光致介电泳组装芯片及构建结构梯度化凝胶组合体的方法

摘要

本发明涉及一种光致介电泳组装芯片及构建结构梯度化凝胶组合体的方法，所述方法包括：步骤S1，通过光致介电泳力场排布多个具有不同结构属性的且包裹细胞的凝胶微块，以构成凝胶微块组合体；步骤S2，引导细胞的大规模自组装行为，以实现凝胶微块组合体的结构梯度化；本方法仅需一路正弦激励信号，且所需电压很低，有利于保持细胞的活性且降低了成本。本方法为生物制造领域中微观多细胞结构构建与调控技术的发展提供了十分必要的手段，将在体外组织模型构建、组织工程学等领域具有广阔应用前景。

说明书

技术领域

本发明是一种通过微观作用力构建结构梯度化的凝胶体的方法，涉及生物医学领域,特别是通过微观电作用力在体外构建可模仿生物组织结构的领域。

背景技术

天然的生物组织中存在大量的结构梯度化特征，即组织微观结构的致密程度沿着某一方向成逐渐增大或逐渐减小的趋势。这些梯度化的组织结构在各类生理功能的实现方面具有重要作用。因此，体外构建梯度化的微观组织结构或多细胞结构，成为组织再生等研究领域的热点。

目前，体外构建梯度化的微观组织结构的一类重要的方法是采用水凝胶材料（天然或是人工合成的）在体外制造出具有整体结构梯度化特征，且包裹细胞的微观三维结构。其可以通过将细胞包裹于凝胶前体溶液中，而后通过光强梯度、温度梯度等方法使得凝胶在交联过程中使得交联程度沿着某一方向具有梯度化特征。这种作为细胞生长外基质的天然凝胶材料通常能够以往的外部支架或植入物具有更高的生物兼容性和易降解性，但这种方法需要制作相应的外部掩模或特定外部加热装置，增加了系统的复杂度和成本；而且在实际中通常仅能实现凝胶某成分浓度的梯度分布而不能实现细胞浓度的梯度分布。另一方面，体外构建基于凝胶材料的梯度化微观组织结构也可以在初始情况下采用无结构梯度化特征的凝胶-细胞系统，但在培养过程中在凝胶内部构建作用因子的浓度梯度（比如采用微流体浓度梯度生成器），进而使得细胞在作用因子（比如趋化因子）的作用下经过迁移、增殖等过程逐渐形成具有梯度化结构特征的多细胞结构，最后形成预期的梯度化微观组织结构。但是，目前构建作用因子浓度梯度的方法通常仅采用施加外部作用因子浓度差的方法（例如培养物两侧微流道内溶液存在浓度差），此类方法使细胞浓度梯度呈简单的近似线性分布，其与体内组织中的情况有较大差距。上述两类常用的方法只能调控外源作用因子浓度分布，而不能直接建立由细胞自身分泌的内源作用因子的浓度梯度分布，因为上述两类方法中细胞的浓度分布通常难以任意设定。故这在一定程度上也限制了3D梯度化多细胞结构调控的灵活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种光致介电泳组装芯片及构建包裹细胞的结构梯度化凝胶组合体的方法，以解决目前在体外凝胶体系中构建组织的梯度化微观结构过程中，外源性作用因子浓度梯度和细胞浓度梯度的构建方面存在难以同时实现的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种光致介电泳组装芯片，包括：若干进样口，且若干凝胶微块适于通过相应进样口分别注入到微流体腔内；所述微流体腔的上端设有电极层，其下端设有虚拟光电极形成层。

进一步，所述的电极层包括为双层结构，从上往下依次为：上层透明导电层、疏水涂层；所述虚拟光电极形成层为多层结构，从上往下依次为：亲水涂层、钝化层、光电导层、下层透明导电层；所述导电层和透明导电层适于接入正弦激励电压，以及所述虚拟光电极形成层适于通过透射的缩微光图形组合式阵列形成相应虚拟光电极，即形成用于使多个凝胶微块对齐的长条形虚拟光电极和用于驱动单个凝胶微块移动的圆形虚拟光电极。

