单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法

摘要

本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1单纯疱疹病毒I型UL5基因的同源重组敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC-HSV-1载体和pREDI？重组质粒的宿主菌；S2？BAC载体的切除及HSV-1？UL5？基因缺失的DNA疫苗的获得。本发明属于生物医药技术领域，通过本发明提供的方法可以制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生毒力回复等优点，可有效防治HSV-1的感染。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的 DNA疫苗的制备方法。

背景技术

单纯疱疹病毒（Herpessimplexvirus，HSV），属于疱疹病毒科（Herpesviridae family），α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinaefamily）。HSV病毒为双链DNA病毒，从 外到内含有囊膜、皮层、衣壳及基因组等四种病毒结构。HSV-1是单纯疱疹病毒的一种，主 要引起喉、口、眼、脸及神经系统的感染，可引起疱疹性脑炎，唇疱疹等多种疾病。有调查结 果显示，90%以上的人一生中均会受到疱疹病毒的感染，单纯疱疹病毒感染已成为世界上第 四大的传染性疾病。

HSV病毒在细胞内的增殖是一个有序的复杂过程，按先后顺序HSV病毒的胞内增殖 过程大致可以分为以下几个阶段：1）病毒吸附于宿主细胞膜的表面；2）病毒穿过细胞膜；3） 病毒基因组进入细胞核内；4）病毒基因的表达；5）基因组DNA的复制；6）病毒核衣壳的组装； 7）病毒颗粒的形成；8）子代病毒的释放。HSV病毒在细胞内基因组DNA的复制是病毒产生致 病性的必须过程，若缺少该过程，将不能组装成完整的病毒颗粒，从而严重减低对机体的致 病性。

病毒减毒活疫苗是最为经典的疫苗形式，传统的减毒活疫苗主要是通过连续培养 筛选得到的，但这种方法耗时费力，用这种方法很难得到致病性降低的单纯疱疹病毒毒株。 中国专利申请201010253601.5公开了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方 法，该减毒活疫苗敲除了单纯疱疹病毒Ⅰ型基因组中的UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因。 该减毒活疫苗是敲除了其基因组中的复制或感染非必需基因片段，能够诱导机体的免疫应 答系统，及时清除感染的病毒，抑制感染的进一步发展，但其制备方法有诸多不足之处：（1） 选取拟敲除基因序列上下游700bp至2000bp的同源侧翼序列和荧光蛋白基因组成同源 重组框，由于目的片段太长使PCR扩增困难；（2）选择pShuttle-CMV载体，同源重组框整合到 拟敲除基因的正确位置效率偏低，成功机率不大；（3）用荧光蛋白基因代替拟敲除病毒基因 用于筛选鉴定，虽然此方法快速、简便，但最终未能将荧光蛋白基因去除，构建的减毒活疫 苗仍表达该蛋白。

因此，现有技术存在减毒活疫苗的制备方法复杂、成功效率偏低等缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的 DNA疫苗的制备方法，通过该方法可以制备得到减毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易发生 毒力回复等优点，可有效防治HSV-1的感染。

本发明提供一种单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法，包括如下 步骤：

S1单纯疱疹病毒I型UL5基因的同源重组敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌 株，所述同源重组敲除的重组敲除系统为包含BAC-HSV-1载体和pREDI重组质粒的宿主菌；

S2BAC载体的切除及HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗的获得。

优选地，所述步骤S1包括如下步骤：

S1.1pREDI重组质粒的构建：设计启动子PrhaB的PCR扩增引物，PCR扩增得到PrhaB片 段；设计I-SceI的PCR扩增引物，PCR扩增得到I-SecI片段；将所述PrhaB片段和所述I-SecI 片段通过重组PCR连接，得到PrhaB-I-SecI片段；将所述PrhaB-I-SecI片段和pKD46λ-red recombinase载体连接，获得pREDI重组质粒；

