一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离和培养方法

摘要

本发明公开了一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离和培养方法，分离方法包括：1)将长爪沙鼠的肝脏，先移入联合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝脏呈糊状，再移入混合酶液，搅拌消化，得到搅拌消化后的产物；2)加入第一Hank’s液，过滤，得肝组织；然后加第二Hank’s液，初步离心，得沉淀；用第三Hank’s液重悬沉淀，再向其加入Nycodenz液混匀，再次离心，得浑浊带，浑浊带即为分离得到的肝星状细胞。分离培养方法包括：分离以及培养。本发明方法能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度，为进一步研究肝星状细胞在肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化的形成奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及肝星状细胞的分离培养领域，具体涉及一种长爪沙鼠的肝星 状细胞的分离和培养方法。

背景技术

肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)，又称储脂细胞(Fat-storecell， FSC)、间质细胞，主要分布于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的窦周隙内 (Disse间隙)。HSC在肝纤维化的发生发展中具有核心作用，是促进肝纤维 化发展的主要因素。静息状态的HSC主要参与维生素A的代谢调节，当肝 脏受到化学、物理及生物因素刺激而发生损伤后，HSC发生增殖并被活化， 合成以胶原蛋白为主的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)及各类细胞 因子如MMPs、TNF-α等，参与受损肝组织的修复。刺激持续发生时，HSC 大量激活，引发ECM的合成与降解失衡，进而导致肝脏内结缔组织异常沉 积，发生肝纤维化。

肝星状细胞是肝纤维化的主要效应细胞，在肝窦内，还有肝窦内皮细胞、 kupffer细胞等。肝星状细胞占整个肝脏细胞的8.00～13.00％左右，被认为是 肝脏中主要的贮存和代谢维生素A的细胞。肝星状细胞激活并转化为肌成纤 维细胞样细胞，各种致纤维化因素均把HSC(肝星状细胞)作为最终靶细胞， 正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时， 肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方 面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一 方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。

国内一些作者采用原位灌流法分离HSC，因肝脏在体灌注，灌注液不易 回收，酶的用量较大，且难以掌握酶灌流时的温度，肝消化后摘取困难。目 前针对大、小鼠分离培养HSC的方法已经较为成熟，但是国内尚无关于长 爪沙鼠HSC的研究，而国外也尚未建立完善的培养体系，且长爪沙鼠HSC 的研究不同于大、小鼠，彼此不能相互借鉴。

申请公布号为CN103805553A(申请号为201210455728.4)的中国发明 专利申请公开了一种小鼠肝星状细胞的分离方法，通过插管固定、灌注消化、 细胞分散、小鼠肝星状细胞分离等步骤完成对小鼠肝星状细胞的分离。用上 述方法得到了需要的小鼠肝星状细胞，质量很好，比传统大鼠的分离质量好 很多，而且在整个过程比较便捷，在普通实验室就能完成，很稳定，由于采 用了小鼠，不用一些特殊的设备，降低了这种分离方法的成本，在得到高质 量的小鼠肝星状细胞，为进一步深入研究小鼠肝星状细胞的生物学行为创造 了条件。该技术方案采用原位灌流法分离HSC，因肝脏在体灌注，灌注液不 易回收，酶的用量较大，且难以掌握酶灌流时的温度，肝消化后摘取困难。 同时该技术方案不适合用于长爪沙鼠HSC。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种长爪沙鼠的肝星状 细胞的分离方法，能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，包括：

1)将长爪沙鼠的肝脏，先移入联合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜 和Glisson鞘，粉碎肝脏呈糊状，再移入混合酶液，搅拌消化，得到搅拌消 化后的产物；

2)向搅拌消化后的产物中加入第一Hank’s液，过滤，得肝组织；然后 向肝组织中加第二Hank’s液，初步离心，得沉淀；用第三Hank’s液重悬沉 淀，再向其加入Nycodenz液混匀，再次离心，得浑浊带，浑浊带即为分离 得到的肝星状细胞。

本发明的分离方法，成功地分离了长爪沙鼠的肝星状细胞，简便可行， 并为进一步研究HSC与肝纤维化的关系奠定了基础。同时，本发明方法能 够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度，为进一步研究肝星 状细胞在肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化的形成奠定了基础。

