原花青素的应用及含原花青素的纤维蛋白原测定试剂

摘要

本发明涉及原花青素的应用及含原花青素的纤维蛋白原测定试剂，原花青素对纤维蛋白原测定试剂起稳定作用，用量为0.5-1.5％。纤维蛋白原测定试剂组分包括凝血酶50-150U/mL和稳定剂原花青素0.5-1.5％，稳定剂还可以含有α-丙氨酸2-3％、氯化钙8-110mM、聚乙二醇0.05-0.5％、甘露醇2-3％、麦芽糖1-2％、山梨酸钾0.5-1％，其中的百分比均为质量体积百分比。本发明组成的试剂，可用于纤维蛋白原的测定。结果表明，在含有凝血酶的纤维蛋白原测定试剂中，添加原花青素，不会抑制凝血酶的酰胺反应和蛋白反应，同时能改善试剂的稳定性。凝血酶在液相环境中稳定性的改善，与原花青素对抗活性氧较强的消除能力、对影响凝血酶稳定性的二价金属离子的螯合效应以及抗菌性能有关。

说明书

技术领域

本发明涉及原花青素在凝血测定试剂中的应用，以及一种含有原花青素稳定剂的纤维蛋白 原测定试剂及其制备方法，可用于检测血浆中纤维蛋白原的含量。

背景技术

纤维蛋白原为凝血因子I，是体内重要的凝血因子，它在凝血酶存在的情况下，转变为不 溶性的纤维蛋白，导致血液凝固。检测纤维蛋白原水平，可用来分析出血倾向。流行病学研究 表明，纤维蛋白原升高会引起血栓。

纤维蛋白原由三对多肽链构成，包括两个α链，两个β链和两个γ链。它们之间通过29 个双硫键连接，受凝血酶的作用，纤维蛋白原的α和β链分别游离出血纤维蛋白肽A和血纤维 蛋白肽B而形成血纤维蛋白单体。血浆中纤维蛋白原的检测方法有很多种，包括Clauss法、 PT法、免疫学法和称重法。Clauss法和PT法的基础分别为纤维蛋白的形成时间和凝血酶原时 间。免疫法为测量纤维蛋白原抗原而不是功能性纤维蛋白原，而称重法则以凝血重量为基础。 其中，Clauss法为美国临床实验室标准委员会(Clinical&LaboratoryStandardsInstitute)推荐 的方法。该方法的原理是，高浓度的凝血酶与低浓度纤维蛋白原血浆反应，纤维蛋白原含量与 血凝时间成反比。在测试中，高浓度的凝血酶使稀释血浆凝固，血浆的稀释比例一般为1:10， 以最大限度地降低血浆中抑制组份(包括肝素及较高的FDP)带来的影响。

另一方面，作为多酚类，黄酮可用于抗菌(Cushnie,T.,Lamb,A.Antimicrobialactivityof flavonoids.InternationalJournalofAntimicrobialAgents2005,26,343-356)，以及抑制肿瘤生长 (Ferguson,P.J.,Kurowska,E.M.,Freeman,D.J.Invivoinhibitionofgrowthofhumantumorlines byflavonoidfractionsfromcranberryextract,NutritionandCancer2006,56,8694)，而更多的研究 则倾向于它的抗氧化性能(VanAcker,S.A.B.E.,Structuralaspectsofantioxidantactivityof flavonoids,FreeRadicalBiologyandMedicine1996,20,331-342.；DeSouza,R.F.,Antioxidant propertiesofcomplexesofflavonoidswithmetalions,RedoxReport2004,9,97-104.；TeixeiraS., Structure-propertystudiesontheantioxidantactivityofflavonoidspresentindiet.FreeRadical BiologyandMedicine2005,39,1099-1108)。

