加入甲醇,并以硫酸作为催化剂,于60-100℃反应5-10h,反应完毕,浓缩、4℃下结晶,抽滤并烘干得2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐;
4)转化反应
将所述2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐加入甲醇中溶解,然后加入甲醇-氢氧化钠混合液,在55-70℃下,反应13-20min,然后于4℃下放置结晶,抽滤得D-异抗坏血酸粗钠盐;
5)D-异抗坏血酸钠的精制
所得D-异抗坏血酸粗钠盐溶于水中,加入活性炭和草酸,加热至50-70℃,保温搅拌3-8min,然后趁热抽滤得滤液;所得滤液冷却、结晶、抽滤并用90-100%乙醇洗涤后干燥得D-异抗坏血酸钠产品。
作为优选方案,步骤1)中获得种子液所用的种子培养基组成为蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、牛肉膏3g/L,pH值为7.0;所述发酵培养基组成为葡萄糖180g/L、玉米浆9.01g/L、硫酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.4g/L、氯化锰0.037g/L、硫酸亚铁0.036g/L、碳酸钙65g/L。
作为优选方案,步骤2)中活性炭的加入量为固形物含量的5-15%,脱色时间至少为0.5h。
作为优选方案,步骤2)中,所述阳离子交换树脂柱为732#阳离子交换树脂柱,所述阳离子交换树脂柱高径比为9:1-10:1,流速每小时1-1.1倍柱体积。
作为优选方案,步骤3)中甲醇的加入量满足:每克2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液中加入5-1.5mL甲醇。
作为优选方案,步骤4)中,2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中甲醇的加入量满足:每克2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中加入10-10.5mL甲醇;甲醇-氢氧化钠混合液的加入量满足:每克2-酮基-D-葡萄糖酸甲酯盐中加入4-4.5mL甲醇-氢氧化钠混合液。
作为优选方案,步骤5)中,活性炭和草酸的加入量均为固形物含量的0.5%-0.7%。
本发明的有益效果:
本发明以粘质沙雷氏菌为生产菌种发酵得到2-酮基-D-葡萄糖酸钙,结合多种除杂方式,将处理液转化合成D-异抗坏血酸钠,得到的发酵液2-酮基-D-葡萄糖酸产量高、转化率高,D-异抗坏血酸钠粗品纯度高,易于精制,总收率得到提高,具有良好的推广应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例1得到的D-异抗坏血酸钠样品;
图2为本发明实施例1得到的D-异抗坏血酸钠样品液相色谱图;
图3为标准D-异抗坏血酸钠样品液相色谱图。
粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)SDSPY-136菌株,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院,保藏编号为N0.10548,保藏时间:2015年2月9日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,但本发明不仅限于此。
种子培养基组成为:蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L、牛肉膏3g/L,pH值为7.0。
发酵培养基组成为:葡萄糖180g/L、玉米浆9.01g/L、硫酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.4g/L、氯化锰0.037g/L、硫酸亚铁0.036g/L、碳酸钙65g/L。
实施例1
间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法,具体步骤为:
1)菌种发酵
将粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)CGMCCN0.10548菌株移接斜面活化。