以下作为本发明的优选技术方案：

步骤1)中，所述的长爪沙鼠的肝脏的获得包括：对长爪沙鼠进行开腹， 游离腹主动脉，向游离腹主动脉中灌注预灌注液，取下肝脏，即得到长爪沙 鼠的肝脏。

所述的长爪沙鼠为生前体重400g左右(400g±50g)、营养状况良好的 长爪沙鼠；体重较轻者，可预先用维生素A处理，即通过维生素A灌胃， 确保肝星状细胞具有一定的浮力。

所述的预灌注液为4℃、含肝素25U/ml的Hank’s液。

所述预灌注液的用量为50ml/只。

所述的联合酶液，由以下体积百分数的组分组成：0.02％～0.08％的链酶 蛋白酶和0.05％～0.2％的胶原酶以及余量的Hank’s液，进一步优选，由以下 体积百分数的组分组成：0.05％的链酶蛋白酶、0.1％的胶原酶以及余量的 Hank’s液。

所述的灌注消化的条件为：35℃～39℃灌注消化5～20min；进一步优选， 所述的灌注消化的条件为：37℃灌注消化10min。

所述的混合酶液，由以下体积百分数的组分组成：0.02％～0.08％的链酶 蛋白酶、0.05％～0.2％的胶原酶、0.0005％～0.003％的DNaseI以及余量的 Hank’s液。进一步优选为，由以下体积百分数的组分组成：0.05％的链酶蛋 白酶、0.1％的胶原酶、0.001％的DNaseI以及余量的Hank’s液。

所述的搅拌消化的条件为：35℃～39℃搅拌消化10～20min；进一步优 选，所述的搅拌消化的条件为：37℃搅拌消化10～15min。

步骤2)中，第一Hank’s液、第二Hank’s液和第三Hank’s液均为Hank’s 液，可采用现有技术。

所述的过滤采用80目～120目的钢丝筛，进一步优选，所述的过滤采用 100目钢丝筛。

所述的初步离心的条件为：300g～400g、5min～20min，进一步优选，所 述的初步离心的条件为：350g、10min。

所述的再次离心的条件为：2℃～6℃、1200g～1600g、13min～23min。进 一步优选，所述的再次离心的条件为：4℃、1400g、18min。

所述的Nycodenz液可选用20％Nycodenz液，由体积百分比20％的 Nycodenz分离液和体积百分比80％的Hank’s液，即20％Nycodenz液由体 积比20％：80％的Nycodenz分离液和Hank’s液制成。

本发明还提供了一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离培养方法。

一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离培养方法，包括：所述的长爪沙鼠的 肝星状细胞的分离方法以及培养；

所述的培养包括：取分离得到的肝星状细胞，以1×10⁵～1×10⁶个/ml 接种密度进行原代培养；当细胞融合度为80％～90％时，进行传代培养。

优选地，所述的原代培养的培养基由体积百分数5％～15％的胎牛血清和 85％～95％的DMEM培养液组成；所述的原代培养和传代培养的条件为：在 35℃～39℃、由体积百分数2％～8％CO₂和92％～98％空气组成的气氛中培养。 进一步优选，所述的原代培养的培养基由体积百分数10％的胎牛血清和90％ 的DMEM培养液组成；所述的原代培养和传代培养的条件为：在37℃、由 体积百分数5％CO₂和95％空气组成的气氛中培养。空气可优选为潮湿空气， 湿度50％～90％。

本法采用离体胶原酶、链霉蛋白酶灌注法，每只雄性长爪沙鼠肝脏约获 得星状细胞1.5×10⁷个。

为提高细胞得率主要从以下方面进行改进：

1、一般选用体重400g左右、营养状况良好的雄性长爪沙鼠较为合适。 体重较轻者，可预先用维生素A处理雄性长爪沙鼠，确保肝星状细胞具有一 定的浮力，在密度梯度离心时较好地与其它细胞分离。

2、用4℃的预灌注液腹主动脉灌注，灌注液可以通过门静脉与肝动脉进 入肝脏，肝内血细胞冲冼得相对较为干净，低温灌注可以减少肝热缺血对肝 脏的损伤，取下肝脏后行门静脉插管固定再行灌注与肝表面清洗，尽可能的 减少血细胞对消化酶的活性产生的不良影响。