在纤维蛋白原测定试剂中，活性组份凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，也是血液凝血级联反应 中的主要效应蛋白酶(CrawleyJT，Thecentralroleofthrombininhemostasis.JThrombosis Haemostasis2007,5(suppl1):95–101；McMichaelM.,Newmodelsofhemostasis.Topicsin CompanionAnimalMedicine,2012,27:40–45)。作为活性凝血因子II，它的活性受很多因素的影 响，特别是在液相或乳浊相中。为了维系凝血酶的活性，可添加低浓度的盐类和醇类(USPatent 4696812)；BSA和EDTA(USPatent4409334)；氨基酸类和有机酸及多糖类(特願平11/272092 トロンビンの安定化手段および組成物；USPatent20060246052A1)。含有上述稳定剂的液相凝 血酶制剂，经冷冻干燥制成粉剂后，凝血酶的活性得到较好的保护。另一方面，根据实验研究， 上述添加剂对液态或乳浊相中的凝血酶的稳定效果并不尽理想，特别是在试剂存放较长时间的 条件下。这是由于液态状态下，凝血酶的结构相对粉末态比较脆弱，酸、碱、温度、离子强度 以及其它某些化合物(包括重价金属离子)的少量存在，都会引起凝血酶空间结构的改变，局 部结构的微小变化也会引起凝血酶活性的丧失。

有研究表明，某些多酚类物质可抑制血小板聚集活性(MattielloT1,TrifiròE,JottiGS, PulcinelliFM.,effectsofpomegranatejuiceandextractpolyphenolsonplateletfunction,JMedFood. 2009Apr；12(2):334-339；邱培,不同儿茶素对人体血小板聚集活性的影响，浙江大学硕士学位 论文，2015年6月)。另外，也有研究表明，在含有凝血酶的体系中加入黄酮，凝血酶的活性 会受到抑制(HugoA.Guglielmone,Anticoagulanteffectandactionmechanismofsulphated flavonoidsfromFlaveriabidentis,ThrombosisResearch,2002,2：183–188；LiuL,MaH,YangN， Aseriesofnaturalflavonoidsasthrombininhibitors:structure-activityrelationships.Thrombosis Researsh,2010,126:365–378)。但是，黄酮包含多个亚类，它具有较好的抗氧化性，也具有很强 的金属离子螯合能力，从而可以降低二价金属离子对物相氧化反应的催化作用(VanAcker, Influenceofironchelationontheantioxidantactivityofflavonoids.Biochem.Pharmacol.1998,56: 935-943)。基于上述思路，我们发现并不是所有的黄酮都能够抑制凝血酶的活性，而属于黄 酮类的原花青素，不仅不会影响凝血酶的酰胺反应和蛋白反应，同时还会提升含有凝血酶的液 相体系的稳定性能。

原花青素主要分布在植物中，包括银杏、大黄、山楂、耳叶番泻、小连翘、葡萄、日本罗 汉柏、北美崖柏、花旗松、白桦树、野生豪4葵、番荔枝、野草莓、海岸松、洋委陵菜、甘薯 等，其中，葡萄籽与松树皮提取物中原花青素的含量相对较高。

原花青素在结构上由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，最简单的原花青素是儿茶素 或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体、三聚体、四聚体至十聚体。原花青素含有很多 酚羟基，溶解度较银杏黄酮高，特别是低聚体的溶解性特别好。原花青素为白色粉末，溶于水、 乙醇、甲醇、丙酮，也可溶于乙酸乙脂。UN在280nm有强吸收。原花青素有较强的抗氧化活 性，对活性氧有很强的消除能力(KotaT,IncreaseofAntioxidativePotentialofRatPlasmabyOral AdministrationofProanthocyanidin-RichExtractfromGrapeSeeds(J)AgriculturalandFood Chemistry,1999,45(5):1892-1897)，摄入原花青素可提高血浆对氧化应激的抵抗力。同时，酚 类消除自由基的能力与化学性质和立体结构密切相关(SaintCricq,PolyphenolprofilesofFrech eiderapplevarieties,JournalofAgriculturalandFoodChemistry,1999,47(12):4847-4853)。