又一方面，本发明还提供了一种构建包裹细胞的结构梯度化凝胶组合体的方法，其包括如下步骤：

步骤S1，通过光致介电泳力场排布多个具有不同结构属性的凝胶微块，以构成凝胶微块组合体；以及

步骤S2，引导细胞的自组装行为，以实现凝胶微块组合体的结构梯度化。

进一步，构成凝胶微块组合体，即通过光致介电泳组装芯片实现；所述光致介电泳组装芯片包括：若干进样口，且若干凝胶微块适于通过相应进样口分别注入到微流体腔内；所述微流体腔的上端设有电极层，其下端设有虚拟光电极形成层。

进一步，所述的电极层包括为双层结构，从上往下依次为：上层透明导电层、疏水涂层；所述虚拟光电极形成层为多层层叠结构，从上往下依次为：亲水涂层、钝化层、光电导层、下层透明导电层；所述上层透明导电层和下层透明导电层适于接入正弦激励电压，以及所述虚拟光电极形成层适于通过投射的缩微光图形组合式阵列形成相应虚拟光电极，即形成用于使多个凝胶微块对齐的长条形虚拟光电极和用于驱动单个凝胶微块移动的圆形虚拟光电极。

进一步，通过光致介电泳组装芯片构成凝胶微块组合体的方法包括如下步骤：

步骤S11，将各凝胶微块分别从不同的进样口注入至微流体腔内；

步骤S12，将正弦激励电压加于上层透明导电层和下层透明导电层，并设定初始频率；

步骤S13，生成所需的缩微光图形组合式阵列，即构建所述长条形虚拟光电极和圆形虚拟光电极，以及

通过正弦激励电压的频率调节，以获得驱动凝胶微块的最大运动速度；

步骤S14，在微流体腔中，使长条形虚拟光电极固定不动，通过控制圆形虚拟光电极横向移动，以驱动单个凝胶微块横向行进，直至各凝胶微块沿着长条形虚拟光电极的侧边对齐，并再次控制圆形虚拟光电极纵向移动，使各凝胶微块纵向贴紧，即构成凝胶微块组合体。

进一步，所述步骤S2中引导细胞的自组装行为，以实现包裹细胞的凝胶微块组合体的结构梯度化的方法包括：

从一个或者多个进样口注入琼脂糖，将凝胶微块组合体进行固定，以完成结构梯度化凝胶体的构建。

本发明的有益效果是，本发明充分利用了光致介电泳的灵活性优势，避免了在芯片上制作复杂的物理实体电极阵列或者其他的接触式操纵部件；同时由于凝胶微块尺度较大（几百微米），故而作用于其上的介电泳力通常更大，有利于提高操控凝胶微块的效率；流体腔底部有亲水涂层，既有利于凝胶微块沉淀并吸附于底部，同时也能够在凝胶微块和亲水涂层之间形成水膜，减小凝胶微块被操控时受到的横向阻力。流体腔顶部的疏水涂层可避免凝胶微块注入时或操控过程中被吸附于顶面；此外，流体环境（微流体腔）的引入有利于培养基和细胞的扩散，以及对细胞生理环境的维持。本系统仅需一路正弦激励信号，且所需电压很低，有利于保持细胞的活性，且降低了构建该系统的复杂度和成本。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明实施例中光致介电泳操控器件的截面示意图；

