滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用

摘要

本发明提供了滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用。选用前列腺特异抗原(PSA)为模型目标分子。引物-纳米金-适配体/PSA/PSA抗体夹心结构的构建引发了滚环扩增反应，从而生成成千上万的聚胸腺嘧啶重复序列，以作为合成铜纳米颗粒的模板；进一步对形成的铜纳米颗粒用硝酸进行溶解，并用电化学方法对溶解得到的铜离子进行检测，最终实现对目标物PSA含量的确定。得益于所设计的信号级联放大策略，本方法检测PSA的线性范围为0.05fg/mL-500fg/mL，检测限为0.020±0.001fg/mL？PSA。最终，我们通过检测临床血清样品中的PSA含量对本方法的可实用性进行了验证。本方法的超灵敏度、特异性、以及检测实际样品的能力使其在疾病诊断应用中展示了巨大潜力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用。

背景技术

基于目标分子和生物识别分子之间的特异性相互作用对疾病的生物标志物进行检测对临床诊断有重要意义。通常，通过光学方法和电化学方法可以实现将这种生物绑定作用转换为可测量的信号。其中，光学方法具有高灵敏度，然而，这种信号转换方式不仅需要高精度的昂贵的仪器，也涉及到复杂的数值算法来分析数据，因此限制了这种方法的广泛应用。而电化学装置也能把生物反应转换成可检测的电信号，而且为医疗诊断提供了一个简单、准确和便宜的平台，并且很有可能实现便携的，实时现场的检测。更重要的是，结合电化学信号读出方法与各种行之有效的信号放大策略，可以得到高灵敏度、高特异性、高效的亲和性电化学生物传感器用于检测疾病标志物。

为了提高电化学生物传感器检测的灵敏度，基于DNA扩增技术的信号放大策略引起了人们研究的兴趣，包括聚合酶链反应(PCR)，链替代扩增反应(SDA)，环介导等温扩增法(LAMP)，杂交连锁反应(HCR)和滚环扩增技术(RCA)。在这些DNA扩增技术中，RCA是一个简单而强大的等温酶促过程，短的DNA或RNA引物在环状DNA模板和独特的DNA和RNA聚合酶的协助下发生链延伸，形成单链的DNA或RNA长链。由于快速、高效和特异性好等优点，RCA在众多分析应用中被广泛用于信号放大，如核酸、小分子、蛋白质、和病变细胞的检测，检测的目标甚至可以在aM浓度级别。RCA产物包含成千上万的串联重复序列，它们和环形模板是互补的。把这些串联重复序列转换成可检测电信号的读出方法对于实现各种分析目的是至关重要的。最常见的读出RCA产物的方法是与连有指示剂的互补寡核苷酸短链进行杂交，指示剂有荧光团，纳米粒子，量子点，联吡啶钌和酶等。相比之下，这种杂交方法涉及冗杂和耗时的过程，而另一种利用DNA插入分子的方法表现出相当大的便捷性，已被广泛用于读取RCA产物，插入分子包括亚甲基蓝，荧光染料，N-甲基卟啉二丙酸IX，银纳米粒子等。

