一种富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：1)将肠膜明串珠菌(Leuconostoc？mesenteroides)BD3749发酵菌种接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液；2)将步骤1)所得发酵液冷冻干燥即得。制备方法所用培养基来源广、成本低，发酵菌种单一，上述组合有利于产品及其品质的标准化、工业大规模生产的成本控制以及食品安全性的保障。采用本发明制备的膳食补充剂打破了现有市场上稀缺以水不溶性葡聚糖作为功能性成分的膳食补充剂的现状，由于其中含有大量不易被消化的水不溶性葡聚糖，因此作为一种饱腹感强，低卡路里的膳食补充剂被应用于食品中，其应用前景十分广阔。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂及其制备方法。

背景技术

膳食补充剂是一种日常营养补充剂，其可通过维生素、矿物质、氨基酸等营养成分的补充，来提高机体健康水平和降低疾病发生风险，现有的膳食补充剂基本都是通过多种营养成分的组合制备而成的，复杂的配方大大增加了膳食补充剂在制备过程中被污染的风险，进而对消费者形成了潜在的威胁。水不溶性葡聚糖是一种不易被人体消化的微生物多糖，因此，若将其与与传统膳食补充剂配合使用势必相得益彰，不仅能获得基本的益生物质(如维生素、矿物质等)，而且可增强食用者饱腹感，并减少食物在体内因分解所产生的卡路里，然而，目前既能增强饱腹感又含有基本的益生物质的膳食补充剂市面上几乎没有，因此，利用安全性更高的微生物来生产一种饱腹感强，低卡路里并含有基本益生物质的膳食补充剂将是膳食补充剂的重要研究方向之一。

发明内容

本发明为了解决目前市场饱腹感强，低卡路里并含有基本益生物质的膳食补充剂严重匮乏的问题，提供了一种富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂及其制备方法。

本发明人发现利用保藏编号为CGMCCNo.10064肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)菌株代谢番茄汁蔗糖培养基后获得的发酵液中含有大量水不溶性葡聚糖，利用该发酵液制备得到了富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂，从而完成了本发明。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749的发酵菌种接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液；

2)将步骤1)所得发酵液冷冻干燥即得。

本发明步骤1)为：将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749的发酵菌种接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液。

本发明步骤1)所述的肠膜明串珠菌BD3749已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的建议的分类命名为：肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides，该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.10064，所保藏的培养物名称为：BD3749。

本发明步骤1)所述的番茄汁蔗糖培养基为常规的，较佳地由包括以下步骤的方法制备：番茄榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清液，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。其中，所述过滤的方法为常规的，较佳地为利用80～120目纱布过滤取汁；所述煮沸的时间为常规的，较佳地为1～10分钟(min)，更佳地为3～8分钟，最佳地为5分钟；所述离心为常规的，离心的速度较佳地为4,000～12,000g，更佳地为6,000～10,000g，最佳地为8,000g，离心的时间较佳地为8～12分钟，更佳地为9～11分钟，最佳地为10分钟；蔗糖的加入量较佳地为5～15％，更佳地为8～12％，最佳地为10％；所述灭菌为常规的，灭菌的温度较佳地为110～135℃，更佳地为115～125℃，最佳地为121℃，灭菌的时间较佳地为10～30分钟，更佳地为15～25分钟，最佳地为20分钟；所述pH值的调节方法为本领域常规的调节方法，较佳地为加入食品级碱调节pH值，所述食品级碱较佳地是：Na₂CO₃、NaHCO₃和NaOH中的一种或多种；所述pH值为本领域常规的，较佳地为5～8，更佳地为6～7，最佳地为7。

本发明步骤1)所述的发酵培养为常规的，所述发酵菌种的接种量较佳地为1％～5％，更佳地为2％～4％，最佳地为3％，所述百分比为体积百分比。所述的发酵培养较佳地为振荡发酵培养，所述振荡的速度较佳地为100～300rpm，更佳地为150～250rpm，最佳地为200rpm；发酵培养的温度较佳地为15℃～37℃，更佳地为25～33℃，最佳地为30℃；发酵培养的时间较佳地为24～96小时(h)，更佳地为48～84小时，最佳地为72小时。

本发明步骤2)为：将步骤1)所得发酵液冷冻干燥即得。

本发明膳食补充剂的制备方法，较佳地，在步骤2)所述的冷冻干燥之前还包括调节步骤1)所得发酵液的pH值的步骤，其中，所述的调节使用的为本领域常规方法，较佳地为利用食品级碱来调节，所述食品级碱为本领域常规，较佳地是Na₂CO₃、NaHCO₃和NaOH中的一种或多种；所述的pH值较佳地为6～8，更佳地6.5～7.5，最佳地为7。

本发明步骤2)所述的冷冻干燥为本领域常规的冻干(即冷冻干燥)方法，较佳地为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥条件为常规的，较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种如本发明所述的制备方法制得的富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂。

较佳地，所述膳食补充剂中水不溶性葡聚糖的含量≥3％，所述百分比为质量百分比。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：如本发明所述的富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂在制备食品中的用途。