3、肝脏消化是否适度，是影响细胞得率及活力的关键因素。本法采用 离体胶原酶消化，肝脏在37℃水浴中进行灌注，使肝脏与肝内酶消化液保持 在37℃，可以保证酶的活性，可以减少消化时间，在保证门静脉插管良好同 时，适当的阻断肝下下腔静脉，让酶消化液在肝内行成高压，消化酶通过门 脉系统均匀地作用于肝组织，可提高酶的使用率。

4、Nycodenz密度梯度离心分离HSCs时，重悬沉淀细胞时根据沉淀细 胞量加Hank’s液，以免细胞粘度影响细胞分层，吸取分离后细胞尽可能少 吸取细胞层界面下液体，否则会夹杂Kupffer细胞，影响星状细胞的纯度。

5、国内外关于大、小鼠HSC分离培养的方法报道很多，但有关长爪沙 鼠HSC的分离培养体系的建立尚属首次，本发明经过方法改良，反复试验， 最终形成一套适用于长爪沙鼠的经济、合理、方便的HSC提取方法。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明 的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为长爪沙鼠HSCs原代培养2h贴壁，含折光颗粒的HSC的状态图 (×100)；

图2为长爪沙鼠HSCs原代培养24h生长状况图(×200)；

图3为长爪沙鼠HSCs原代培养3d呈局灶性生长图(×200)；

图4为长爪沙鼠HSCs原代培养7d呈纤维细胞样形态图(×200)；

图5为HSC自发荧光图(×200)，其中，左(a)、中(b)、右(c)图 分别为HSC自发荧光×200、DAPI×200、二者合并×200；

图6为长爪沙鼠HSCs培养至第3天行α-SMA免疫细胞化学染色图， 其中，左(d)图为×200；右(e)图为×400；

图7为Desmin免疫荧光染色(传代后24h)图，其中，左(f)、中(g)、 右(h)图分别为Desmin免疫荧光染色×200、DAPI×200、二者合并×200；

图8为α-SMA免疫荧光染色(传代后24h)图，其中，左(j)、中(k)、 右(l)分别为α-SMA免疫荧光染色(传代后24h)×200、DAPI×200、 合并×200；

图9为长爪沙鼠HSCs培养至第3天、油红染色图(×200)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领 域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的 是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以 做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

1材料与方法

1.1.1动物准备

雄性SD雄性长爪沙鼠，浙江省实验动物中心提供，生产许可证 号:SCXK(浙)2014-0001，体重400g左右，予常规饲料喂养，正常饮水。在 分离HSCs前2W(前两周)每天VitaminA200U/100g体重灌胃。

1.1.2主要试剂

链霉蛋白酶E(PronaseE)，IV型胶原酶(TypeIVcollagenase)，DNaseI、 Nycodenz分离液购自Sigma公司；DMEM培养液购自Invitrogen公司；胎 牛血清为杭州四季青公司产品。

1.1.3主要仪器

荧光显微镜、超速离心机、倒置显微镜、CO₂培养箱、洁净工作台。

1.2实验方法

1.2.1肝星状细胞的分离制备

肝星状细胞的分离：雄性长爪沙鼠术前禁食8h，自由饮水。用水合氯酫 腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠。胸腹部去除 被毛，皮肤消毒。仰卧位固定大十字开腹，上至剑突，下至耻骨联合，左右 至两侧腋中线。皮瓣外翻固定扩创，显露腹腔所有脏器。将小肠翻至鼠体左 侧，预游离肝脏，在右肾静脉上方游离肝下下腔静脉。下压肝脏剪断镰状韧 带至肝上下腔静脉。

游离腹主动脉，静脉穿刺针穿刺，注入4℃Hank’s液(内含肝素25U/ml) 50ml，夹闭胸主动脉同时切开肝下下腔静脉与破心，尽量将肝脏内淤积的红 细胞冲出。待肝脏颜色变浅时，结扎肝上下腔静脉，行门静脉插管固定，取 下肝脏，冲洗肝脏表面，4℃Hank’s液50ml行门静脉灌注肝脏。

肝脏移入37℃水浴中的250ml烧杯，继续循环灌注预温至37℃的联合 酶液50ml(联合酶液由体积百分数0.05％链霉蛋白酶E、0.1％IV型胶原 酶以及余量的Hank’s液组成)，消化肝脏10分钟。在培养皿中去除肝包膜 和Glisson鞘。将肝脏粉碎成糊状，放入混合酶液(混合酶液由体积百分比 0.05％链霉蛋白酶E、0.1％IV型胶原酶、0.001％DNaseI以及余量的Hank’s 液)中，37℃水浴用镊子搅拌10～15min，使肝组织充分得到消化，得到消 化好的肝组织。