图2为本发明实施例所使用的制备凝胶微块的模具结构示意图（俯视图）；

图3为本发明实施例中制备凝胶微块的扁平板状模具的侧视截面示意图；

图4和图5分别为本发明实施例中形成结构梯度化特征的凝胶微块的两种移动过程示意图；

图6为本发明实施例中凝胶微块内的聚合物分子呈梯度化分布的示意图（颜色越深表示聚合物分子浓度越高）；

图7为本发明实施例中初始时间凝胶微块内细胞密度呈梯度化分布示意图；

图8为本发明实施例中初始时梯度化凝胶组合体内细胞密度随着水平位置的变化曲线，以及细胞在凝胶中生长一段时间之后细胞密度随着水平位置的变化曲线。

图中：第一进样口1101、第二进样口1102、第三进样口1103、第四进样口1104,透明绝缘盖片120,电极层130,上层透明导电层131、疏水涂层132；微流体腔140、中间间隔层150,透明绝缘基片160、虚拟光电极形成层170、亲水涂层171、钝化层172、光电导层173、下层透明导电层174；

长条形虚拟光电极1801、圆形虚拟光电极1802、第一凝胶微块191、第二凝胶微块192、第三凝胶微块193；

实体区域1、镂空区域2、上盖片3、下盖片4；

细胞200。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。

本发明针对目前在体外凝胶体系中构建组织的梯度化微观结构过程中，外源性作用因子浓度梯度和细胞浓度梯度的构建方面存在难以同时实现，以及调控灵活性受限制的问题，提供一种利用缩微光图形阵列产生的介电泳力对具有不同结构属性的凝胶微块进行组装进而使其形成具有结构梯度化特征的凝胶微块组合体的方法，以及该方法所涉及到的光致介电泳组装芯片。

此方法首先利用简易脱模法制备多个包裹细胞的凝胶微块，且这些凝胶微块可以具备不同的交联程度和细胞浓度，然后利用缩微光图形在光电导芯片中所产生的介电泳力将这些凝胶微块组装成具有梯度化分布特征的组合体。

关于光致介电泳组装芯片和构建包裹细胞的结构梯度化凝胶组合体的方法将在以下实施例中加以详细说明。

实施例1

如图1所示，本实施1提供了一种光致介电泳组装芯片，包括：若干进样口（第一进样口1101、第二进样口1102、第三进样口1103、第四进样口1104），且若干凝胶微块（第一凝胶微块191、第二凝胶微块192、第三凝胶微块193）适于通过相应进样口分别注入到微流体腔140内；所述微流体腔140的上端设有电极层130，其下端设有虚拟光电极形成层170。

具体的，所述的电极层130包括为双层结构，从上往下依次为：上层透明导电层131、疏水涂层132；所述虚拟光电极形成层170为多层结构，从上往下依次为：亲水涂层171、钝化层172、光电导层173、下层透明导电层174；所述上层透明导电层131和下层透明导电层174适于接入正弦激励电压，以及所述虚拟光电极形成层170适于通过投射的缩微光图形组合式阵列形成相应虚拟光电极，即形成用于使多个凝胶微块对齐的长条形虚拟光电极1801和用于驱动单个凝胶微块移动的圆形虚拟光电极1802。

其中，如图1所示，进样口可以选用2-6个，优选为4个，具体可以根据凝胶微块组装需要进行任意设置；所述的上层透明导电层131和疏水涂层132可以分别采用透明的铟锡氧化物薄膜和聚四氟乙烯涂层，并且，所述的亲水涂层171可以采用单原子层沉积的羟基氧化铝层，所述钝化层172适于采用氮化硅层，所述光电导层173具有光电导的特性，即当被光照亮时其内部载流子数量剧增，而没有被光照亮时其内部载流子数量很少，其明电导与暗电导之比至少达10000以上；光电导层173的材料可以选择氢化非晶硅或者掺杂的硫化镉(CdS)或者参杂的硒化镉(CdSe)或者是硫化镉和硒化镉的组合。