本发明在实验研究的基础上，发现在含有凝血酶的纤维蛋白原测定试剂中，添加原花青素， 可以制备出较好稳定性的含有凝血酶的液态试剂，并用于纤维蛋白原的测定。

发明内容

本发明以原花青素为主要研究对象，分析了原花青素对凝血酶蛋白反应的影响，提出在含 有凝血酶的试剂中，添加原花青素，可以提升含凝血酶试剂的稳定性。所得到的含有凝血酶的 试剂，可用于Clauss法测定纤维蛋白原。

具体地，本发明采用原花青素用于稳定液相蛋白质，特别用于稳定含有凝血酶的纤维蛋白 原测定试剂。

所述的原花青素，用于稳定纤维蛋白原测定试剂时，所述原花青素的加入量为质量体积比 0.5-1.5％，最佳加入量为质量体积比1.0％。

所述的原花青素，当用于纤维蛋白原测定试剂中时，不会降低凝血酶的酰胺活性和蛋白活 性，同时会稳定含有凝血酶的乳浊相。

一种纤维蛋白原测定试剂，包含凝血酶50-150U/mL、稳定剂原花青素0.5-1.5％。

所述的纤维蛋白原测定试剂，组分中还可以含有其它稳定剂，包括α-丙氨酸、氯化钙、聚 乙二醇、甘露醇、麦芽糖、山梨酸钾中的一种或几种。所述其它稳定剂的加入量为α-丙氨酸 2-3％、氯化钙8-110mM、聚乙二醇0.05-0.5％、甘露醇2-3％、麦芽糖1-2％、山梨酸钾0.5-1％， 其中的百分比均为质量体积百分比。

所述的纤维蛋白原测定试剂，所述其它稳定剂的加入量优选为：α-丙氨酸1.5％、氯化钙 9mM、聚乙二醇0.1％、甘露醇2.3％、麦芽糖1.6％、山梨酸钾1％，其中的百分比均为质量体 积百分比。

一种纤维蛋白原测定试剂，以20-50mMTris缓冲液为溶剂，包含凝血酶50-150U/mL、原 花青素0.5-1.5％、α-丙氨酸2-3％、氯化钙8-110mM、聚乙二醇0.05-0.5％、甘露醇2-3％、麦芽 糖1-2％、山梨酸钾0.5-1％，其中的百分比均为质量体积百分比。

优选地，一种纤维蛋白原测定试剂，以50mMTris缓冲液为溶剂，包含凝血酶100U/mL、 原花青素1.0％、α-丙氨酸1.5％、氯化钙9mM、聚乙二醇0.1％、甘露醇2.3％、麦芽糖1.6％、 山梨酸钾1％，其中的百分比均为质量体积百分比。

所述的纤维蛋白原测定试剂，试剂的pH为7.1-7.4，最好为7.35。

上述含有原花青素的纤维蛋白原测定试剂的制备方法，过程如下：先配制20-50mMTris 缓冲液，其中含100mM的氯化钠，调节pH值为7.1-7.4，向该缓冲液中添加原花青素0.5-1.5％、 α-丙氨酸2-3％、氯化钙8-110mM、聚乙二醇0.05-0.5％、甘露醇2-3％、麦芽糖1-2％，将该混 合液充分搅拌均匀后，添加凝血酶50-150U/mL，混匀即得液相纤维蛋白原测定试剂。

上述含有原花青素的纤维蛋白原测定试剂，可用于Clauss法测定纤维蛋白原。

与现有的纤维蛋白原测定试剂相比，本发明试剂有如下优势：采用原花青素作为抗氧化剂 和防菌剂，降低了二价金属离子对氧化反应的催化作用；同时，原花青素中的邻苯二酚结构能 够与过氧自由基发生反应，从而终止蛋白质过氧化链反应，从而进一步提升了试剂的稳定性能， 并以此制备纤维蛋白原测定试剂。