最近，一种以DNA为模板合成的金属纳米颗粒作为DNA信号标记物出现，由于其毒性低，生物相容性好，光学特性优良，以及DNA识别和信号放大的集成策略的易实现，在生物分析方面吸引了越来越浓的兴趣。例如，富含胞嘧啶的DNA可以作为一种有效的制备银纳米团簇颗粒的模板，这已广泛用于核酸、小分子、蛋白质、和癌细胞的检测。除了DNA模板化的银纳米团簇颗粒以外，DNA模板化的铜纳米团簇颗粒，包括随机双链DNA模板化的铜纳米团簇颗粒和聚胸腺嘧啶模板化的铜纳米团簇颗粒，在生物传感方面已经吸引了越来越多的关注。以DNA为模板合成CuNPs可以在反应开始后几分钟内完成，比其他DNA模板化金属纳米颗粒的合成更快、更方便。高效、简单和快速的合成工艺使DNA模板化CuNPs在各种生物分析应用方面具有广阔前景。双链DNA模板化的CuNPs已经被用于检测小分子，酶活性，核酸和金属离子，并且结合HCR或RCA等DNA扩增技术能实现高灵敏度检测。与双链DNA模板化的CuNPs相比较，以聚胸腺嘧啶为模板合成的CuNPs在生物分析中的应用还处于非常初期的阶段。特别的是，以聚胸腺嘧啶为模板合成的CuNPs可以在没有链杂交的情况下合成，也就是说，只有包含超过15个连续胸腺嘧啶的单链的序列能引起明显的CuNPs形成，这是非常简单和明确的。此外，CuNPs的产率与以聚胸腺嘧啶的长度和数量高度相关，所以与可编程DNA扩增技术结合设计开发高选择性和灵敏度的生物传感器。众所周知，RCA可以有效地生成成千上万的单链的串联重复序列，可以直接作为CuNPs形成的模板。由此我们可以想象，用CuNPs标记RCA在生物分析应用上是一个完美的策略，兼具高灵敏度和选择性。

到目前为止，大多数基于DNA模板化的CuNPs分析方法基本上是荧光检测。然而，单个的CuNPs荧光发射只能持续20分钟，然后光强迅速下降，这可能会大大阻碍其在长期监测方面的应用。

发明内容

在本工作中，结合电化学方法在测定金属离子方面的优越性，利用电化学读取方法可以克服这一缺陷。我们设计了基于CuNPs标记的RCA级联信号放大策略，以电化学信号读取方式，对前列腺特异性抗原(PSA)模型目标分子进行了检测，如图1所示。引物-AuNPs-适配体/PSA/anti-PSA三明治结构的形成引发了RCA反应及随后CuNPs的形成。用凝胶电泳证实了RCA过程。通过透射电子显微镜(TEM)对以RCA产物为模板的CuNPs进行了表征。通过微分脉冲溶出伏安法(DPSV)检测从CuNPs溶解释放的大量的铜离子，可以评估PSA目标物的量。对可能会影响分析性能的实验条件进行了优化。建立了滴定曲线并确定了PSA检测极限。最后，利用所建立的方法测定了临床血清实际样品中PSA的含量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

以滚环扩增反应产物为模板合成的铜纳米颗粒CuNPs在电化学检测癌症标志物中的应用。

以滚环扩增反应产物为模板合成的铜纳米颗粒CuNPs在电化学生物分析中的应用。

以滚环扩增反应产物为模板合成的铜纳米颗粒CuNPs在电化学检测人类前列腺特异性抗原PSA中的应用。

一种基于DNA模板化的CuNPs电化学检测癌症标志物的方法，包括如下步骤：

构建能够与环状模板杂交并触发RCA反应的“primer-AuNP-aptamer/抗原/抗体”三明治结构；

引发了RCA反应，形成一个包含连续多个胸腺嘧啶的串联重复序列单链DNA；

合成CuNPs；

溶解上述CuNPs，以电化学方法检测Cu⁺含量；

根据Cu⁺与癌症标志物含量的对应关系，确定待测液中癌症标志物的含量。

优选的，所述“primer-AuNP-aptamer/抗原/抗体”三明治结构由primer-AuNP-aptamer生物共轭体与相应的抗体、抗原特异结合而成。

优选的，所述primer-AuNP-aptamer生物共轭体能够特异性识别相应的癌症抗原或癌症标志物并且形成三明治夹心结构。

优选的，所述primer-AuNP-aptamer生物共轭体通过金纳米粒子AuNPs和DNA序列间的Au-S键结合。

优选的，所述金纳米粒子AuNP作为载体增加了引物/适体的比例，从而放大信号。

优选的，在T4连接酶和环状模板DNA存在的情况下，primer-AuNP-aptamer生物共轭体中的引物可以与环状模板进行杂交并且在phi29DNA聚合酶的协助下进一步触发RCA反应。

