利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠肽粗提物的方法

摘要

本发明提供一种利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠肽粗提物的方法，包括：在牛乳加入水和胰蛋白酶和胃蛋白酶进行酶解，灭酶后经喷雾干燥得粉状酪蛋白水解物；酪蛋白水解物通过等电点沉淀分离；采用反相钢柱，将电点沉淀所得纯化物通过制备液相，再次对样品进行分离纯化，根据样品极性的不同，将样品分为若干段，通过建模，对该促睡眠粗体物进行活性评价；采用全细胞膜片钳技术，给予30-60PA,3000-4000ms诱发动作电位，给药100-150μmol/L,记录电生理图谱，通过放电数目和频率，筛选出具有较好促睡眠的活性片段。本发明操作简单，分离效果好，所得粗提取不仅可以缩短入睡的时间，还可以调节睡眠节律，为失眠症患者的健康提供更好的保障。

说明书

技术领域

本发明涉及一种促睡眠保健品领域，特别是一种从乳源中分离纯化促睡眠肽的方 法及用途。

背景技术

睡眠作为生命所必须的过程，是机体复原、整合和巩固记忆的重要环节，是健康不 可缺少的组成部分。世界卫生组织的一项研究表明全球约有27%的人在遭受失眠病症的困 扰。在我国约有3亿成年人患有失眠疾病。目前失眠症在世界上仍是一个没有得到充分重视 和良好解决的公共卫生问题。

临床上常用化学合成类镇静催眠药治疗失眠及其他疾病引起的睡眠障碍。此类药 物在延长睡眠时间的同时，都会出现不同程度的副作用如头晕、乏力、困倦、注意力不集中， 甚至暂时性健忘和宿醉现象，并未真正起到改善睡眠质量的作用。因此，提供药效显著、副 作用小、安全的改善睡眠作用的药物是医药卫生领域的一项重要任务。其中，建立快速、有 效的改善睡眠作用药物的药效评价方法，对药物进行筛选和评价是实现这一任务的前提和 基础。

大脑中存在着由一系列神经核团纤维和递质所组成的睡眠、觉醒调节系统，彼此之间 形成既有形态上联系又有功能上制约的神经网络。下丘脑内视前区及其邻近基底前脑神经 元为睡眠发生系统。视前区的促眠神经元主要位于下丘脑腹外侧视前区(VLPO）对睡眠的产 生和维持有着至关重要的作用。

自1976年膜片钳技术诞生以来，利用膜片钳技术进行电生理学的研究已成为一种 重要的研究手段。离体脑片是指从动物脑区制备的脑组织薄片，可在体外人工脑脊液中存 活数小时到十几小时，并能保持与在体脑组织相似的代谢特性和电生理特性。本发明将脑 片膜片钳技术与红外微分干涉相差技术相结合，建立红外可视脑片膜片钳实验技术，使离 体脑片的电生理研究扩大到下丘脑、大脑皮层、小脑、海马、纹状体、脑干等几乎所有的脑区 及脊髓薄片。

牛乳中含有多种生物活性多肽，天然牛乳中活性多肽的含量较少，无法满足亚健 康人们的需要。牛乳蛋白，是许多具有潜在生物活性物质的前体，通过蛋白酶酶解作用，得 到具有生物学功能的小肽，即乳源生物活性肽。这些小肽一般由2-20个氨基酸残基组成，能 够对机体的消化系统、心血管系统、免疫系统等多方面产生积极的影响，具有调节神经系 统、抗菌、抗氧化、抗高血压、免疫调节等生理活性。牛奶制品长期以来被认为具有促进睡 眠，缓解压力的作用，法国科学家已证实牛奶制品中的一种酪蛋白酶解产物具有明确的抗 抑郁，缓解压力的生物活性，但其具体机制和具体物质一直没有明确。

目前，国内膜片钳实验技术的应用并不广泛，且以盲法为主，缺少高质量的体视显 微镜和水浸物镜是一方面的原因，而主要难点是制备活性良好的脑片。另一方面，乳源制品 具有调节睡眠的活性，但缺乏合适的模型对其活性进行评价。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠肽粗提物的方法，其利 用乳源多肽等电点（pH）、溶液极性（乙醇浓度）对其进行粗分离，定量分析各性质部分所占 比例（沉淀得率），并借助制备液相制备样品，对酪蛋白酶磷酸肽副产物进行分离纯化。所得 粗提取不仅可以缩短入睡的时间，还可以调节睡眠节律，为失眠症患者的健康提供更好的 保障。

为实现上述目的，本发明的实施方案为：一种利用膜片钳技术筛选乳源中促睡眠 肽粗提物的方法，包括以下步骤：

（1）在容器中加入水，升温至40℃-60℃，加入牛乳和蛋白酶进行酶解，酶解条件为：水 和牛乳体积比为100：10-15、pH值7.5-8.5、时间2-4h，所述蛋白酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶， 胰蛋白酶的加入量为牛乳质量的0.2%-0.6%，胃蛋白酶的加入量为牛乳质量的0.06%- 0.12%，酶解完成后，灭酶，喷雾干燥，得粉状酪蛋白水解物；

