ELL(C595A)突变体在促进肿瘤转移中的应用

摘要

本发明公开了ELL(C595A)在促进肿瘤细胞迁移中的应用，本发明提供了ELL(C595A)蛋白在如下1)-6)至少一种中的应用：1)制备促进肿瘤转移产品；2)制备促进肿瘤细胞迁移产品；3)制备提高肿瘤细胞侵袭能力产品；4)制备提高与肿瘤转移相关的基因表达产品；5)制备用于筛选治疗肿瘤转移的动物模型；6)制备用于研究肿瘤转移机制的动物模型；本发明发现ELL突变体ELL(C595A)蛋白，促进肿瘤转移，提高肿瘤细胞侵袭能力；可制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的动物模型；可制备用于研究肿瘤转移机制的动物模型。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及ELL(C595A)在促进肿瘤细胞迁移中的应 用。

背景技术

ELL的基因产物首先被定义为MLL基因在急性髓性白血病(AML)(Thirman等人 1994)的易位部分。进一步的生化研究鉴定出ELL作为转录延伸因子，可以在体外实 验中增加RNA聚合酶II的转录延伸活性，后来的体内研究揭示出其相关联地转录活性 基因座(Eissenberg等人2002，Shilatifard等人1996)。ELL是两个不同的延伸复 合体的一部分，即超级延伸复合体(SEC)和小延伸复合体(LEC)(Hu等人2013，Luo 等人2012，Smith和Shilatifard2013)。作为正转录延伸因子(P-TEFb)中最活跃 的形式之一，超级延伸复合体(SEC)执行几项重要功能，例如HSP70诱导热休克，发 育基因响应环境胁迫(Lin等人2010，Lin等人2011)，MLL-AFF1-transformed细胞 中的HOX基因失调(Lin等人2010)，以及HIV的转录激活(He等人2010,Sobhian等 人2010)。小延伸复合体(LEC)在snRNA基因转录的启始和延伸阶段调节小核RNA(small nuclearRNA)的转录及功能(Hu等人2013，Smith等人2011)。

ELL在哺乳动物的胚胎发育中是必需的，因为ELL靶向敲除的小鼠出现胚胎致死 (Mitani等人2000)。此外，ELL作为类固醇受体，低氧诱导因子1-α(HIF-1α)， E2F1和TFIIH复合体的伴侣，以一种或正或负的方式来调节它们结合伴侣的活性 (Pascual-LeTallec等人2005)(Liu等人2010a)(Mourgues等人2013，Zhang等 人2014)。综上，ELL有着非常多样化的功能；然而，其在生理条件下确切的作用机 制仍然未知。

原癌基因c-Myc，最初通过在宿主细胞基因组中识别可比v-Myc(comparable v-Myconcogene)被首次确认(Vennstrom等人1982)。随后的研究表明，人类c-Myc 在多发性骨髓瘤中频繁易位(Shou等人2000)，并在许多不同的人类癌症中高表达或 突变(Beroukhim等人2010)，从而证实它是一个人类癌基因(Dang2012)。c-Myc 基因编码一种在调节基因表达方面有重要作用的多功能转录因子，其功能牵涉到诸多 生物过程，这些过程有助于肿瘤发生，肿瘤发展，以及肿瘤转移(Dang2012)。