本发明所述的用途为本领域常规用途，较佳地为将本发明所得富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂作为保健食品或食品添加剂的用途。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明采用的肠膜明串珠菌是乳酸菌的一种，与其他产水不溶性葡聚糖的菌株如文氏曲霉(Aspergilluswentii)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、芽孢杆菌(Bacillussp.)相比，其代谢产物来自安全性更高的微生物，从而具有更高的食品安全性。

2、本发明提供的膳食补充剂，其制备所过程采用的发酵培养基原料来源广泛、成本低廉、天然安全、发酵菌种单一，在降低物料成本的同时，提高了食品的安全性，并有利于产品及其品质的标准化和工业大规模生产的成本控制。

3、本发明利用产水不溶性葡聚糖的肠膜明串珠菌发酵天然的发酵培养基，结合冷冻干燥以及优选调节pH值等步骤的制备方法生产可直接食用的功能性膳食补充剂，改善了现有市场上稀缺富含水不溶性葡聚糖以此提高饱腹感、降低卡路里的功能性膳食补充剂的现状，得到了一种安全健康，可食用，生产成本低，适合于产业化生产，并受现代消费者欢迎的膳食补充剂。

附图说明

图1为肠膜明串珠菌BD3749水不溶性多糖的单糖组成色谱测定结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为15～25℃，实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。

实施例1富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂的制备

1、富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂的制备

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，80目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清，加入10％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以Na₂CO₃调节pH至7，121℃灭菌20min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

种子(发酵菌种)的制备：将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含2％(w/v)蔗糖的M17琼脂培养基(购自MerckCo.德国)上，28℃好氧培养24h后取出，用接种环挑取单菌落放入20mL含2％(w/v)蔗糖的M17液体培养基(购自MerckCo.德国)，28℃180rpm摇床培养24h后取出，将培养物9,000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。所述肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉由以下方法制备：挑取2个菌落，接种于300mL的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。

(1)将所得的肠膜明串珠菌BD3749种子以接种量3％(v/v)无菌接种于蔗糖百分比含量为10％的番茄汁蔗糖培养基，30℃，200rpm振荡培养72h，发酵结束后取发酵液，按照下述测定方法，测得该发酵液中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为0.92％。

发酵液中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量的测定方法：分别称取发酵液中水不溶性葡聚糖与发酵液冻干粉末的质量，并计算二者的质量比；其中发酵液中水不溶性葡聚糖按照下述制备方法制备，发酵液冻干粉末即为用于制备水不溶性葡聚糖的发酵液冻干后所得粉末。冻干条件为：板层初始温度-35℃，冷阱温度-55℃，板层装料厚度2.0mm，真空度20Pa，冻干时间3天。

发酵液中水不溶性葡聚糖的制备方法：将发酵液冻干(即冷冻干燥)后，将冻干粉末与2M的NaOH溶液以1g∶3mL的比例混合室温浸提2h，12,000rpm离心8min，取上清，用2M的HCl溶液调节pH至7，15,000rpm离心8min取沉淀，冷冻干燥即得水不溶性葡聚糖。

(2)将发酵液pH调节至7，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂A。

按照下述测定方法，测得本实施例生产的膳食补充剂A中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为6.43％。

膳食补充剂中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量的测定方法：分别称取膳食补充剂中水不溶性葡聚糖与膳食补充剂的质量，并计算二者的质量比；其中，膳食补充剂中水不溶性葡聚糖由下述方法制备而得。

膳食补充剂中水不溶性葡聚糖的制备方法：将膳食补充剂与2M的NaOH溶液以1g∶3mL的比例混合室温浸提2h，12,000rpm离心8min，取上清，用2M的HCl溶液调节pH至7，15,000rpm离心8min取沉淀，冷冻干燥即得水不溶性葡聚糖。

2、肠膜明串珠菌BD3749发酵液中水不溶性胞外多糖的单糖组成测定

(a)多糖水解

称取3mg由本实施例所得发酵液制备的水不溶性葡聚糖与2mL4mol/LTFA(三氟乙酸，购自Sigma-AldrichCo.LLC，美国)充分混合，充N₂封管，110℃烘箱中水解20h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N₂吹干，如此重复加甲醇并用N₂吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μm微孔膜过滤后供进样分析。

(b)色谱条件

色谱柱：CarboPacPA203mmi.d.×150mm；

流动相：A、H₂O；B、250mmol/LNaOH；C、1mol/LCH₃COONa；

三元梯度洗脱：流速：0.5mL/min；积分脉冲安培检测器；

Au工作电极：Ag/AgCl参比电极；

进样体积：20μL；柱温：30℃。

肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖的糖基组成的色谱分析结果见图1，该多糖在5.875min有单一吸收峰，且该吸收峰的保留时间与葡萄糖标品保留时间一致。

结论：肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖是由葡萄糖单一糖基组成，是一种葡聚糖。

实施例2富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂的制备

种子(发酵菌种)的制备方法、发酵液中水不溶性葡聚糖的制备方法、番茄汁发酵饮品中水不溶性葡聚糖的制备方法：同实施例1。

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸10min，4000g离心12min取上清，加入质量百分比为15％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以NaHCO₃调节pH至8，135℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