本发明还提供了一种基于DNA模板化的CuNPs电化学检测人类人类前列腺特异性抗原PSA的方法，包括如下步骤：

构建能够与环状模板杂交并触发RCA反应的“引物primer-纳米金AuNP-适配体aptamer/PSA/PSA抗体anti-PSA”三明治结构；

引发了RCA反应，形成一个包含连续多个胸腺嘧啶的串联重复序列单链DNA；

合成CuNPs；

溶解上述CuNPs，以电化学方法检测Cu⁺含量。

优选的，所述“primer-AuNP-aptamer/抗原/抗体”三明治结构由primer-AuNP-aptamer生物共轭体与相应的抗体、抗原特异结合而成。

优选的，所述primer-AuNP-aptamer生物共轭体能够特异性识别相应的癌症抗原或癌症标志物并且形成三明治夹心结构。

优选的，所述primer-AuNP-aptamer生物共轭体通过金纳米粒子AuNPs和DNA序列间的Au-S键结合。

优选的，所述金纳米粒子AuNP作为载体增加了引物/适体的比例，从而放大信号。

优选的，在T4连接酶和环状模板DNA存在的情况下，primer-AuNP-aptamer生物共轭体中的引物可以与环状模板进行杂交并且在phi29DNA聚合酶的协助下进一步触发RCA反应。

本发明的有益效果：

在本研究工作中，我们第一次尝试将RCA反应和单链DNA为模板的CuNPs合成方法相结合，用于电化学生物分析的级联信号放大。作为概念验证，我们以PSA为模型目标物开发了一种超灵敏、高选择性、低成本的电化学检测方法。其中，引物-金纳米粒子-适配体/PSA/anti-PSA夹心结构的形成触发了有效的RCA反应。CuNPs在RCA产物上的直接形成保证了级联信号放大的简单性。另外，使用的引物-金纳米粒子-适配体的生物共轭体使信号增强了约七倍。最后，通过使用灵敏的DPSV来检测以RCA产物为模板的CuNPs释放的铜离子，以实现对PSA更为灵敏的检测。该方法的线性范围为0.05fg/mL-500fg/mL，检测限为0.020±0.001fg/mLPSA。更重要的是，该方法被证实可以在临床检测中应用。此外，通过使用相应的亲和配体，该方法可以扩展到其它多种疾病标志物的检测中，在疾病诊断方面具有巨大的潜力。

附图说明

图1.信号级联放大策略用于癌症标志物的检测示意图。

图2.(A)琼脂糖凝胶电泳图：a-RCA产物，b-对照试验(无引物)，c-指示剂，其中用虚圆线标记的条带代表15000个碱基对的位置。(B)RCA产物的电镜图像。(C)以RCA产物为模板合成的铜纳米颗粒的电镜图像。

图3.(A)该电化学方法检测PSA的CV曲线：a-没有PSA，b-含有1.0pg/mLPSA，插图是相应的DPSV曲线图。(B)分别使用引物-金纳米颗粒-适配体共轭物(a)和不含金纳米颗粒的引物-适配体检测1.0pg/mLPSA所得的DPSV曲线。

图4.(A)底物/适配体比例、(B)RCA反应时间、(C)沉积电位、(D)沉积时间对于电流信号的影响。

图5.(A)该方法检测不同浓度的PSA所得的DPSV曲线(从a到m浓度分别为：0，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100，500，1000fg/mL)。(B)相应的滴定曲线。

图6.该方法检测100fg/mlPSA，10pg/mlAFP，10pg/mlCEA，10pg/ml凝血酶，和10pg/mlH-IgG时的电化学响应。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1.实验部分

