蒺藜苜蓿叶片发育调节基因STF、编码蛋白及其应用

摘要

本发明公开了一种蒺藜苜蓿叶片发育调节基因STF及其编码蛋白，其具有如SEQ？ID？No.2所示的核苷酸序列和SEQ？ID？No.1所示的氨基酸序列。过表达蒺藜苜蓿叶片发育调节基因STF可明显改良单子叶作物(水稻)的叶片和茎秆两大重要农艺性状，STF基因过表达水稻材料叶片变宽加厚，茎秆粗壮，显著提高水稻的光合效率和抗倒伏能力，可用于解决农业生产上水稻等单子叶作物光合效率低、茎秆软弱，易倒伏等问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种叶片发育调节基因，特别涉及一种蒺藜苜蓿叶片发育调控基因STF及其应用。

背景技术

随着人口的快速增长，耕地面积逐渐减少，全球性的粮食安全问题日益严重。水稻是重要的粮食作物，为世界上一半以上的人口提供粮食和营养来源。提高水稻产量被认为是缓解粮食危机最为重要的一个环节。水稻株型的改良对于提高水稻的产量具有重要的作用。自1968年澳大利亚的Donald提出了作物理想株型的概念以来，国内外的水稻育种学家围绕理想株型这一主题开展了系统的研究工作。理想株型是当前国内外超级稻研究中的一个核心领域，即通过改变水稻在叶片、茎秆、分蘖和穗粒等性状的结构特点，最终达到促进水稻产量的大幅度提高。然而水稻的株型受到多种遗传因素的调控，同时受外界环境的影响。目前对水稻理想株型和产量形成的分子调控机制的认识还非常有限。

叶片和茎秆是决定水稻株型的两大重要性状。叶片是植物进行光合作用的主要场所，水稻籽粒灌浆的物质积累主要来自于开花后上部叶片的光合作用，所以叶片的质量是研究水稻理想株型的重点。大量的实验结果表明叶片的有效面积和厚度与光合速率呈正相关，同时较厚的叶片可以提高叶片的直立性，有利于水稻的密植，而叶片的直立性一直是高产水稻品种的重要选择指标之一。倒伏是限制水稻高产的重要因素，水稻植株的抗倒性主要由茎秆性状所决定。20世纪50-60年代提出的矮化育种通过降低株高使水稻的抗倒性、密植性和耐肥性得到提高，从而提高产量。随着理论研究深入和生产实践的发展，对水稻茎秆的选育有了新的认识。目前认为株高与生物质产量呈正相关。而生物质产量增加又是穗粒数和千粒重增加的物质基础。适当增加水稻株高，可以降低叶面积密度，有利于二氧化碳的扩散并提高整体植株的受光，进而促进生物质产量增加。水稻的抗倒伏能力与茎秆的长度呈负相关，而与茎秆的粗度和厚度呈正相关。提高水稻茎秆的粗度和厚度为改善高秆品种的抗倒伏性提供了新的方向。茎杆的粗细不但直接影响到水稻的抗倒伏能力，还决定着穗子的大小。因此，茎秆粗壮也是现代水稻株型育种的重要指标。

发明人前期从蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中克隆了一个叶片发育的关键调控基因STENOFOLIA(STF)，STF基因的功能缺失引起叶片的侧向伸展受到抑制，导致窄叶的表型，同时我们发现stf突变体体内生长素、细胞分裂素等植物激素的动态平衡发生了改变。STF基因编码一个双子叶植物特有的WOX家族转录因子。研究发现在玉米Ubiquitin启动子驱动下，在水稻日本晴中异位表达蒺藜苜蓿STF基因会导致水稻叶片变宽加厚和茎秆粗壮，并且叶片与茎杆变宽变粗的表型与STF表达量的高低呈现一定的剂量依赖性。此外，发明人发现过表达STF水稻材料的光合效率显著提高，同时水稻植株的抗倒伏能力明显增强，因此，本发明可用于解决农业生产上水稻等单子叶作物光合效率低、茎秆软弱，易倒伏等问题。

发明内容

本发明提供一种蒺藜苜蓿叶片发育调节基因STF及其在改良水稻等单子叶作物株型，提高水稻的光合效率和抗倒伏能力方面的应用。

一种蒺藜苜蓿叶片发育调节蛋白STF，如序列表SEQIDNO.1所示；

上述蛋白的编码基因，如序列表SEQIDNO.2所示；

上述蛋白的编码基因，为如下中至少一种：

1)SEQIDNO.2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

上述编码基因的重组载体，转基因细胞系或者重组菌。

一种过表达载体，该载体是将SEQIDNO.2所述的序列通过BP反应连接到到含有Gateway接头的pDONR207中间载体上，再通过LR反应将STF-pDONR207重组至改造过的过表达载体pMDC32-pUbi；所述重组至改造过的过表达载体pMDC32-pUbi是将pMDC32载体上35S启动子通过酶切方法换成玉米Ubiquitin启动子。