S1.2重组敲除系统的构建：将所述pREDI重组质粒转入含BAC-HSV-1载体的宿主菌中， 得到同源重组敲除的重组敲除系统；

S1.3UL5基因同源重组片段的PCR扩增：以所述重组敲除系统的Kam-SacB全片段为 模板，以CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA (SEQIDNO.1)为上游引物，以 GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQID NO.2)为下游引物，通过PCR扩增获得UL5C-Kam-SacB-B片段，再以该片段为模板， GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC(SEQID NO.3)为上游引物，以GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGC AAGAATGGCGC(SEQIDNO.4)为下游引物，通过PCR扩增获得UL5A-C-Kam-SacB-B片段，即UL5 基因同源重组片段；

S1.4携带正反选择标记基因的重组菌株的筛选:将所述UL5基因同源重组片段电转 化至所述重组敲除系统中，通过正向筛选标记基因Kam进行重组细菌的筛选；对转化获得 的单克隆进行PCR鉴定，确定筛选的重组菌株UL5基因的成功去除及正反标记基因的正确 插入；

S1.5去除正反选择标记基因的重组菌株的鉴定：鼠李糖诱导I-SceI内切酶合成，切除 Kam-SacB片段，发生第二次同源重组，得到不含UL5基因和外源基因的重组菌株。

本发明中重组敲除系统的构建与中国专利申请CN104894046中HSV-1病毒体外基 因敲除系统的构建方案相同，在此将中国专利申请CN104894046的相关内容引入本发明中。

优选地，所述步骤S2包括如下步骤：

S2.1将所述不含UL5基因和外源基因的重组菌株进行扩大培养，进行质粒抽提，获得 BAC-17.37ΔUL5质粒，电转化至Vero-pCDNA3.1-UL5-Cre细胞，使用含G418的培养基进行培 养，通过蓝白斑实验挑选白斑，反复冻融，离心取上清得到HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗；

S2.2将S2.1得到的HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗感染Vero-pCDNA3.1-UL5细胞，再 通

过蓝白斑实验挑取白斑，反复冻融，离心取上清，得到纯化后的HSV-1UL5基因缺失的 DNA

疫苗。

优选地，所述质粒抽提采用BAC大量抽提试剂盒进行；所述含G418的培养基包括 DMEM基础培养基、1~4%体积百分含量的胎牛血清和0.5~2ug/ml的G418。

优选地，所述Vero-pCDNA3.1-UL5-Cre细胞的制备包括如下步骤：

A）以BAC-17.37穿梭质粒为模板，设计引物扩增UL5基因，将该基因片段用BamHI和 BstXI限制性内切酶酶切后亚克隆到pCDNA3.1（+）质粒，得到pCDNA3.1-UL5质粒；

B）通过反转录P1噬菌体的RNA，扩增得到Cre基因片段，将所述pCDNA3.1-UL5质粒和Cre 基因片段经BamHI酶切后用T4连接酶进行连接，挑选单克隆进行Cre基因和UL18基因的PCR 鉴定和测序，得到真核表达pCDNA3.1-UL5-CRE质粒；

C）将所述pCDNA3.1-UL5-CRE质粒利用lipo2000脂质体转染到Vero细胞内，使用G418溶 液进行筛选，得到Vero-pCDNA3.1-UL5-CRE细胞。

优选地，所述Vero-pCDNA3.1-UL5细胞的制备包括如下步骤：

A）以BAC-17.37穿梭质粒为模板，设计引物扩增UL5基因，将该基因片段用BamHI和 BstXI限制性内切酶酶切后亚克隆到pCDNA3.1（+）质粒，得到pCDNA3.1-UL5质粒；

B）将所述pCDNA3.1-UL5质粒利用lipo2000脂质体转染到Vero细胞内，使用G418溶液进 行筛选，得到Vero-pCDNA3.1-UL5细胞。

优选地，所述UL5基因的扩增引物包括：上游引物：AATTGGATCCGAGCGTGGTGCG

GTCATG(SEQIDNO.5)；下游引物：AAGCTCGAGAGGGGACGGCGGGTTAATAG(SEQIDNO.6)。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

（1）本发明提供的制备方法简单、高效，制得的HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗不易发 生毒力回复，其病毒度滴度和感染能力明显减弱，保留了较高的免疫原性，进入机体后仅能 刺激机体产生免疫应答而无致病作用，安全有效。

（2）本发明提供的HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法合理、简单、高效， BAC载体上的red基因表达能够提高同源重组效率，鼠李糖诱导的I-SceI内切酶合成使基因 组发生第二次同源重组，切除外源性抗性基因和SacB基因，在敲除目的基因的同时未引入 外源基因，可控性强。