(1)将所得的肠膜明串珠菌BD3749种子以接种量5％(v/v)无菌接种于蔗糖质量百分比含量为15％的番茄汁蔗糖培养基，15℃，300rpm振荡培养24h，发酵结束后取发酵液，按照实施例1中的测定方法，测得该发酵液中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为0.86％。

(2)将发酵液pH调节至8，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂B。

按照实施例1中的测定方法，测得本实施例生产的膳食补充剂B中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为4.46％。

实施例3富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂的制备

种子(发酵菌种)的制备方法、发酵液中水不溶性葡聚糖的制备方法、番茄汁发酵饮品中水不溶性葡聚糖的制备方法：同实施例1。

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，120目纱布过滤取汁，煮沸1min，12000g离心8min取上清，加入质量百分比含量为5％蔗糖加热溶解后冷却至室温，以NaOH调节pH至5，110℃灭菌30min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

(1)将所得的肠膜明串珠菌BD3749种子以接种量1％(v/v)无菌接种于蔗糖质量百分比含量为5％的番茄汁蔗糖培养基，37℃，100rpm振荡培养96h，发酵结束后取发酵液，按照实施例1中的测定方法，测得该发酵液中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为0.38％。

(2)将发酵液pH调节至6，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂C。

按照实施例1中的测定方法，测得本实施例生产的膳食补充剂C中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为4.09％。

实施例4富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂的制备

种子(发酵菌种)的制备方法、发酵液中水不溶性葡聚糖的制备方法、番茄汁发酵饮品中水不溶性葡聚糖的制备方法：同实施例1。

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸8min，10,000g离心9min取上清，加入质量百分比含量为12％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以Na₂CO₃和NaHCO₃调节pH至6，115℃灭菌25min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

(1)将所得的肠膜明串珠菌BD3749种子以接种量2％(v/v)无菌接种于蔗糖质量百分比含量为12％的番茄汁蔗糖培养基，25℃，250rpm振荡培养48h，发酵结束后取发酵液，按照实施例1中的测定方法，测得该发酵液中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为0.64％。

(2)将发酵液pH调节至6.5，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂D。

按照实施例1中的测定方法，测得本实施例生产的膳食补充剂D中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为3.93％。

实施例5富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂的制备

种子(发酵菌种)的制备方法、发酵液中水不溶性葡聚糖的制备方法、番茄汁发酵饮品中水不溶性葡聚糖的制备方法：同实施例1。

番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，80目纱布过滤取汁，煮沸3min，6000g离心11min取上清，加入质量百分比含量为8％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以Na₂CO₃、NaHCO₃和NaOH调节pH至6.5，125℃灭菌15min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。

(1)将所得的肠膜明串珠菌BD3749种子以接种量4％(v/v)无菌接种于蔗糖质量百分比含量为8％的番茄汁蔗糖培养基，33℃，150rpm振荡培养84h，发酵结束后取发酵液，按照实施例1中的测定方法，测得该发酵液中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为0.84％。

(2)将发酵液pH调节至7.5，冷冻干燥后得本实施例的膳食补充剂E。

按照实施例1中的测定方法，测得本实施例生产的膳食补充剂E中水不溶性葡聚糖的质量百分比含量为6.83％。

效果实施例1产品口味与喜好程度测试

以实施例1-5制备的膳食补充剂A、B、C、D和E为实验对象，进行产品的口味测试。测试时间为成品完成后20℃环境下存放2周，感官检查项目为：色泽、酸甜比、风味、口感、营养，感官评分标准如表1所示。参加本实验人数为50人，感官评分项目取平均值，分数越高，表示越贴近产品的最佳特征，并统计被测试人员对产品的喜爱度，感官评分的结果如表2所示。

表1感官评分标准

表2感官评定结果

从产品口味测试和喜好程度统计结果可以看出，总体而言，本发明的富含水不溶性葡聚糖的膳食补充剂在产品风味、口感、营养方面可被大部分消费者所接受。

效果实施例2膳食补充剂中水不溶性葡聚糖的稳定性

将实施例1-5制备的膳食补充剂A、B、C、D和E，分装入无菌的铝箔袋，常温(25℃)保存6个月、9个月和12个月后取出，按照实施例1中的测定方法，分别测定其中的水不溶性葡聚糖的质量百分比含量，结果如表3所示。

表3膳食补充剂中水不溶性葡聚糖在常温保存条件下的稳定性

对比实施例1

将实施例1中的接种量，培养基pH，培养温度，发酵时间，发酵振荡的速度以及蔗糖浓度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的发酵液，各组中的水不溶性葡聚糖含量如表4所示。

表4不同方法制备所得水不溶性葡聚糖产量

从表4所示的结果中可以得出，将所述发酵液的制备方法中接种量，培养基pH，培养温度，发酵时间，发酵振荡的速度以及蔗糖浓度调整到本发明之外的时候，所得水不溶性葡聚糖的产量显著降低。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。