c-Myc是一个可以调节多个生理过程的不稳定蛋白。泛素-蛋白酶体途径(UPS) 是c-Myc在细胞中降解的最突出的机制之一(FarrellandSears2014)。鉴于浩如烟 海的底物需要相应的特异性靶向E3泛素连接酶，因此人类E3连接酶的估计数目大于 600(Berndsen和Wolberger2014)。E3连接酶可分为三大家族：最新发现的(RING) -FINGER家族,HECT家族和RING-between-RING(RBR)家族(Berndsen和Wolberger 2014)。RING-FINGERE3连接酶可以直接催化泛素从E2转移到底物。与此相反，HECT 和RBRE3连接酶催化的是两步反应，其中泛素首先从E2转移到E3的一个活性的半胱 氨酸位点，然后再从从E3到底物。作为RING-FINGER结构泛素连接复合体的组分之一 (Farrell和Sears2014)，FBW7(通过介导c-Myc降解来抑制其活性)是研究得最充 分的E3泛素连接酶；它识别第c-Myc第58位苏氨酸(T58)的磷酸化，该磷酸化通过 通过糖原合酶激酶3(GSK3)介导(Welcker等人2004，Yada等人2004)。另一个 RING-FINGERE3连接酶Skp2，能够识别在c-Myc氨基末端的一段保守序列元件(MBII) 和HLH-LZ基序(第367-439氨基酸)，促进它的多泛素化和降解，并导致c-Myc转录 活性的增强(Kim等人2003，vonderLehr等人2003)。第三个RING-FINGERE3连 接酶β-TRCP，结合在c-Myc的氨基末端，并使用UbcH5泛素结合酶(E2)以形成c-Myc 上的异型泛素链；从而增强c-Myc的稳定性(Popov等人2010)。唯一被报道过的c-Myc 的HECTE3连接酶HectH9，泛素化c-Myc形成一个63位赖氨酸的多聚泛素链(Adhikary 等人2005)，其并不引起的c-Myc降解，但却是c-Myc反式激活多个靶基因所必需的 (Adhikary等人2005)。因此，c-Myc的稳定性和泛素化之间存在着复杂的关联性， 正如同c-Myc的转录活性和稳定性之间的关系一样。

作为经典原癌基因之一，c-Myc在约70％的人类肿瘤中存在过量表达；然而，这 些肿瘤中只有20％表现出的c-Myc基因扩增或易位，这足以解释c-Myc在蛋白水平的 高表达(Farrell和Sears2014)。因此，在人类肿瘤中观察到的c-Myc蛋白的过表达 可能与相应的E3泛素连接酶的下调有关。事实上，肿瘤中已经报道了c-Myc的一些 E3连接酶的异常表达和/或突变。值得注意的是，在人类癌症中FBW7的点突变可以导 致其失活，并且可能不表达(Farrell和ears2014)。最近有研究表明，FBW7通过调 节c-Myc的稳定性来影响白血病起始细胞活性，FBW7对c-Myc的泛素化的调节会控制 慢性髓细胞性白血病发生和发展(King等热2013，Reavie等人2013)。与此相反， c-Myc的转录活性的正调控基因Skp2和HectH9显示出致癌性，他们的过表达在许多 人类肿瘤中所验证(Farrell和Sears2014)。

发明内容

本发明一个目的是提供ELL(C595A)蛋白的新用途。

本发明提供了ELL(C595A)蛋白在如下1)-6)至少一种中的应用。

1)制备促进肿瘤转移产品；

2)制备促进肿瘤细胞迁移产品；

3)制备提高肿瘤细胞侵袭能力产品；

4)制备提高与肿瘤转移相关的基因表达产品；

5)制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；

6)制备促进肿瘤转移的模型；

所述ELL(C595A)蛋白的氨基酸序列为将ELL蛋白的氨基酸序列第595位半胱氨 酸突变为丙氨酸得到的序列。

所述ELL蛋白氨基酸序列为序列表中序列2。

上述应用中，所述与肿瘤转移相关的基因为S100A、MARCKSL1、BCAM、BAG4、IPO9 和/或CPSF7。

上述应用中，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为结肠癌细胞；所述结肠癌细胞 具体为HCT116细胞；