以及所述虚拟光电极形成层的底部还设有透明绝缘基片160。

具体的，所述光致介电泳组装芯片还包括：位于电极层130上端的透明绝缘盖片120，用于构建微流体腔140的中间间隔层150。

实施例2

在进行结构梯度化凝胶组合体进行组装前，还需要制备相应的凝胶微块，

如图2和图3所示，本实施例中所使用的制备凝胶微块的模具包括实体区域1，镂空区域2,上盖片3以及下盖片4。首先，液态的凝胶前体溶液被注入此模具的镂空区域2内，然后经过凝胶化过程，固态的凝胶微块在模具的镂空区域内形成，然后将整个模具装置（含有上、下盖片）置于磷酸缓冲液中，经过几分钟的浸泡，将上下盖片拆除。而后将带有固态凝胶微块的模具中间层单独取出，放入一个装有新的磷酸缓冲液的培养皿中，经过若干分钟的晃动，模具中间层中的固态凝胶微块逐渐脱离模具而漂浮于磷酸缓冲液中，用吸液器将缓冲液逐渐吸去（但不必吸干），然后使用小型金属抹刀将这些凝胶微块移至光致介电泳组装芯片中。

采用上述方法制备凝胶微块的过程中可以根据需要制备出具备不同的交联程度和细胞浓度的凝胶微块，且不同批次的凝胶微块含有不同的荧光物质或含有的荧光物质具有不同的荧光强度；将所制备的具备不同结构特征的凝胶微块先后或者同时分别通过相应进样口注入光致介电泳组装芯片中，在初始时，凝胶微块就落入到微流体腔140中的相应区域中。

在实施例1基础上，本实施例2中所使用的光致介电泳组装芯片采用四个进样口（例如第一进样口、第二进样口、第三进样口，第四进样口）的目的是根据需要在凝胶微块排列区域的不同区域分别进行进样，即在注射凝胶微块时将其注射到整个微流体腔中合适的区域，方便就近进行微组装，以便于提高凝胶微块的组装效率和完成大面积的凝胶微块组装。在组装过程中，凝胶微块受到的介电泳力的大小可以通过控制光致介电泳组装芯片的施加正弦激励电压的幅值和频率来调控。

在介电泳组装芯片中，通过缩微光图形组合式阵列产生的介电泳力对不同的凝胶微块进行操控与组装。介电泳力场的形貌与缩微光图形组合式阵列的几何形态有直接的关系。通过设计和投射具有不同几何特征的缩微光图形，可以实现对不同的凝胶微块进行组装，进而使其形成各种具有结构梯度化特征的凝胶微块组合体（参见图4、图5）。这种凝胶微块组合体的梯度化特征举例阐述如下：交联分子的浓度沿着某一方向逐渐降低（或增大）而细胞的浓度不变（如图6）；或细胞的浓度沿着某一方向逐渐降低（或增大）而交联分子的浓度不变（如图7）。在图6中，三个凝胶微块中的细胞初始密度相同，但聚合物分子的浓度逐渐降低。在图7中，在初始时刻，三个凝胶微块中的细胞密度按照排列方向逐渐递减。初始时细胞密度随着水平位置的变化曲线成阶梯状（如图8），但当细胞在凝胶中生长一段时间之后（例如1-5天后）细胞密度随着水平位置的变化曲线则逐渐趋于平滑，如图8所示。

本发明对不带电的凝胶微块进行操控的原理如下：光电导层在无光照情形下拥有很高阻抗，而接受光照时，明区光生载流子浓度迅速提高而使其局部电导率迅速提高几个数量级，造成明暗区流层分压的不同，在空间形成非均匀电场并产生了光致介电泳力，且作用于凝胶微块。基于光致介电泳力的微操控技术具有非接触、可实时重构、且无损操控电中性微粒的优点，其通过投射至操控芯片光电导层上的缩微光图形（虚拟光电极）使得微流体环境内产生与虚拟光电极几何形状一致的非均匀电场分布，进而使凝胶微块受到特定介电泳力场作用而产生预期运动。对凝胶微块进行组合排列主要由光致介电泳力完成，通过缩微光图形的移动使这些包裹细胞的凝胶微块紧密地排列成一维和二维的阵列。该组装芯片的流体腔底部有亲水涂层，能够在凝胶微块和腔底面之间形成水膜，这样既有利于凝胶微块沉淀并吸附于底面，又同时能减小凝胶微块被操控时受到的水平方向的阻力。具有结构化梯度的凝胶组合体中的主干聚合物高分子或交联分子的密度沿着组合体形成的方向成梯度化分布，会使得细胞在其中的扩散率在凝胶组合体内成梯度化分布；凝胶组合体中的细胞的浓度沿着组合体形成的方向成梯度化分布，会使得细胞在其中浓度凝胶组合体内成梯度化分布。由此即可通过调节凝胶体结构的梯度化程度来调控其中的细胞3D自组装过程。

