肽MDP-1在制备抗骨质疏松症药物中的应用

摘要

本发明公开了一种肽MDP-1在制备抗骨质疏松症药物中的应用，其中肽MDP-1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明通过体内实验发现肽MDP-1能够提高雌激素缺乏骨质疏松模型小鼠骨体积与组织体积比值、骨小梁厚度、骨小梁数目等指标，降低骨表面积与骨体积比值、骨小梁分离度等指标，而且能够抑制破骨细胞分化，并且无细胞毒性，因此肽MDP-1能够用于制备抗骨质疏松症的药物，尤其是制备抗绝经后骨质疏松的药物。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及肽MDP-1在制备抗骨质疏松症药物中的应用。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis)是临床上常见的代谢性骨病综合症。目前，全球约有2亿骨质 疏松症患者，我国有7000～8000万。骨质疏松症分为原发性和继发性两型。绝经后骨质疏松 (postmenopausalosteoporosis，PMOP)是原发性骨质疏松症的主要类型，其骨折率约为正常 人的4倍，对患者、家庭和社会造成沉重的经济负担。目前中国女性平均寿命延长，绝经后骨 质疏松更为严重，如何有效治疗骨质疏松，预防其并发症，改善绝经后女性生存质量，是目前 需要解决的重大问题。

破骨细胞的骨吸收功能在维持骨代谢平衡中具有关键作用，它有助于维持骨骼系统的完整 性和矿物质的稳态，与局部或全身性骨质疏松密切相关。破骨细胞的“形成和活化”是其发挥生 理作用的两个重要方面。力学刺激在调节破骨细胞形成、活化方面具有重要的作用，成骨细胞 骨形成与破骨细胞骨吸收动态平衡对维持生理状态骨代谢平衡具有关键作用，一旦平衡被打破 可导致骨质疏松等多种骨代谢性疾病。因此，破骨细胞是骨质疏松预防和治疗的重要靶点。

近年来虽然PMOP的药物治疗不断发展，使PMOP的治疗水平有所提高，但是目前治疗 骨质疏松的有效药物如雌激素、雷洛昔芬、二磷酸盐、骨化三醇、降钙素等都存在一些弊端， 如雌激素长期使用有致癌风险，降钙素可引起胃肠道反应和过敏，二膦酸盐类主要通过直接作 用于成熟型破骨细胞，干扰细胞内代谢并导致破骨细胞凋亡，但其不良反应多。因此，研究和 开发新型的抗骨质疏松药物是改善广大患者的生存质量，减轻家庭和社会经济负担的重要途 径。

而MDP-1仅在申请号为CN201510796065.6的中国专利中被首次报道，并提出该肽MDP-1 在制备抗感染、抗内毒素血症及抗脓毒症药物中的应用，而目前并没有任何有关肽MDP-1应 用于抗骨质疏松治疗的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肽MDP-1在制备抗骨质疏松症药物中的应用，本发明首次发 现肽MDP-1对骨质疏松具有改善作用，能够用于制备抗骨质疏松症的药物。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

肽MDP-1在制备抗骨质疏松症药物中的应用，其中肽MDP-1的氨基酸序列如 SEQ.ID.NO.1所示。

所述的抗骨质疏松症药物为用于防治绝经后骨质疏松症的药物。

所述的抗骨质疏松症药物为能够抑制破骨细胞分化的药物。

所述的抗骨质疏松症药物为能够抑制造血干细胞来源的破骨细胞分化的药物。

所述的抗骨质疏松症药物为能够抑制破骨细胞ROS产生的药物。

所述的抗骨质疏松症药物为能够增加骨厚度的药物。

所述的抗骨质疏松症药物为能够增加骨数量的药物。

所述的抗骨质疏松症药物为能够提高骨体积与组织体积的比值的药物。

所述的抗骨质疏松症药物为能够降低骨分离度的药物。

所述的抗骨质疏松症药物为能够降低骨表面积与骨体积的比值的药物。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供了肽MDP-1在制备抗骨质疏松药物中的应用，其中肽MDP-1是采用化学合成 的方法获得的一种由16个氨基酸组成的新型肽，肽MDP-1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所 示。本发明首次发现肽MDP-1对骨质疏松具有改善作用，能够用于制备抗骨质疏松症的药物。

本发明进一步通过体内实验，发现肽MDP-1对去除双侧卵巢后引起的骨质疏松有明显的 改善作用，本发明提供的肽MDP-1能够提高雌激素缺乏骨质疏松模型小鼠骨体积与组织体积 比值、骨小梁厚度及骨小梁数目等指标，降低骨表面积与骨体积比值和骨小梁分离度等指标， 因此肽MDP-1能够用于制备抗骨质疏松症的药物，尤其是能够用于制备防治绝经后骨质疏松 症的药物。

进一步实验证明，本发明提供的肽MDP-1是通过抑制破骨细胞分化，尤其是抑制造血干 细胞来源的破骨细胞分化，来产生抗骨质疏松作用的。通过实验发现，随着肽MDP-1剂量的 增加，破骨细胞形成的数目和面积逐渐减少。并且本发明提供的肽MDP-1在抑制破骨细胞分 化时所使用的浓度并无细胞毒性。

附图说明

图1为肽MDP-1对骨质疏松小鼠模型的各项指标的作用结果，其中(a)为骨小梁厚度 (Tb.Th)、(b)为骨小梁数目(Tb.N)、(c)为骨体积与组织体积比(BV/TV)、(d)为骨表面 积与骨体积的比值(BS/BV)、(e)为的骨小梁分离度(Tb.Sp)；SHAM为假手术组，OVX为 卵巢摘除术后小鼠骨质疏松模型组，OVX+T为卵巢摘除术后肽MDP-1治疗组。