（2）酪蛋白水解物通过等电点沉淀分离，条件为pH4.5-6、乙醇浓度60%-90%、沉淀时间 为1-3h；

（3）采用反相钢柱，将步骤（2）所得沉淀物通过制备液相，再次对样品进行分离纯化，根 据样品极性的不同，将样品分为若干段，通过建模，对该促睡眠粗体物进行活性评价；

（4）急性分离大鼠的下丘脑腹外侧视前区脑片，厚度约300-500um，然后采用全细胞膜 片钳技术，借助去极化方波，给予30-60PA,3000-4000ms诱发动作电位，给药100-150μmol /L,记录电生理图谱，通过放电数目和频率，筛选出具有较好促睡眠的活性片段。

作为优化，步骤（1）中，所述水和牛乳体积比为100：12。

作为优化，步骤（1）中，所述酶解分两步进行，第一步：调节溶液pH8，开搅拌 300rpm，投入胰蛋白酶，酶解3h，灭酶，胰蛋白酶的加入量为牛乳质量的0.3%；第二步：调节 pH为5，加入胃蛋白酶，将温度调到40℃，酶解2h，胃蛋白的加入量为牛乳质量的0.1%。

作为优化，步骤（1）中，所述灭酶温度为90℃，时间30分钟。

作为优化，步骤（2）中，等电点沉淀条件为：pH5，乙醇浓度70%，沉淀3h后，4℃下静 置4小时。

本发明将成分复杂的酪蛋白水解产物采用简单的分离纯化技术得到约20%的沉淀 产物，操作简单，分离效果好；再借助制备液相，对促睡眠粗提物进一步分离纯化，上柱简单 易操作，可以加大上样量，制备较多样品，方便后期的生产，同时降低生产成本；制备的样品 通过膜片钳技术对其进行促睡眠活性评价，将复杂多化的神经元研究，简化为红外可视脑 片膜片钳，借助神经元的放电频率、膜常熟、幅值等参数对下丘脑腹外侧视前区神经元电生 理指标进行睡眠指标的相关研究，该评价模型具有普遍适应性，不但可以评价神经元的电 生理特性，还可以借助离子通道来研究神经元相关机理。

附图说明

图1为本发明具有较高促睡眠效果P3高效液相色谱图；

图2为本发明酪蛋白水解物高效液相色谱图；

图3为本发明大鼠下丘脑组织分离切片；

图4为本发明电生理--下丘脑腹外侧核神经元封接成功；

图5为本发明电生理--睡眠效果图谱。

具体实施方式

以下结合实际情况，对本发明的具体实施方式进行详细说明。

实施例1：

在反应容器中加纯水100L，加热至55℃，投入12KG牛乳蛋白，调节溶液的pH为8，开搅 拌300rpm，投入胰蛋白酶36g，酶解3h，灭酶。投入为胃蛋白酶12g，调节pH为5，将温度调到 40℃，酶解2h。酶解后，灭酶，将温度调节至90℃，保温30min。然后将滤液调节pH5，加入乙 醇至浓度70%，搅拌充分，沉淀3h后，4℃静置4小时，然后将上清过滤，收集沉淀，将沉淀在 55-65℃干燥，得到酪蛋白酶解产物，纯度高，有清淡的苦味和咸味，色泽好,得率2.35kg。

采用ShimadzuPRC-ODS(K)钢柱，将上述分离纯化物通过制备液相，再次对样品进 行分离纯化，方法是：将首次粗分离纯化好的酪蛋白酶解产物，溶解后上样到已处理好的制 备钢柱上，上样量8ml，流速为：15ml/min，检测波长214nm。依次用水(含0.1%TFA)和10%， 15%，20%，30%，60%，75%乙腈（含0.1%TFA）洗脱，每种溶剂冲洗3-6倍柱体积。根据液相图谱中 的出峰时间收集各组分，经过40℃-60℃、300±100pa真空度下减压浓缩至乙腈完全去除， 将剩余滤液经喷雾干燥即得制备液相制备的促睡眠肽粗提物。

根据液相色谱出峰时间的不同，将样品分为六段，命名为（P1，P2、P3、P4、P5、P6）。 方法是：取酪蛋白酶解产物0.5kg，用超纯水溶解，配成1g/ml,每次进样10ml，分六段对促睡 眠粗提物进行接样，浓缩，冻干成粉用于下一步实验。其中P1得率12%，P2得率10%，P3得率 24%，P4得率18%，P5得率12%，P6得率8%。通过建模，对该六段促睡眠粗体物进行活性评价。

实施例2：

取出生5周左右的大鼠，体重约100g-150g，急性分离其下丘脑，将下丘脑切片为400um， 迅速放入充满95%O₂和5%的人工脑脊液中，在33℃中孵育30min，拿出孵育槽，在室温下放置 20min。采用外径为1.4mm的有芯硬质玻璃毛坯，抛光后尖端拉制为直径约2um，充满电极内 液。首先用5×的物镜观察下丘脑的结构，找到腹外侧视前区，然后用40×浸水镜观察单个 腹外侧视前区神经元的形态并利用电极进行封接，当电极尖端与细胞间形成大于1GΩ封接 后成功后，在封接窗口观察到细胞出现电容充放电后，即形成全细胞模式，先记录一段空 白，通常2-3min，膜电位50mV，稳定后给药。然后通过阳性对照和空白对照，分析出促睡眠活 性较好的为P3。