将消化好的肝组织加入4℃Hank’s液50ml，用100目钢丝筛过滤。滤 过的肝组织分装入两支50ml离心管中，加Hank’s液至50ml，350g离心10 min。取沉淀重悬于50mlHank’s液中，再次350g离心10min。合并沉淀 加50mlHank’s液10ml重悬，吸取2ml置于10ml玻璃离心管中，加入3ml 的20％Nycodenz液(由体积比20％：80％的Nycodenz分离液和Hank’s液 制成)混匀，按此比例分装完全部沉淀，每管液面覆盖2mlHank’s液，1400g， 4℃离心18min，轻轻取出，不要摇动液面，可见在Hank.s液下有一混浊带。 用16号针头插入液面下此处抽吸混浊带于10ml离心管，浑浊带即为分离得 到的肝星状细胞。加DMEM培养液，900g离心10min，沉淀重悬于10ml 左右DMEM培养液中，然后加入1.11ml胎牛血清。计数细胞产量并且行台 盼蓝拒染试验，判断活力。

1.2.2细胞培养

以1×10⁵～1×10⁶个/ml的密度接种到50ml塑料培养瓶中，在37℃、 体积分数为5％CO₂、95％潮湿空气的CO₂恒温培养箱里培养。培1d后首次 换液，以后视情况每2～3d换液一次。如需作免疫组化等分析，可将细胞接 种于内有玻片的6孔板中。当细胞融合达到80％～90％左右可进行传代。传 代时按常规使用0.125％胰酶。

1.2.3细胞鉴定

325nm波长紫外光激发细胞自发荧光。光镜观察细胞形态。免疫组织化 学方法鉴定原代HSC和传代HSC的Desmin(结蛋白)、A-SMA(α-平滑肌 肌动蛋白)的表达情况。

2结果

2.1HSC的存活率与得率

采用Nycodenz密度梯度离心法分离长爪沙鼠HSC，长爪沙鼠平均体重 为60克，每只鼠肝的细胞得率约为(0.5～1)×10⁷个。根据台盼蓝拒染试验， 细胞活力为(98.6)％。

2.2HSC的形态观察

在普通光学倒置显微镜下观察，新鲜分离的HSC由于富含脂滴，具有 很强的折光性，呈现透亮、立体感较强的小圆球状，见图1，图1为长爪沙 鼠HSCs原代培养2h贴壁、含折光颗粒的HSC的图，×100。图2为长爪沙 鼠HSCs原代培养24h生长状况图，×200，细胞在接种后30～60min出现贴 壁，培养24h后85％细胞贴壁。图3为长爪沙鼠HSCs原代培养3d呈局灶 性生长的图，×200，72h贴壁细胞呈现出梭形，多边形。图9为长爪沙鼠 HSCs培养至第3天、油红染色的图，×200，普通光镜下观察油红染色结果 表明，红色脂滴主要分布于胞浆内。图5为HSC自发荧光的图，×200，细 胞在325nm波长紫外光的激发下自发绿色荧光。图4为长爪沙鼠HSCs原 代培养7d呈纤维细胞样形态图，×200，5～7d后，细胞继续伸展，绝大多 数细胞呈星形，部分细胞出现片状融合；10～11d左右融合达到80％～90％， 细胞铺满瓶底可以传代。

2.3HSC鉴定

免疫细胞化学检测显示，贴壁24h的α-平滑肌动蛋白(α-SMA)呈阴 性，原代培养3d后，α-SMA阳性率为75％(图6)。肝星状细胞消化传代后， 细胞表现为活化状态，免疫荧光检测显示Desmin(图7)和α-SMA(图8) 阳性染色达到100％，胞浆呈颗粒状或弥漫着色。传代后1d细胞表现为活化 表型。

3.结论

HSC是肝内的一种非实质细胞，激活的HSC是合成、分泌ECM的主 要来源，在肝纤维化的病程进展中处于重要地位。如前所述，长爪沙鼠脂质 代谢模式与人类相仿，对高脂饮食敏感，相对于大、小鼠，容易形成肝纤维 化，被认为是肝纤维化模型研究的理想动物。因此长爪沙鼠HSC的分离培 养将为肝纤维化的发病机制研究及其逆转治疗奠定基础。