1.1.试剂和材料

人类前列腺特异性抗原(PSA)、从老鼠中提取的单克隆抗体anti-PSA(抗-PSA)，甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)购自上海领潮生物科学有限公司(中国)。5'端巯基修饰的PSA特异性DNA适配体(5'-SH-TTATTATTAAATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTTT-3')，5'端巯基修饰的引物(5'-SH-TTATTATTATGTCCGTGCTAGAAGGAAACAGTTAC-3')，环状模板(5’-p-TAGCACGGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTAACTGTTTCCTTC-3′)，牛血清白蛋白(BSA)、凝血酶和人免疫球蛋白G(H-IgG)是从上海生工生物技术股份有限公司(中国)得到的。从ThermolFermentas(立陶宛)公司购置了Phi29DNA聚合酶，T4DNA连接酶和dNTP。从山东大学齐鲁医院收集人类血清样本。用0.01M磷酸氢二钠、0.01M磷酸二氢钠和与0.9％氯化钠溶液制得PBS。用碳酸钠和碳酸氢钠配制了碳酸盐缓冲溶液(0.05M,pH值0.05)并用于抗体固定。用10mM三羟甲基氨基甲烷和1mM乙二胺四乙酸制备的缓冲液TE-buffer(pH8.0)用来稀释DNA序列。所有其他化学品均为无需进一步提纯的超纯分析等级的试剂。超纯水电阻为18.25MΩcm用于准备所有的水溶液。

1.2.仪器

电化学测试在CHI660E电化学工作站(上海辰华，中国)上进行。电化学池包括一个金盘电极(面积0.07cm²)，银/氯化银电极(在饱和KCl)和铂丝分别作为工作、参比和对电极。用透射电镜(Jeoljem-1011)证实了CuNPs的形成。

1.3.引物-AuNP-核酸适体结合体的制备

引物-AuNPs-核酸适体结合体是通过AuNPs和DNA序列间的Au-S键结合的。首先，按照以前报道过的程序制备AuNPs。简单地说，50毫升的0.01wt％HAuCl₄的水溶液与1毫升的38.8mM柠檬酸钠混合。1分钟后，0.5毫升的新鲜的NaBH₄溶液缓慢加入到混合物中。添加NaBH₄期间，生成的溶液颜色从黄色变到粉红色，说明AuNPs的形成，然后，将获得的AuNPs与硫醇化适体(200nM)和硫醇化引物(1μM)混合，然后在4℃下孵育12小时，形成Au-S键。然后，未反应的DNA序列通过离心(13000rpm)15分钟，去掉上清液，并将沉淀物用TE-buffer缓冲液洗三次。由此产生的引物-AuNPs-核酸适体结合体被分散在0.1MTE-buffer缓冲液中待用。

1.4.建立引物-AuNPs-核酸适体/PSA/anti-PSA三明治结构

图1展示了PSA检测的原理和过程。50微克/毫升的anti-PSA(25μL)在0.05M碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)中，然后添加到空白的聚苯乙烯培养板上的孔中，在4℃下孵育一夜使anti-PSA固定。过量的anti-PSA用碳酸盐缓冲溶液彻底冲洗干净。为了减少非特异性吸附，在37℃下将1％BSA加入孔中孵化1h来封闭未反应的活性位点。洗涤后，把10mMPBS(pH7.4)中的PSA添加进固定好anti–PSA的孔中，并在37℃下孵育1h。然后用10mMPBS将未固定的PSA洗掉。然后，将准备好的引物-AuNPs-核酸适体加到孔中，37℃下孵化1h，使适配体对被anti-PSA捕获的PSA进行再次识别和绑定。终归，通过anti-PSA和PSA适配体对PSA的双重识别，形成了primer-AuNP-aptamer/PSA/anti-PSA的三明治夹心结构

1.5.RCA反应和铜纳米粒子的形成

1μm环形模板DNA在90℃下退火5min，然后添加到上述培养板的孔中，与primer-AuNP-aptamer/PSA/anti-PSA结构一起在37℃下培养30min。随后，将0.125μL的T4DNA连接酶和2.5μL的10×T4DNA连接酶缓冲液(400mMTris-HCl，100mMMgCl2，100mMDTT，5mMATP，PH7.6)加入到反应孔中，并且在37℃下培养1h。结束后，将反应孔中的残余液体移除。为了进行RCA反应，将2.5μL10×反应缓冲液(330mMTris–acetate，100mMMg(Ac)2，660mMpotassiumacetate(KAc)，1％Tween20and10mMDTT，pH7.9)，0.125μL(10u/μL)phi29DNApolymerase，5μL10mMdNTPs，and17.5μLH₂O添加到反应孔中，在37℃下培养80min后，用TE缓冲液冲洗反应孔三次。随后，添加抗坏血酸钠和硫酸铜。CuNPs的形成反应在室温下进行30min，最后，轻轻地清洗反应孔三次。