图2为骨质疏松小鼠模型的Micro-CT骨小梁重建图，其中(a)为假手术组，(b)为卵巢 摘除术后小鼠骨质疏松模型组，(c)为卵巢摘除术后肽MDP-1治疗组。

图3为不同浓度的肽MDP-1干预细胞分化的染色图片，其中(a)、(b)、(c)、(d)、(e) 中肽MDP-1的浓度分别为0μM、10μM、20μM、50μM、100μM。

图4为不同浓度的肽MDP-1对破骨细胞毒性的作用结果，其中(a)为毒性试验48小时， (b)为毒性试验96小时。

图5为不同浓度的肽MDP-1对破骨细胞分化的数目和面积的作用结果，其中(a)为细胞 分化的面积，(b)为细胞分化的数目。

具体实施方式

下面结合附图和具体实验结果对本发明作进一步详细说明。

本发明的发明人所在的课题研究小组于前期工作中，采用化学合成的方法获得了一种由 16个氨基酸组成的新型肽MDP-1，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明的发明人通过 进一步的研究，检测了该肽MDP-1对去除卵巢的小鼠骨质疏松有明显的改善作用，并进一步 把肽MDP-1用于破骨细胞分化实验，发现其可以抑制破骨细胞分化。

本发明所研究的肽MDP-1的氨基酸序列如下：

MRWQEMGYIFYPRKLR(同SEQ.ID.NO.1)

编码所述肽MDP-1的核苷酸序列如下：

ATGAGGTGGCAAGAAATGGGCTACATTTTCTACCCCAGAAAACTACGA (SEQ.ID.NO.2)

下面对本发明提供的肽MDP-1抗骨质疏松作用及其抑制破骨细胞分化的具体实验和结果 进行详细说明。

1、肽MDP-1治疗对去除卵巢引起的骨质疏松的改善实验

将清洁级C57雌性9周小鼠30只，随机分为3组：

(1)假手术组(记为SHAM)：只切开缝合，不去除卵巢，术后第2天开始生理盐水0.1ml 腹腔注射；

(2)去除卵巢手术组(即卵巢摘除术后小鼠骨质疏松模型组，记为OVX)：手术切除双 侧卵巢，术后第2天生理盐水0.1ml腹腔注射；

(3)去除卵巢手术组+肽MDP-1(15mg/kg)治疗组(即卵巢摘除术后肽MDP-1治疗组，记 为OVX+T)：手术切除双侧卵巢术后第2天用肽MDP-1(15mg/kg)治疗。

每天治疗，持续2个月。实验结果如图1和图2所示。

图1为肽MDP-1对骨质疏松小鼠模型的各项指标的作用结果，从图1中可以看出，肽 MDP-1治疗组(OVX+T)的骨体积与组织体积比(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁 数目(Tb.N)比切除卵巢手术组(OVX)升高，而骨表面积与骨体积的比值(BS/BV)和骨 小梁分离度(Tb.Sp)较切除卵巢手术组降低。

图2为实验后骨质疏松小鼠模型的Micro-CT骨小梁重建图，可以看出图2(b)的去除卵 巢手术组中骨小梁的数量和体积与图2(a)的假手术组相比明显减少，而图2(c)的肽 MDP-1(15mg/kg)治疗组中骨小梁的数量和体积与图2(b)的去除卵巢手术组相比明显增多。

2、肽MDP-1对破骨细胞分化毒性作用

将清洁级C57雌性6周小鼠脱颈处死，75％酒精浸泡5分钟，无菌条件取双侧股骨、胫骨， 剥离软组织，切除股骨胫骨的两端，用PBS冲洗骨髓腔，离心800rmp，5分钟，去上清，加 红细胞裂解液2ml，放入37℃温箱5分钟，800rmp离心后，用8mlα-MEM重悬，加入40μl 5mg/mlM-CSF混匀，接种于10cm²培养皿，37℃培养箱培养。24小时后，将细胞接种于96 孔板中的20孔，分组如下：(1)分化组(对照组)0μM(2)分化加肽MDP-110μM(3)分 化加肽MDP-120μM(4)分化加肽MDP-150μM(5)分化加肽MDP-1100μM。48小时及 96小时，用CCK8在酶标仪检测每组细胞上清液吸光度值。

结果如图4所示，在48小时和96小时，不同浓度的肽MDP-1(0～100μM)对细胞无毒 性反应。

3、肽MDP-1对破骨细胞分化抑制作用

实验方法同上，不同浓度的肽MDP-1(0～100μM)干预细胞分化8天，TRAP染色，染色 图片如图3所示，染液配制方法及染色的步骤如下：

(1)GBC液：1:1FastGarrastGBCbasesolution和sodiumniltrissolution混匀，30秒。

(2)配染色液：

(3)锡纸避光大EP管中配好，放入37℃温箱待染；

(4)固定细胞：

将待染的细胞培养液吸去，PBS洗一次；

TRAP染色固定液加入，30秒；

37℃去离子水洗2次；

(5)用配好的染色液染色，放入37℃，温育20分钟；

(6)去离子水同上冲洗，苏木精染色，自来水冲洗2分钟。

实验结果如图5所示，随着肽MDP-1剂量的增加，破骨细胞分化的数目和面积均逐渐减 少，说明肽MDP-1具有抑制破骨细胞分化的作用。

综上，本发明通过体内实验发现肽MDP-1能够提高雌激素缺乏骨质疏松模型小鼠骨体积 与组织体积比值、骨小梁厚度及骨小梁数目等指标，降低骨表面积与骨体积比值和骨小梁分离 度等指标，而且能够抑制破骨细胞分化，并且无细胞毒性，因此肽MDP-1能够应用于制备抗 骨质疏松症的药物，尤其是制备抗绝经后骨质疏松的相关治疗药物。