（3）构建的Vero-pCDNA3.1-UL18-CRE细胞可以在切割去掉BAC质粒的同时，还可以 提供基因缺失病毒株生长所需的VP23蛋白，使得HSV-1UL18基因缺失减活疫苗得到顺利的 纯化筛选，提高了纯化效率。

附图说明

图1Cre基因的PCR扩增产物验证电泳图；其中，M指DNAmarker，1指Cre基因目标 条带。

图2UL5基因的PCR扩增产物验证电泳图；其中，M指DNAmarker，1指阳性对照，2指 UL5基因目标条带。

图3去除正反选择标记基因的PCR扩增产物验证电泳图；其中A指UL5基因的验证 电泳图，B指Kam片段的验证电泳图，C指SacB片段的验证电泳图，M指DNAmarker，P指阳性对 照，N指阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1UL5基因表达载体的真核细胞株的构建

以BAC-17.37穿梭质粒为模板，设计引物（SEQIDNO.5、SEQIDNO.6）扩增UL5基因 （2696bp），将该基因片段用BamHI和BstXI限制性内切酶酶切后亚克隆到pCDNA3.1（+）质粒 （购自优宝生物公司，货号VT1001），得到pCDNA3.1-UL5质粒；

通过反转录P1噬菌体的RNA，扩增得到Cre基因片段，将所述pCDNA3.1-UL5质粒和Cre基 因片段经BamHI酶切后用T4连接酶进行连接，挑选单克隆进行Cre基因和UL5基因的PCR鉴定 和测序，结果如图1和图2所示，得到真核表达pCDNA3.1-UL5-CRE质粒；

将所述pCDNA3.1-UL5-CRE质粒利用lipo2000脂质体（购自invitrogen，货号为11668- 019）转染到Vero细胞（购自美国ATCC公司）内，使用1mg/ml浓度的G418溶液（购自东巨化 工公司）进行筛选，得到Vero-pCDNA3.1-UL5-CRE细胞。

将所述pCDNA3.1-UL5质粒利用lipo2000脂质体转染到Vero细胞内，使用1mg/ml浓 度的G418溶液进行筛选，得到Vero-pCDNA3.1-UL5细胞。

实施例2HSV-1UL5基因的同源重组敲除

2.1pREDI重组质粒的构建

设计启动子PrhaB的PCR扩增引物，PCR扩增得到PrhaB片段（2.0kb）；设计I-SceI的PCR 扩增引物，PCR扩增得到I-SecI片段（0.7kb）；将所述PrhaB片段和所述I-SecI片段通过重 组PCR连接，得到PrhaB-I-SecI片段；将所述PrhaB-I-SecI片段和pKD46λ-red recombinase载体连接，获得pREDI重组质粒。pREDI重组质粒具有由L-阿拉伯糖诱导启动 的λ-redrecombinase，以及由鼠李糖诱导启动的I-SecI内切酶基因。

2.2重组敲除系统的构建

将构建的pREDI重组质粒转入含BAC-HSV-1载体的宿主菌中，宿主菌为EPI300E.Coli， 得到同源重组敲除的重组敲除系统。

2.3UL5基因同源重组片段的PCR扩增

以重组敲除系统的Kam-SacB全片段为模板，以 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA(SEQID NO.1)为上游引物，以GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGC AAGAATGGCGC(SEQIDNO.2)为下游引物，使用HS高保真酶（购自TAKARA公司，货号为 N3901CA），通过PCR扩增获得UL5C-Kam-SacB-B片段，再以该片段为模板， GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC(SEQID NO.3)为上游引物，以GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGC AAGAATGGCGC(SEQIDNO.4)为下游引物，通过PCR扩增获得UL5A-C-Kam-SacB-B片段（约 3042bp），即UL5基因同源重组片段。

2.4携带正反选择标记基因的重组菌株的筛选

将所述UL5基因同源重组片段电转化至所述重组敲除系统中，通过正向筛选标记基因 Kam进行重组细菌的筛选；对转化获得的单克隆进行PCR鉴定，确定筛选的重组菌株UL5基 因的成功去除及正反标记基因的正确插入；通过第一次同源重组，完成了UL5基因的敲除， 但引入了外源基因。