国内外关于大、小鼠HSC分离培养的方法报道很多，但有关长爪沙鼠 HSC的分离培养体系的建立尚属首次。我们反复试验，最终形成一套适用于 长爪沙鼠的经济、合理、方便的HSC提取方法：

1、长爪沙鼠的选择与预处理

本课题组所保存的封闭群有部分沙鼠具有自发性肥胖症状，即3月龄后， 体态明显偏胖，体重较同龄鼠明显偏高，故本实验中选择60g左右的长爪沙 鼠，性别不限，并预先用维生素A灌胃处理，确保肝星状细胞具有一定的浮 力，以便在密度梯度离心时，能较好地与其他细胞分离。

2.灌注方法的改良

我们在原位灌注方法的基础上，进行了改良，采用肝脏体外循环灌注的 方法，具体如下：用4℃的预灌注液腹主动脉灌注，灌注液可以通过门静脉 与肝动脉进入肝脏，肝内血细胞冲冼得相对较为干净，低温灌注可以减少肝 热缺血对肝脏的损伤。取下肝脏后，行门静脉插管固定再行灌注与肝表面清 洗，尽可能的减少血细胞对消化酶活性产生不良影响。在整个灌注过程中亦 应避免气泡进入肝内血管导致的灌注不充分。

3.酶消化中的注意事项

肝脏消化是否适度，是影响细胞得率及活力的关键因素。本法采用离体 酶消化法。该方法主要有以下3个优点，(1)肝脏局部容易实现温度控制， 肝脏在37℃水浴中进行灌注，使肝脏与肝内酶消化液保持在37℃，可以保 证酶的活性，可以减少消化时间。(2)可避免原位酶消化法中由于肝脏侧枝 循环丰富导致的酶用量增加，成本增高。(3)在保证门静脉插管良好同时， 适当的阻断肝下下腔静脉，让酶消化液在肝内形成高压，消化酶通过门脉系 统均匀地作用于肝组织，可提高酶的使用率。在本方法中所用的混合酶液的 配比为：胶原酶：DNA酶：链蛋白酶＝0.1％:0.001％:0.05％，胶原酶主要用 于消化肝脏内胶原，DNA酶可降解肝实质细胞破裂后释放的DNA，减少细 胞间的粘连，而链蛋白酶主要用于去除肝细胞，提高HSC的浓度。消化酶 务必在临用前配置，并且浓度准确。

4.分离介质的选择与添加

由于HSC富含脂滴，细胞密度在所有肝细胞中最低，故可采用密度梯 度离心的方法分离HSC，因此，分离介质的选择在HSC的分离纯化中亦是 十分重要。常用的分离介质有Metrizamidee，Percoll，Nycodenz。我们通过 预实验发现Metrizamidee，Percoll较难形成明显的条带，且需要高速离心， 而Nycodenz分层稳定，配置简单，因此我们采用Nycodenz作为分离介质， 其常用浓度为18％，但该浓度离心后HSC细胞层不集中，而用20％的浓度 较为理想，重复性好，故在本实验中采用20％Nycodenz作为分离介质。

Nycodenz的添加方法有2种，第一种是悬浮法，即将Nycodenz置于管 底，轻轻覆盖上相应体积的细胞悬液，形成不能混匀的两个液层，第二种是 混匀法，即将细胞悬液与Nycodenz混匀，再在上面覆盖少量的细胞培养液， 或Hank’s，发明人经比较选择了混匀法，该法密度梯度离心后，细胞数量多， 条带较为集中。

5.其他

消化好的肝组织粘稠度很高，不易过滤，影响HSC的得率和活力，因 此过滤时，我们加入4℃Hank’s液，不仅降低细胞悬液的粘稠度，同时也 可以降低链蛋白酶活性，减少对HSC的毒性作用，促使HSC的得率、纯度 和活力大大提高。

总之，本方法不需要昂贵的试剂、特殊的仪器设备，单层密度梯度离心 一步法即可分离纯化HSC，且细胞得率亦较高，适于推广应用，为进一步研 究肝星状细胞在肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化的形成机制奠定了基础。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并 不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内 做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。