按上述液体种子培养基的组成配制种子培养基,500ml三角瓶装液量为50ml,121℃蒸汽灭菌20分钟,冷却至室温,接种斜面菌种2环,置旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上,30℃培养12小时,得种子液,取种子液置600nm测吸光值为0.262;
以5L发酵罐按3L装液量配制发酵培养基,调整pH7.0,115℃实罐灭菌20分钟,循环水冷却至30℃后接种培养好的种子液300ml,接种后立即取样测定葡萄糖浓度为185g/L。
初始发酵罐参数设置为:搅拌转速为350r/min,通气量0.7~0.8Nm3/h,罐内压力0.065MPa。发酵过程中控制发酵温度30±0.2℃,通过调节搅拌转速和通气量控制溶解氧为35%。
发酵过程中每4小时取样,测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量及菌体浓度,当葡萄糖含量低于10g/L时,每2小时取样测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量,至发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量不再增加时结束发酵,发酵周期为36小时。
发酵结束后取发酵液以4000r/min离心10分钟,取上清液测定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸的含量分别为0.02g/L、188.9g/L,葡萄糖转化生成2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率为102.11%。
2)发酵液的预处理
发酵液离心后测定Ca2+含量为0.66mol/L,加入0.66mol/L的浓硫酸,使Ca2+转化为硫酸钙沉淀下来,离心后得到酸化清液2.7L;固形物含量19.2%,于80℃水浴条件下,加入占固形物含量5%的活性炭,不断搅拌,脱色0.5h,脱色后抽滤;滤液经732#阳离子交换树脂,流出液3.1L;将经柱子除杂收集到的处理液于55℃进行减压浓缩,浓缩至固形物含量为80%,共501.3g。
3)甲酯化反应
取100g2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液,加入500ml甲醇,以浓硫酸作催化剂,于80℃水浴下反应7h,并向反应器中补充甲醇。浓缩后于4℃放置,经抽滤后,用甲醇清洗,洗液并入清液中。沉淀于40℃烘干,即得甲酯盐64.12g。
4)转化反应
将60g甲酯盐加入到600ml甲醇溶液中,搅拌使其完全溶解,加入甲醇-NaOH溶液250ml,65℃水浴下反应17min,于4℃放置一段时间后抽滤,得粗钠盐50.82g,纯度为98.1%。其中,甲醇--NaOH溶液中甲醇与氢氧化钠的质量比为10:1。
5)D-异抗坏血酸钠精制
将50.5g粗钠盐溶于水中,加入0.3g草酸及0.3g活性炭,水浴保温至60℃,保温搅拌5min,趁热抽滤得滤液150ml。经冷却结晶、抽滤,95%乙醇洗涤晶体,50℃干燥,制得D-异抗坏血酸钠产品48.82g,得率为95.6%,纯度为99.5%。将产品进行液相分析,表明产物为异抗坏血酸钠。
实施例2
间接制备D-异抗坏血酸钠的制备方法,具体步骤为:
1)菌种发酵
将粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)CGMCCN0.10548菌株移接斜面活化。
按上述液体种子培养基的组成配制种子培养基,500ml三角瓶装液量为50ml,121℃蒸汽灭菌20分钟,冷却至室温,接种斜面菌种2环,置旋转转速为200r/min、旋转半径为40mm的摇床上,30℃培养12小时,得种子液,取种子液置600nm测吸光值为0.265;
以10L发酵罐按7L装液量配制发酵培养基,调整pH7.0,115℃实罐灭菌20分钟,循环水冷却至30℃后接种培养好的种子液700ml,接种后立即取样测定葡萄糖浓度为180g/L。
初始发酵罐参数设置为:搅拌转速为350r/min,通气量0.8~0.9Nm3/h,罐内压力0.065MPa。发酵过程中控制发酵温度30±0.2℃,通过调节搅拌转速和通气量控制溶解氧为35%。
发酵过程中每4小时取样,测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量及菌体浓度,当葡萄糖含量低于10g/L时,每2小时取样测定发酵液中葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸含量,至发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量不再增加时结束发酵,发酵周期为35小时。