2.5去除正反选择标记基因的重组菌株的鉴定

鼠李糖诱导I-SceI内切酶合成，切除Kam-SacB片段，发生第二次同源重组，即在A-C- Kam-SacB-B片段的C片段与UL5基因下游片段之间进行第二次同源重组，得到不含UL5基 因和外源基因的重组菌株。通过SacB反向筛选标记基因对正确去除标记基因的细菌进行 筛选，获得完全去除标记基因的UL5敲除菌株，不含外源基因。通过PCR对挑选的克隆进 行鉴定，除了阳性对照组能够扩增出UL5基因外，阴性对照及三个克隆均不能够扩增出 UL5基因，证明了UL5基因的成功敲除。通过Kam和SacB扩增引物对Kam和SacB进行验证， 除了阳性对照能扩增出Kam和SacB片段外，其余组均不能够扩增出Kam和SacB片段，说明 Kam片段和SacB片段已从HSV-1基因组内去除成功，PCR扩增产物的电泳图如图3所示。

实施例3BAC载体的切除及HSV-1UL5基因缺陷型毒株的获得

将所述不含UL5基因和外源基因的重组菌株进行扩大培养，采用BAC大量抽提试剂盒进 行质粒抽提，获得BAC-17.37ΔUL5质粒，电转化至实施例1构建的Vero-pCDNA3.1-UL5-Cre 细胞，使用含2%体积百分含量的胎牛血清和1ug/ml的G418的DMEM培养基进行培养，在细胞 发生病变前24h，移去细胞培养液，然后用含1%琼脂糖和2%FBS的DMEM培养基覆盖，当形成 可见病理效果后，加入含有400ug/mlX-gal（购自BioSynthAG瑞士）磷酸盐缓冲液，然后 通过蓝白斑实验挑选白斑，反复冻融，离心取上清，得到HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗。

将得到的HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗感染实施例1制得的Vero-pCDNA3.1-UL5 细胞，再通过蓝白斑实验挑取白斑，反复冻融，离心取上清，得到纯化后的HSV-1UL5基因 缺失的DNA疫苗（HSV-1-ΔUL5）。

实施例4重组HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗的复制感染

六孔板内每孔接种4×10⁵个Vero细胞，培养24小时，按感染复数(MOI)0.1、0.5和1分别 用野生型HSV-1（购自美国ATCC公司）和实施例3制得的HSV-1-ΔUL5感染Vero细胞，每个 滴度四个复孔，并设置不加病毒的正常细胞为对照。实验结果表明野生型HSV-1病毒株72小 时完全产生细胞病变效应（CPE），而HSV-1-ΔUL5病毒株＞10天未观察到CPE，说明重组HSV- 1-ΔUL5病毒株相对于野生型HSV-1而言复制和感染能力明显降低，基本无感染能力。

实施例5重组HSV-1UL5基因缺失的DNA疫苗的致病能力及免疫能力

本实施例，皆采用小鼠为实验观察。每次都以100ul体积的病毒悬液或其他对照溶剂腹 腔接种清洁级BALB/c小鼠（雄性，6-8周龄，体重(20土2)g，购自广东省实验动物中心）。注射 前使用NO进行短暂处理。若无特别说，病毒均悬浮于含2%PFBS的DMEM中。每天保证小鼠同等 且充足的食物和水。

分别向小鼠腹腔注射100ul体积5×10⁵pfuHSV-1、HSV-1-ΔUL5病毒株，并设注射 不含病毒株的溶剂为对照组，每组12只小鼠。结果如表2所示，野生型HSV-1注射组全部小鼠 由于感染于8天后死亡。而其它小鼠组均得以存活。

继续饲养以上存活的小鼠，30天后以最初给予的相同剂量的野生型HSV-1病毒株腹腔 注射进行免疫攻击，结果发现HSV-1-ΔUL5病毒感染组的小鼠都未发现死亡，只是在注射后 初期表现出一些不适。而溶剂对照组小鼠在注射9天后皆死亡。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。

SEQUENCELISTING

<110>暨南大学

<120>单纯疱疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制备方法

<130>

<160>6

<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

<213>人工序列

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