所述产品为试剂盒或药物。

所述模型为动物模型，所述动物具体为小鼠。

本发明另一个目的是提供如下1)-6)中任一种产品。

本发明提供了1)-6)中任一种产品，其包括ELL(C595A)蛋白；

1)制备促进肿瘤转移产品；

2)制备促进肿瘤细胞迁移产品；

3)制备提高肿瘤细胞侵袭能力产品；

4)制备提高与肿瘤转移相关的基因表达产品；

5)制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；

6)制备促进肿瘤转移的模型；

所述ELL(C595A)蛋白的氨基酸序列为将ELL蛋白的氨基酸序列第595位半胱氨 酸突变为丙氨酸得到的序列。

所述ELL蛋白氨基酸序列为序列表中序列2。

上述产品中，所述与肿瘤转移相关的基因为S100A、MARCKSL1、BCAM、BAG4、IPO9 和/或CPSF7。

上述产品中，所述肿瘤为结肠癌；所述肿瘤细胞为结肠癌细胞；所述结肠癌细胞 具体为HCT116细胞。

上述产品中，所述产品为试剂盒；

所述模型为动物模型，所述动物具体为小鼠。

本发明第三个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，其为如下1)或2)：

1)所示的蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第595位半胱氨酸突变为丙氨 酸得到的序列；

2)将1)所示的蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。

本发明的实验证明，本发明发现ELL突变体ELL(C595A)，失去E3泛素连接酶功 能，不能有效降解c-Myc蛋白，该突变体也不能抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤形成。但是 它可以诱导肿瘤转移相关基因，包括S100A4、MARCKSK1和BAG4等的上调表达，提高 肿瘤细胞侵袭能力，促进肿瘤细胞在小鼠体内的迁徙和转移。将该突变体转染低恶性 肿瘤细胞后，再将该转染后细胞，皮下注射裸鼠后，可制备肿瘤转移的小鼠模型。该 模型可应用于筛选治疗肿瘤转移药物，以及用于研究原位肿瘤发展为转移肿瘤机制的 工具。

附图说明

图1为ELL(C595A)突变体促进肿瘤转移。

图2为ELL(C595A)突变体促进肿瘤转移重复实验。

图3为ELL(C595A)过表达增强HCT116肿瘤细胞的迁移能力。

图4为ELL(C595A)过表达提高肿瘤转移相关基因(S100A4,MARCKSL1,BAG4) 的表达。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中细胞及培养：

HEK293，HEK293T，HCT116和COS7细胞来自ATCC。

HEK293，HEK293T和COS7细胞使用添加10％胎牛血清(FBS；Hyclone公司)的 Dulbecco’smodifiedEagle’smedium培养基(DMEM；HyClone公司)培养；HCT116 细胞使用添加10％胎牛血清(FBS；Hyclone公司)McCoy的5A培养基(HyClone公 司)培养。培养条件为37℃，5％CO₂。VigoFect(VigorousBiotech)用于细胞转染。

下述实施例中抗体和试剂：

使用的抗体如下:anti-ELLantibody(A0668，ABclonal；51044-1-AP， Proteintech；HPA046076，Sigma-Aldrich)，anti-c-Mycantibody(9E10，Santa Cruz；A0309，ABclonal；D84C12，CellSignaling)，anti-Flagantibody(F1804， Sigma)；anti-HAantibody(Covance)，anti-Hisantibody(H15，SantaCruz)， anti-GAPDHantibody(SC-47724，SantaCruz)，anti-α-tubulinantibody (EPR1333，Epitomics)；使用的试剂如下:chloroquinediphosphate(BioVison)， AICAR(Cayman)，MG132(Calbiochem)，cycloheximide(Sigma-Aldrich)。

下述实施例中免疫共沉淀和Westernblot分析：

Anti-c-Mycantibody，anti-HAantibody和anti-Flagantibody-conjugated agarosebeads购自Sigma-Aldrich。ProteinA/GSepharosebeads购自GECompany。 GlutathioneS-transferase(GST)-BindResin购自Novogen。

内源性免疫共沉淀的实验步骤已在(Zhang等人2014)中描述。在GSTpull-down 分析中，通过E.coli(BL21)表达GST标签的c-Myc和His标签的ELL并进行纯 化。使用GST-BindResin进行免疫共沉淀后，通过SDS-PAGE将蛋白质分离。将胶用 考马斯蓝染色或转移到PVDF膜，通过Westernblot分析检测His-ELL。使用FujiFilm LAS4000miniluminescentimageanalyzer进行Westernblot结果的拍摄，使用 MultiGaugeV3.0根据Westernblot获得的条带密度定量分析蛋白水平。