1.6.电化学测量

首先，使用0.05μm的氧化铝研磨液将金圆盘电极在麂皮上镜面抛光。然后超声处理15s以除去氧化铝颗粒和其他杂质，并先后用超纯水和乙醇进行清洗。为了进一步清洁和激活电极表面，将金圆盘电极放入0.5M的硫酸溶液中，使用循环伏安法在100mV/s扫速下于-0.2V至1.6V之间进行扫描，直到得到稳定的循环伏安曲线。然后电极用超纯水彻底清洗以便于以后的使用。另一方面，将以RCA产物为模板合成的铜纳米粒子在浓硝酸中溶解30min后转化为Cu²⁺，并将溶液稀释至0.5M硝酸。最后，用活化过的金圆盘电极检测溶液中的Cu²⁺。循环伏安法在-0.2V至0.6V的电位范围内进行，扫描速度为50mV/s。溶出伏安法的参数设置如下：扫描范围：-0.2V至0.6V；电势增幅：0.004V；振幅0.05V；脉冲宽度：0.05s；脉冲周期：0.5s；沉积电位：-0.5V；沉积时间：300s。

1.7琼脂糖电泳分析

为了验证RCA反应，我们进行了凝胶电泳实验。凝胶电泳是用0.7％的琼脂糖凝胶在TAE缓冲溶液(40mM三氨基甲烷，20mM醋酸，2.0mM乙二胺四乙酸，pH8.3)中恒定电压120V下进行1.5h。在溴化乙锭溶液中染色5min后，凝胶电泳在Tanon-2500R成像系统(上海，中国)中成像。

2、结果与讨论

2.1.设计原理

本设计方案的原理如图1所示。固定在培养板孔中的Anti-PSA和处于primer-AuNP-aptamer生物共轭体中的适配体能够特异性识别PSA并且形成三明治夹心结构。在这里，金纳米粒子作为载体增加了引物/适体的比例，从而放大信号。在T4连接酶和环状模板DNA存在的情况下，primer-AuNP-aptamer生物共轭体中的引物可以与环状模板进行杂交并且在phi29DNA聚合酶的协助下进一步触发RCA反应。由于模板设计包含着50个连续的腺嘌呤碱基，因此所得的RCA产物是一个包含连续50个胸腺嘧啶的串联重复序列单链DNA。在Cu²⁺和抗坏血酸盐存在的条件下，每50个胸腺嘧啶都可以作为特定模板合成铜纳米颗粒。经洗涤后，在孔中加入浓硝酸，以RCA产物为模板形成的铜纳米粒子可以溶解并且释放大量的Cu²⁺，然后用伏安法测量其中的铜离子，以确定被测PSA的量。相比之下，当PSA目标物不存在时，该流程将无法进行，将不会测得相应的电化学信号。因此，被测目标物PSA的量可以通过该方案进行灵敏检测。

2.2表征

琼脂糖凝胶电泳实验用来验证RCA反应。如图2A所示，RCA产物表现出极低的流动性(条带a)，说明该产物具有很高的分子量。根据指示剂条带(条带c)所显示的结果，RCA产物中的碱基数远高于15000bp，这表明RCA反应成功地实现了。相反，在没有引物(条带b)的控制实验中，RCA不能被触发，所加的短的DNA链快速地游出了凝胶，因此没有观察到任何条带。这些结果证明RCA反应成功进行。

