一种pH和温度双重刺激响应的分子印迹聚合物的制备方法

摘要

本发明公开一种pH和温度双重刺激响应的分子印迹聚合物的制备方法，包括，将苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）与氨基修饰的介孔硅分子印迹荧光聚合物混合反应，即得到pH和温度双重刺激响应的分子印迹聚合物。本发明利用介孔硅分子印迹聚合物表面的Schiff？base基团和PNIPAAm聚合物对pH和温度的刺激响应，起到门阀的作用，从而对目标分子进入介孔硅内部识别位点的条件进行有效控制，可用于分子印迹荧光传感器。

说明书

技术领域

本发明涉及一种pH和温度双重刺激响应的分子印迹聚合物的制备方法及其应用。

背景技术

荧光传感器具有灵敏度高，仪器简单，容易操作等优势；分子印迹聚合物具有选择性高，性能稳定等特点。结合荧光传感器的高灵敏度和分子印迹聚合物的高选择性，分子印迹荧光传感器在过去十几年中得到快速发展。分子印迹荧光传感器的构建主要将荧光物质如量子点包覆于分子印迹聚合物内部，当被测物进入识别位点，猝灭量子点荧光，从而建立定量的分析方法。

刺激响应聚合物，具有响应外部刺激的能力，如对温度、pH、光等的改变进行响应。刺激响应聚合物较少应用于荧光分子印迹传感器的构建中。仅有少数报道将温度响应功能单体或pH响应功能单体用于分子印迹聚合物的制备，通过识别位点的收缩释放和识别目标物，进行响应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种pH和温度双重刺激响应的分子印迹聚合物的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种pH和温度双重刺激响应的分子印迹聚合物的制备方法，包括，

将苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）与氨基修饰的介孔硅分子印迹聚合物混合反应，即得到pH和温度双重刺激响应的分子印迹聚合物。

进一步，在碱性条件下，由N-羟基琥珀酰亚胺酯封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）与对羟基苯甲醛反应得到所述的苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）。

进一步，所述氨基修饰的介孔硅分子印迹聚合物附着在载体表面。

更进一步，氨基修饰的介孔硅分子印迹聚合物的制备过程包括：

（I）向载体分散液中加入十六烷基三甲基溴化铵、正硅酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷、荧光量子点和模板分子，在碱性条件下反应1-30小时后，分离，在载体表面上得到介孔硅层；

（II）将经过步骤（I）处理的载体分散于介质中，加入氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷，反应1-30小时后，分离，洗脱，即得到氨基修饰的介孔硅分子印迹聚合物。

进一步，所述荧光量子点为CdTe量子点。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是介孔硅分子印迹聚合物修饰苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）前后的电镜图；

图2是介孔硅分子印迹聚合物修饰苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）前后的pH响应曲线。

图3是介孔硅分子印迹聚合物修饰苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）前后的温度响应曲线。

图4为本发明pH和温度双重刺激分子印迹聚合物的制备流程图。

图5为介孔硅分子印迹聚合物修饰苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）的路线图。

图6为介孔硅分子印迹聚合物对pH和温度双重刺激响应的原理示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1.反相法制备纳米二氧化硅：22.5mL环己烷、5.3mLTritonX-100、5.4mL正己醇、1.5mL水、0.35mL氨水依次加入到50mL圆底烧瓶中，搅拌30min以上，再加入0.4mL正硅酸乙酯（TEOS），25℃下反应24h。反应产物用乙醇和水各洗涤三次（14000rpm，30min），最后分散于水中，用3000转离心5min，取上清液，分散于9mL的二次水中，得纳米二氧化硅分散液。

2.CdTe量子点溶液的制备：称取38.0mg的碲粉和40mg的硼氢化钠加入到2mL的尖底黄盖瓶中，加入2mL的乙醇，迅速盖上盖子，使体系密闭，在盖子上插一根针头，在针头上用水进行液封隔氧。放在30-50℃恒温反应，反应3-5h，至黑色的碲粉完全消失，上清液为淡紫色为止。同时把90-100mg的硝酸镉加入到75mL的二次水中，然后加入63μL的巯基乙酸，再用1mol/L的氢氧化钠溶液将pH调到9-10，用氮气吹10-30min除氧。将碲粉产物的上清液1mL加入到硝酸镉溶液中，氮气保护下回流1-3h，即可得到黄绿色的量子点。该溶液下一步中直接使用。

2.表面印迹制备介孔结构分子印迹层：取上述纳米二氧化硅分散液样品1mL稀释于18mLpH=7.4PBS缓冲溶液中，2mLCdTe量子点溶液，随后加入0.8mL0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），搅拌均匀后，再加入大约0.1mL已配置好的0.2mol/LNaOH水溶液，搅拌10min后，加入20%体积比的TEOS/乙醇溶液0.2mL，3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）20μL，模板分子牛血红蛋白(BHb)20mg，25℃下避光反应24h后，离心分离，得到固体颗粒。