一种改变植物叶片，茎秆性状的方法，包括如下步骤：使植物中表达上述的蛋白。

所述表达上述蛋白的方法为：将上述的表达载体导入农杆菌菌株AGL1中，侵染植物，获得转基因植物。

上述的转基因植物为水稻。

上述的蛋白在提高植物光合作用效率和抗倒伏方面的应用，所述植物为水稻等单子叶植物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明从双子叶植物蒺藜苜蓿中克隆到了调控植物叶片发育的基因STF。本发明发现双子叶植物叶片发育控制基因STF具有改良水稻等单子叶作物叶片和茎秆两个重要农艺性状，显著提高水稻的光合效率和抗倒伏能力，可用于解决农业生产上单子叶作物光合效率低、茎秆软弱，易倒伏等问题。

附图说明

图1：STF过表达水稻材料的分子检测。

图2：STF过表达水稻材料的表型分析。

其中A-D为孕穗期不同表达量的STF过表达植株；E-H为STF过表达植株对应的穗子及旗叶表型。

图3：STF过表达水稻植株的光合效率分析。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1STF基因的分离克隆

蒺藜苜蓿STF的CDS序列在基因组上的位置为Medtr8g107210，设计PCR扩增引物，正向引物F:5'-ATGTGGATGGTGGGTTACAAT-3'；反向引物R:5'-TCAGTTTTTCAAGGGAAGAAACT-3'。收集蒺藜苜蓿不同生长时期的各个组织部位，TRizol法提取这些材料的总RNA(参考invitrogentrizol)，参考invitrogenssRT-Ⅲ将mRNA反转录为cDNA，以蒺藜苜蓿cDNA为模板，进行PCR获得STF全序列，反应体系如下：

PCR反应总体系为50μL，包括蒺藜苜蓿cDNA(50ng)1μL；dNTP(2.5mM)2.5μL；引物F(10μM)1μL；引物R(10μM)1μL；Q5(NEB)酶(5U/μL)0.3μL；5×缓冲液10μL；ddH₂O34μL，共50μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min,95℃30s,58℃30s,72℃60s，35个循环；最后72℃10min。

获得的蒺藜苜蓿STF基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。

实施例2转STF基因水稻的获得

根据STF的序列信息，在其CDS两端设计PCR扩增引物，正向引物F:5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGTGGATGGTGGGTTACAAT-3'；反向引物R:5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaTCAGTTTTTCAAGGGAAGAAACT-3'。以实施例1中得到的核苷酸序列为模板，进行PCR获得STF全序列(如序列表SEQIDNO.2所示)。

将PCR产物通过BP反应连接到含有Gateway接头的pDONR207中间载体上，经测序鉴定得到与目的STF完全相同的序列。再通过LR反应将STF-pDONR207重组至改造过的过表达载体pMDC32-pUbi(将pMDC32载体上35S启动子通过酶切方法换成玉米Ubiquitin启动子上)，获得载体Ubi::STF。将过表达载体Ubi::STF导入农杆菌菌株AGL1中。

将野生型水稻日本晴的成熟种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤的培养基中，培养3周后，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有载体Ubi::STF的重组农杆菌菌株侵染野生型水稻愈伤组织。在黑暗处共培养后，在含有潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤，并在随后的分化培养基上诱导分化获得转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，后移栽到水田中。提取水稻旗叶叶片RNA，反转录为cDNA，通过Q-PCR方法检测STF过表达转基因水稻植株中STF基因的表达量。Q-PCR引物为qPCR-F:AATGAATCTGATCAAACCCTTCAAC；qPCR-R:TGCATTGATTGCTGAAGCTGATAT。目前检测工作已经完成，并获得了表达量不同的转基因植株(附图1)。将获得的转基因阳性植株根据表达量的高低分为三类，依次为表达量较低的STFⅠ类(以STFOE1为代表)，表达量适中的STFⅡ类(以STFOE6为代表)以及表达量较高的STFⅢ类(以STFOE30为代表)，并对这些株系进行了幼苗时期和成熟时期表型分析。

实施例3STF基因功能分析

按照实施例2的方法获得的30株STF水稻转基因植株，将这些材料种入大田，根据表达量的高低分为三类，选择3株代表性转基因植株，分别在幼苗期和成熟抽穗期对叶片和穗型进行统计分析，表达量适中的转基因植株表现为叶片变宽的表型，而表达量过高的转基因植株的叶片发生严重蜷曲(如附图2)。表明STF在改变水稻叶片发育的过程中起着重要作用。选择对照材料和STF过表达转基因材料孕穗期旗叶，利用光合效率测定仪LI6400xt检测对照材料和STF过表达转基因材料旗叶的光合效率，结果表明，转基因水稻的光合效率与野生型相比，光合效率约提高30％以上。同时研究发现，过表达STF水稻植株的茎秆粗壮，与对照植株相比内径增加至少30％以上，显著增加水稻植株的抗倒伏能力。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。