我们用TEM证实了铜纳米粒子在RCA产物上的合成。如图2B所示，在RCA产物的TEM图像中，观察到灰色的团状物质，这实际上是残留在团状RCA产物表面的盐所形成的图像。单个RCA团状物的直径约为1μm，这跟之前的报告一致。有趣的是，在与Cu²⁺和抗坏血酸反应之后，RCA团状物中出现了直径约为100nm的黑色纳米粒子(图2C)，表明了铜纳米颗粒在RCA产物上的成功形成。与之前文献所报道的在40个连续胸腺嘧啶序列上形成的直径5nm的铜纳米粒子相比，在本工作中铜纳米粒子尺寸的增加主要是由于团状的RCA产物中串联的50个连续的胸腺嘧啶使形成的铜纳米粒子发生了聚集。

我们进一步用CV和DPSV对所设计的方案进行了电化学表征。图3A为没有PBS的空白试验和有1.0pg/mLPSA存在的实验的CV响应。空白实验的CV图没有氧化还原峰(曲线a)，相反，当有1.0pg/mLPSA存在时，所得CV在0.33/0.28V附近出现了一对显著的氧化还原峰，这与溶解的Cu²⁺的氧化还原反应相对应，表明本工作所设计的铜纳米颗粒报道RCA扩增的信号放大策略用于PSA的检测是可行的。另外，当有1.0pg/mLPSA存在时，我们用高灵敏的DPSV对所得的铜离子进行检测，得到更加明显的氧化电流信号(图3A的插图)，从而提高了检测方法的灵敏度。因此，在后续实验中，DPSV被用来进行电化学测试。

为了验证所用金纳米粒子在信号放大中的作用，我们进行了没有金纳米粒子载体的对照实验。在实验中，我们用一段包含引物片段和适体片段的DNA序列(表示为primer-aptamer)来代替primer-AuNP-aptamer生物共轭体，对1.0pg/mLPSA进行检测，在形成primer-aptamer/PSA/anti-PSA三明治结构后，进行后续的RCA反应和CuNPs合成，并通过DPSV测量从形成的铜纳米颗粒上溶解的Cu²⁺。图3B比较了在使用primer-AuNP-aptamer及primer-aptamer对1.0pg/mLPSA进行检测时所得的DPSV响应曲线(分别为曲线a和曲线b)。显然，前者的电流强度大约是后者的7倍，证实primer-AuNP-aptamer生物共轭体通过增大primer和aptamer的比例，对可测信号进行了放大。

2.3实验条件的优化

为了达到所建立方法的最佳效果，我们优化了可能显著影响分析效果的实验条件，包括primer-AuNP-aptamer生物共轭中的引物/适体比例、RCA反应时间、DPSV沉积电位和沉积时间等参数。为了达到引物-金纳米粒子-适配体的生物共轭体最大的信号放大能力，我们改变引物/适体的比例(2:1、3:1、4:1、5:1、6:1和7:1，用固定的200nM适体)合成了引物-金纳米粒子-适配体的生物共轭体，并研究了不同的引物/适体比例对于相应信号的影响。如图4A中显示，随着引物/适体比的增加电流响应显著增加，在5：1达到最高值，然后当引物/适体比率高于5:1开始降低。电流的降低可能是由于过量的引物占据了纳米金颗粒上本来属于适体的结合部位，以至于形成了不含有适体的生物共轭体。因此，5：1的引物/适体比例被用来合成引物-金纳米粒子适配子的生物共轭体。

为了尽可能生成长的RCA产物以便提高信号放大倍数，我们对RCA反应时间对电化学信号响应的影响进行了研究，如图4B所示。开始时，响应随着RCA反应时间的增加显著增强，表明RCA产物的有效扩增。然而，该响应的上升速度在60分钟后减慢并在80分钟时达到饱和，这可能是由于RCA反应底物的耗尽或phi29DNA聚合酶的失活所导致的。因此，在接下来的RCA反应中，80分钟被选定为充分的反应时间。