发酵结束后取发酵液以4000r/min离心10分钟,取上清液测定葡萄糖、2-酮基-D-葡萄糖酸的含量分别为0.03g/L、183.12g/L,葡萄糖转化生成2-酮基-D-葡萄糖酸的转化率为101.73%。
2)发酵液的预处理
发酵液离心后测定Ca2+含量为0.67mol/L,加入0.67mol/L的浓硫酸,使Ca2+转化为硫酸钙沉淀下来,离心后得到酸化清液6.5L;固形物含量19.5%,于80℃水浴条件下,加入占固形物含量5%的活性炭,不断搅拌,脱色0.5h,脱色后抽滤;滤液经732#阳离子交换树脂柱,流出液7.2L;将经柱子除杂收集到的处理液于55℃进行减压浓缩,浓缩至固形物含量为79.5%,共1.1kg。
3)甲酯化反应
取100g2-酮基-D-葡萄糖酸浓缩液,加入500ml甲醇,以浓硫酸作催化剂,于80℃水浴下反应7h,并向反应器中补充甲醇。浓缩后于4℃放置,经抽滤后,用甲醇清洗,洗液并入清液中。沉淀于40℃烘干,即得甲酯盐64.10g。
4)转化反应
将60g甲酯盐加入到600ml甲醇溶液中,搅拌使其完全溶解,加入甲醇-NaOH溶液250ml,65℃水浴下反应17min,于4℃放置一段时间后抽滤,得粗钠盐50.93g,纯度为98.0%。其中,甲醇--NaOH溶液中甲醇与氢氧化钠的质量比为9:1。
5)D-异抗坏血酸钠精制
将50.0g粗钠盐溶于水中,加入0.3g草酸及0.3g活性炭,水浴保温至60℃,保温搅拌5min,趁热抽滤得滤液155ml。经冷却结晶、抽滤,95%乙醇洗涤晶体,50℃干燥,制得D-异抗坏血酸钠产品48.79g,得率为96.1%,纯度为99.6%。将产品进行液相分析,表明产物为异抗坏血酸钠。
对比例1
将粘质沙雷氏菌(SerratiamarcescensSDSPY-136)的发酵液替换为假单胞菌属的菌株的发酵液,其余同实施例1。
该对比例D-异抗坏血酸钠的得率为90.2,纯度为93.3。
对比例2
删除步骤2)中“滤液经732#阳离子交换树脂柱”的操作,将滤液直接浓缩,其余与实施例1相同。
该对比例D-异抗坏血酸钠的得率为85.2%,纯度为90.1%。
对比例3
步骤5)中,D-异抗坏血酸粗钠盐溶于水后,仅加入0.3g活性炭,而不加入草酸;其余与实施例1相同。
该对比例D-异抗坏血酸钠的得率为87.3%,纯度为91.8%。
上述葡萄糖按下述方法测定:
使用山东省科学院生物研究所生产的SBA-4D型膜生物反应器测定。测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶膜专一测定葡萄糖含量。
上述2-酮基-D-葡萄糖酸按下述方法测定:
使用碘量法测定。测定原理是:2-酮基-D-葡萄糖酸分子内含有可直接发生酯化反应的羧基和醇羟基,还含有可发生互变异构反应的羰基,在强酸性条件下加热2-酮基-D-葡萄糖酸水溶液可以将其定量转化为D-异抗坏血酸。利用D-异抗坏血酸与I2的氧化还原反应可以定量测定D-异抗坏血酸的质量浓度,然后换算成2-酮基-D-葡萄糖酸的质量浓度。
上述2-酮基-D-葡萄糖酸转化率按下述方法测定:
2-酮基-D-葡萄糖酸转化率(%)=2-酮基-D-葡萄糖酸产量(g/L)/[初始培养基中葡萄糖含量(g/L)-发酵后培养基中葡萄糖含量(g/L)]
上述Ca2+测定按下述方法测定:GB/T7476-1987水质钙的测定EDTA滴定法
上述D-异抗坏血酸钠按下述方法测定:GB8273-2008食品添加剂D-异抗坏血酸钠的测定。
上述的D-异抗坏血酸钠的鉴定按以下方法:高效液相色谱法。色谱条件为:UltiMate3000系列VWD-3000可变波长检测器;色谱柱为Prontosil1202102C18柱(10μm,4.6mmi.d.×250mm);流动相用二次蒸馏水配制0.1mol/LKH2PO4,磷酸调节pH至2.5;流速为0.5mL/min;进样体积为20μL;检测波长为210nm;柱温为30℃。
机译: 具消炎和防腐功效的d-葡萄糖呋喃糖苷的制备方法。一种以d-葡萄糖呋喃糖苷为活性物质的药物制剂的制备方法,从而形成了药物制剂。
机译: 具消炎和防腐功效的d-葡萄糖呋喃糖苷的制备方法。一种以d-葡萄糖呋喃糖苷为活性物质的药物制剂的制备方法,从而形成了药物制剂。
机译: 一种制备L-肉碱酰胺的D-樟脑脂和D-肉碱酰胺的D-樟脑脂的方法。