下述实施例中体内泛素化实验如下：

在HEK293T细胞中共转染质粒HA-c-Myc、质粒Myc-ELL、质粒Myc-ELL(C595A)， 质粒His-ubiquitin或质粒His-ubiquitin(K48R)。通过Ni²⁺-NTAresin(Novagen) 对His-ubiquitin或His-ubiquitin(K48R)进行纯化，最后使用HA抗体检测c-Myc 的泛素化。

下述实施例中体外细胞生长实验：

通过慢病毒感染获得细胞接种于6孔板中，每孔细胞量为1×10⁵，使用细胞计数 仪(TC10；Bio-Rad)连续计数4天。

下述实施例中细胞克隆形成实验：

将过表达ELL的HCT116稳定细胞系接种于六孔板中，每孔2×10⁴个细胞；敲降 ELL的HCT116稳定细胞系每孔接种1.5×10⁴个细胞。接种六天后，使用甲醇固定细 胞并用结晶紫染色。使用显微镜拍摄并对克隆数进行计数。

统计分析：

体外生长实验和克隆形成实验的数据来自三次独立重复实验的平均值，表示为平 均值+SEM；体内实验数据表示为平均值+SEM。使用GraphPadPrism5(GraphPad SoftwareInc.)进行数据分析。

蛋白ELL的氨基酸序列为序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列1。

实施例1、ELL(C595A)促进肿瘤细胞转移

1、肿瘤转移表型

ELL(C595A)的氨基酸序列为将ELL氨基酸序列2第595位的半胱氨酸突变为丙 氨酸得到的蛋白，其编码基因的核苷酸序列为将ELL编码基因序列1第 1783,1784,1785位TGC突变为GCC。

为了证明ELL，ELL(C595A)在肿瘤形成中的作用，使用慢病毒包装的三个HCT116 细胞系：对照，ELL和ELL(C595A)进行裸鼠肿瘤形成实验。

pHAGE-control为pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen载体；

pHAGE-ELL为将ELL编码基因序列1插入pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen载体 (Addgene)的XbaI和BamHI位点得到的载体；

pHAGE-ELL(C595A)为将ELL(C595A)编码基因插入pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen载体 的XbaI和BamHI位点得到的载体；

将上述各载体分别和包装载体psPAX2(Addgene)，pMD2.G(Addgene)转染HEK293T 细胞，转染后8小时，将培养基更换为含有10％FBS的新鲜DMEM培养基。40小时后， 从培养基中收集病毒，得到表达对照慢病毒(转染pHAGE-control)、表达ELL的慢 病毒(转染pHAGE-ELL)、表达ELL(C595A)的慢病毒(转染pHAGE-ELL(C595A))。过 滤，并转染HCT116细胞，得到转染pHAGE-control的HT116细胞、转染pHAGE-ELL 的HT116细胞和转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞。

上述含有病毒的培养基中加入Polybrene(8μg/mL)以提高感染效率。

将上述转染pHAGE-control的HT116细胞、转染pHAGE-ELL的HT116细胞和转染 pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞进行移植瘤生长实验：将15只雄性裸鼠随机分成3 组，每组5只，三组裸鼠分别皮下注射上述三种不同的细胞系，每只裸鼠注射的细胞 量为2×10⁶个。从第三周起，每周测量肿瘤的长宽高并使用V＝π.abc/6(Flatz等 人2010)计算肿瘤体积。6周后，处死裸鼠，测量肿瘤的重量并对相应的基因表达进 行分析。肺部组织经过HE染色后进行组织学分析。

在移植瘤生长实验中一只第四周死亡的ELL(C595A)表达的小鼠(导入转染 pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞)中观察到了消廋现象。此外，在第六周收获肿瘤时， 两只ELL(C595A)表达的小鼠中也呈现异常消廋现象(图1A，红色箭头)，但没有在 对照组发现有类似的症状。由于消廋现象是晚期癌症患者(Fearon等人2012)的常 见的症状之一，因此，又进一步详细分析了这两只小鼠肿瘤的细节。通过组织学分析 (图1C和1D)证明了这两只皮下注射了转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞的小鼠， 在肺部形成了肉眼可见的肿瘤(图1C)。