因为溶解的铜离子的浓度反映了PSA的量，因此铜离子的灵敏检测在整个试验中具有显著重要性。因此，对沉积电位和沉积时间等重要的DPSV参数进行了优化。我们通过改变铜沉积时所施加的沉积电位来研究其对电化学信号的影响。如图4C所示，随着施加电位从-0.1V变化至-0.5V，电流响应逐渐增加，然后在-0.5V以上几乎达到恒定值。因此，-0.5V被用作Cu²⁺DPSV分析的沉积电位。图4D显示了沉积时间对电化学信号的影响。电流响应随沉积时间的增加而迅速增大。然而，由于沉积铜的饱和，当沉积时间大于300秒时电流没有明显的升高。因此，在以下实验中Cu²⁺分析的沉积时间确定在300秒。

2.4、PSA的检测

在上述最佳实验条件下，我们用所建立的方法对10mMPBS中的不同浓度的PSA进行了检测。将所得的DPSVs表示在图5A中，从图中看出，随着PSA的浓度从0增加到1000fg/mL，电流也逐渐增大(曲线a到m)。图5B中的滴定曲线显示，当PSA浓度在0.05fg/mL-500fg/mL范围内，-ΔI_p(有PSA和没有PSA时峰电流差的负值)与log(c_PSA(fg/mL))呈线性关系，其线性方程式为：-ΔI_p(μA)＝(5.96±0.09)+(3.48±0.08)[log(c_PSA(fg/mL))]，相关系数为0.995。基于五次空白实验标准偏差的测量(95％可信度，k＝3，n＝5)，确定PSA的检测限为0.020±0.001fg/mL，至少比此前公布的检测PSA的电化学方法的检测限低四个数量级。本方案所设计的级联信号放大策略最终实现了电化学生物分析方法的超高灵敏度。

2.5、选择性和重现性

为了研究该方法的选择性，我们对血清样品中的一些可能与PSA共存的生物分子进行了检测，包括AFP，CEA，凝血酶和H-IgG。该方法对不同的分析物的电化学响应显示在图6中。很明显，该检测方案对于100fg/mL的PSA有显著的电流响应，而对10pg/mL的AFP，CEA，凝血酶，和H-IgG抗体仅有极轻微的相应，表明该方法对PSA的检测有很好的选择性。这样优异的选择性归因于anti-PSA和PSA特异性适体对PSA的双重识别。

为了研究该方法的重复性，在相同的实验条件下进行了五个平行实验，并且被检测的PSA浓度也相同。结果相对标准偏差小于6.8％，证明该实验方法有良好的重现性。

2.6、实际样品分析

我们通过分析临床上人血清样品中PSA的含量对该方法的实用性进行了评价。人血清样品从齐鲁医院获得。由于这些血清样品中PSA的浓度远超出所建立方法的线性范围，所以在检测之前需要适当稀释。该方法的检测结果与医院提供的使用Cobas6000分析系统的电化学发光免疫测定法(ECLIA方法)得到的数据相比较，相对偏差低于6％(表1)，表明该方法在临床应用中的潜力。

表1.该方法和ECLIA方法对临床人类血清样本的检测结果比较。

3、结论

在本研究工作中，我们第一次尝试将RCA反应和单链DNA为模板的CuNPs合成方法相结合，用于电化学生物分析的级联信号放大。作为概念验证，我们以PSA为模型目标物开发了一种超灵敏、高选择性、低成本的电化学检测方法。其中，引物-金纳米粒子-适配体/PSA/anti-PSA夹心结构的形成触发了有效的RCA反应。CuNPs在RCA产物上的直接形成保证了级联信号放大的简单性。另外，使用的引物-金纳米粒子-适配体的生物共轭体使信号增强了约七倍。最后，通过使用灵敏的DPSV来检测以RCA产物为模板的CuNPs释放的铜离子，以实现对PSA更为灵敏的检测。该方法的线性范围为0.05fg/mL-500fg/mL，检测限为0.020±0.001fg/mLPSA。更重要的是，该方法被证实可以在临床检测中应用。此外，通过使用相应的亲和配体，该方法可以扩展到其它多种疾病标志物的检测中，在疾病诊断方面具有巨大的潜力。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。