具体的构建包裹细胞的结构梯度化凝胶组合体的方法，包括如下步骤：

步骤S1，通过光致介电泳力场排布多个具有不同结构属性的凝胶微块，以构成凝胶微块组合体，进而构建凝胶基质中的外部作用因子浓度梯度和细胞密度梯度；

步骤S2，引导细胞的大规模自组装行为，以实现凝胶微块组合体的结构梯度化。

其中，被操控和组装的凝胶微块内包裹的细胞可以具有相同密度，或者沿着凝胶微块组装的方向逐渐增大或减小；以及被操控和组装的凝胶微块内的聚合物分子或交联分子可以具有相同浓度，或者沿着凝胶微块组装的方向逐渐增大或减小。

在所述实施例1中所述的光致介电泳组装芯片的基础上。

通过在光致介电泳组装芯片构成凝胶微块组合体的方法包括如下步骤：

步骤S11，将各凝胶微块分别从不同的进样口注入至微流体腔内。

步骤S12，将正弦激励电压加于上层透明导电层和下层透明导电层，即将正弦激励电压加于上层铟锡氧化物薄膜和下层铟锡氧化物薄膜之间，并设定初始频率。

步骤S13，生成所需的缩微光图形组合式阵列，即构建所述长条形虚拟光电极和圆形虚拟光电极，以及通过正弦激励电压的频率调节，以获得驱动凝胶微块的最大运动速度，即通过在一定频率范围内的扫频测试，来确定能够驱动凝胶微块以最大速度运动的频率范围。

步骤S14，在微流体腔中，使长条形虚拟光电极固定不动，通过控制圆形虚拟光电极横向移动，以驱动单个凝胶微块横向行进，直至各凝胶微块沿着长条形虚拟光电极的侧边对齐，并再次控制圆形虚拟光电极纵向移动，使各凝胶微块纵向贴紧，即构成凝胶微块组合体。

具体的，在微流体腔中，使长条形虚拟光电极固定不动，按照图4中的箭头方向移动圆形虚拟光电极，并从零开始逐渐增大移动速度，侧边受到长条形虚拟光电极作用力的凝胶块，同时被圆形虚拟光电极推着或拖着沿水平直线行进，直至三个凝胶微块沿着长条形虚拟光电极的侧边对齐；然后按照图5中的箭头方向移动圆形虚拟光电极，使得三个凝胶微块紧靠在一起,且边缘排列齐平。

在实现步骤S14之前，还可以添加对凝胶微块进行位置粗调的相关步骤，即基于上一步中确定的频率范围，通过长条形虚拟光电极和/或圆形虚拟光电极作用,使得各凝胶微块分别被驱动至指定位置的大致范围内。

以及所述步骤S2中引导细胞的大规模自组装行为，以实现包裹细胞的凝胶微块组合体的结构梯度化的方法包括：

从一个或者多个进样口注入琼脂糖，将凝胶微块组合体进行固定，以完成结构梯度化凝胶体的构建。

最后，关闭电信号，将介电泳芯片的透明绝缘盖片揭开，将固定后的梯度化凝胶微块组合体取出。

因此，本发明光致介电泳组装芯片及构建结构梯度化凝胶组合体的方法在成本和性能方面均优于当前的凝胶结构梯度构建方法，为生物制造领域中微观多细胞结构构建与调控技术的发展提供了十分必要的手段，将在体外组织模型构建、组织工程学等领域得到广泛的应用。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。