肿瘤转移率(先肉眼观察，鉴别是否有肉眼可见的肿瘤；再进行组织切片，显微 镜下观察，是否有肿瘤组织。肿瘤转移率为：(发生肿瘤转移小鼠个体数)/(接种 肿瘤细胞小鼠个体总数)X100％)为50％(图1B)。

对这一表型进行了进一步的实验验证。在重复试验中，两只皮下注射了ELL (C595A)过表达HCT116细胞的两只小鼠变得非常消廋(图2A，红色箭头)。其中一 只裸鼠(图2A，黄色箭头)的整个胸腔都长满了肿瘤，并出现骨转移前奏(图2C， 2D)。其他三只裸鼠的肺部，可见肿瘤细胞的转移图2C。

肿瘤转移率(先肉眼观察，鉴别是否有肉眼可见的肿瘤；再进行组织切片，显微 镜下观察，是否有肿瘤组织；肿瘤转移率为：(发生肿瘤转移小鼠个体数)/(接种 肿瘤细胞小鼠个体总数)X100％)为80％(图2F)。

图2B为肿瘤体积。

这些数据表明，ELL(C595A)突变体不仅失去了野生型ELL的肿瘤抑制功能，并 且具有促进肿瘤转移的功能。

2、细胞侵袭

为了进一步了解ELL(C595A)突变促进肿瘤转移的机制，进行了细胞侵袭实验：

将Transwell平板购自Corning(Costar3422)。细胞侵袭的实验方案来自制造 商。简言之，将转染pHAGE-control的HT116细胞和转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116 细胞悬浮于无血清的McCoy’s5A培养基中，每孔细胞量为5×10⁵；Transwell平板 下室中加入含10％FBS的McCoy’s5A培养基。将平板置于含5％CO₂的培养箱中培养 36小时，然后将上室取出，甲醇固定后使用吉萨姆染色。使用显微镜拍摄并利用 ImageJ软件计数。

结果如图3中所示，A为显微镜图，B为统计图，与转染pHAGE-control的HT116 细胞相比转染pHAGE-ELL(C595A)的HT116细胞侵袭能力增强。

因此，ELL(C595A)突变使细胞的侵袭能力增强但不提高细胞增殖的速率，促进 肿瘤细胞迁移。

3、ELL(C595A)突变体肿瘤的比较蛋白组学分析

为了进一步了解ELL(C595A)突变促进肿瘤转移的机制，进行了比较蛋白组学 分析：

选取10只4-5周的裸鼠，随机分成两组(每5只/组)。一组皮下注射转染 pHAGE-control的HT116细胞2.2百万；另一组皮下注射转染pHAGE-ELL(C595A)的 HT116细胞2.2百万。三周后，杀死裸鼠，剥离肿瘤，得到对照肿瘤(pHAGE)和ELL(C595A) 肿瘤(pHAGE-ELL(C595A))。

分别选取三个对照肿瘤和三个ELL(C595A)肿瘤，提取蛋白，SDS-PAGE检测，结 果如图4A，送到杭州景杰生物科技有限公司，进行定量蛋白组学分析。经实验组 (ELL(C595A)肿瘤)与对照组(pHAGE肿瘤)的比对，筛选到11个蛋白，在ELL(C595A) 肿瘤中高表达(图4B)。

半定量PCR对其中6个基因进行了验证(引物如下表1)，

表1为6个基因引物

结果如图4C所示，可以看出，ELL(C595A)提高6个基因的表达，以S100A4的 上调表达最为显著。

WesternBlot对S100A4的上调表达进行了验证，结果如图4D所示。

S100A，MARCKSL1和BAG4是已报道的与肿瘤转移相关的基因，特别是S100A4与 肿瘤转移的关系，已有大量的报道。

因此，ELL(C595A)突变体可能通过上调这些肿瘤转移促进基因的表达，来促进 肿瘤转移。