3.分子印迹聚合物表面氨基化：上述固体颗粒加入20mL水中，加入0.5mL氨水，加入APTES20μL，室温下反应12h。过滤得到固体产物，产物用甲醇和乙醇溶液离心洗涤3次以上，去除CTAB以及模板分子BHb，最后分散于5mL水中，得到氨基修饰的介孔硅分子印迹聚合物（M-MIPs）。

4.双重刺激响应的分子印迹聚合物的制备：0.10gN-羟基琥珀酰亚胺酯封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）(PNIPAAm)(购买于Sigma公司，分子量2000左右)加入50mL水中，加入30mg对羟基苯甲醛，在弱碱性（加入少量Na₂CO₃,调pH8.0）下反应24h，反应溶液用透析袋（截留分子量1000）透析24h,除去未反应的对羟基苯甲醛，得到苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）。透析后的溶液，加入氨基修饰的介孔硅分子印迹聚合物，室温下搅拌48h，离心洗涤，获得具有温度和pH双重刺激响应的荧光分子印迹聚合物（pH-T-M-MIPs）。

如图1所示，修饰苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）后，介孔硅分子印迹聚合物界面变得模糊。

pH响应试验：

将pH-T-M-MIPs和M-MIPs分别用不同pH的PBS缓冲溶液配制成浓度为40mg/L的溶液，分别向其内部加入BHb,使其浓度为0.5μM。维持溶液温度在37℃，待BHb与印迹材料相互作用30min后，测印迹聚合物溶液响应前后的荧光强度，计算其猝灭效率，考查pH-T-M-MIPs的pH响应性能。结果如图2所示，M-MIPs（用符号“■”表示）在pH7.4左右表现出最高的荧光猝灭效率。当pH逐渐减弱至酸性后，由于蛋白质会在酸性条件下变性，因此进入印迹聚合物识别位点的蛋白质数量减少，引起猝灭效率降低。相比，pH-T-M-MIPs（用符号“●”表示）在pH6.0以上的猝灭效率很低。原因在于pH6.0以上，Schiffbase结构稳定存在，使得起门阀作用的PNIPAAm覆盖在介孔印迹层表面，阻碍蛋白质进入识别位点，因此无法猝灭量子点荧光。当pH低于6.0后，Schiffbase开始水解，导致PNIPAAm从印迹材料表面脱离，从而蛋白质进入识别位点，猝灭荧光，使得猝灭效率大大提高，上述结果表明，pH-T-M-MIPs对pH的刺激响应性能。

温度响应试验：

将pH-T-M-MIPs和M-MIPs分别用pH7.4的PBS缓冲溶液配制成浓度为40mg/L的溶液，分别向其内部加入BHb,使其浓度为0.5μM。改变溶液的温度从20-40℃，待BHb与印迹材料相互作用30min后，测印迹聚合物溶液响应前后的荧光强度，计算其猝灭效率，考查pH-T-M-MIPs的温度响应性能。结果如图3所示，M-MIPs（用符号“■”表示）在20-40℃范围内表现出较高的猝灭性能。而pH-T-M-MIPs（用符号“●”表示）在温度高于32℃，荧光猝灭效率较低。原因在于此时PNIPAAm以蜷缩无规线团形式存在，阻碍了蛋白质分子的进入。当温度低于32℃时，PNIPAAm以伸展链状态存在，蛋白质可以进入识别位点猝灭量子点荧光，因此猝灭效率大大提高。上述结果表明，pH-T-M-MIPs对温度的刺激响应性能。

图4为本发明pH和温度双重刺激分子印迹聚合物的制备流程图。图5为介孔硅分子印迹聚合物修饰苯甲醛封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）的路线图。图6为介孔硅分子印迹聚合物对pH和温度双重刺激响应的原理示意图。

在介孔硅分子印迹聚合物表面引入对pH刺激响应的Schifbase基团和对温度刺激响应的聚异丙基丙烯酰胺。在pH7.4和37℃下，Schiffbase稳定存在，PNIPAAm聚合物以无规则线团形式存在，阻挡在介孔硅表面，起到门阀的作用，使目标分子无法进入介孔硅内部的识别位点。当改变溶液的pH＜6.0,Schiffbase水解，导致作为门阀的聚合物PNIPAAm从介孔材料表面脱离，目标分子进入介孔硅层，猝灭量子点荧光，从而实现荧光检测。在不改变溶液pH的情况下，通过改变温度也可实现目标物的检测。降低体系温度低于PNIPAAm的临界溶解温度（32℃），PNIPAAm以伸展链状态存在，此时目标分子同样可进入介孔硅层进行识别。由此实现对温度和pH双重刺激响应。

本发明的氨基修饰的介孔硅分子印迹聚合物并不限于采用本发明所述的方法制备，也可采用传统方法制备，如“多巴胺朋序介孔硅表面分子印迹传感器的研究”，龚伟等，分析测试学报，2012年4月第31卷第4期，417-422页。“两种介孔硅分子印迹聚合物的制备及其应用研究”，唐菲等，安徽农业大学，2013年。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。