附图说明

图1不同浓度的原花青素对凝血酶凝血反应的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

原花青素对凝血酶凝血反应的影响

配制50mM的Tris，其中，氯化钙10mM，纤维蛋白原的浓度为2.5mg/ml。在96孔酶标 仪的微孔中，加入含有氯化钙及纤维蛋白原的上述Tris溶液。同时，在相应的微孔中，加入 200μL不含原花青素的凝血酶(控制样品)以及200μL含原花青素的凝血酶。在含原花青素的 凝血酶中，原花青素的浓度分别为0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％(质量体积百分比)。测 定595nm处的吸光度值。测定间隔为10s，时间为15min，测定温度为37℃。以此确定不同条 件下各吸收光曲线上的最大凝血反应速率V_max(△m,OD/min)，结果如图1所示：当原花青素 加入量为0.05％、0.1％、0.5％、1％和1.5％时，纤维蛋白聚合反应最大速度V_max与不含原花青 素的凝血酶(控制样品)的最大速度相同或近于相同。

因此，在上述浓度条件下，含有原花青素的凝血酶引发的纤维蛋白聚合反应，与控制样品 基本没有差别，即原花青素的上述加入量，不影响凝血酶的蛋白反应。

实施例2

凝血酶抑制参数分析

配制50mM的Tris，在其中加入凝血酶干粉，制备凝血酶浓度为50U/mL的凝血酶溶液， 以此作为控制样品；在上述凝血酶溶液中，加入1.5％的原花青素(质量体积比)，制成凝血 酶与原花青素混合体系。经10min后，分别取200μL上述两组配制组分，加入96孔板酶标仪 反应孔中。反应孔中含30μL的发光基物D-Phe-Pip-Arg-pNA，发光基物的浓度分别为1mM、 1.5mM、2mM、3mM和5mM。每隔10s，测定时间为10min。反应速度以单位时间内pNA的 增量来表示，单位△μmol/min，其中，pNA的消光系数ε为8270/M/cm。绘制控制样品与含有 1.5％原花青素凝血酶样品的Lineweaver-Burk曲线：

1/V＝K_m/V_maxX1/[S]+1/V_max

结果表明，控制样品的K_m和V_max分别为130X10^－3mM和25.6X10^－3mM/min，而添加1.5％ 的原花青素后，混合体系的K_m和V_max分别为138X10^－3mM和24.9X10^－3mM/min。这表明， 在凝血酶中添加指定浓度的原花青素，对发光基物D-Phe-Pip-Arg-pNA的动力学参数基本上没 有影响。

实施例3

制备纤维蛋白测定试剂，研究原花青素对纤维蛋白原测定结果的影响。

先配制50mMTris缓冲液，按质量体积百分比，加入其中原花青素1.0％、α-丙氨酸1.5％、 氯化钙9mM、聚乙二醇0.1％、甘露醇2.3％、麦芽糖1.6％、山梨酸钾1％。混合均匀后，加入 凝血酶冻干粉，制备凝血酶终浓度为100U/mL的溶液，即得液态纤维蛋白原测定试剂。

在制备的液态纤维蛋白原测定试剂中，加入0.1％、0.5％、1％、1.5％的原花青素，制备原 花青素含量不等的纤维蛋白原测定试剂。

配制FIB定值血浆的缓冲液：称取巴比妥2.5g、巴比妥钠2.75g、氯化钠7.3g，溶于750mL 去离子水中，使用0.1mol/L盐酸调节pH至7.35，加水至1L。

将纤维蛋白原定值血浆，用1mL蒸馏水复溶，用巴比妥缓冲液按1:5、1:10、1:15、1:20、 1:30稀释，按CA1500血凝仪操作说明，做纤维蛋白原的测定。以不同浓度的纤维蛋白原标准 品含量为横坐标，以相应的凝固时间为纵坐标，绘制标准曲线。

将待测血浆用巴比妥缓冲液按1:10稀释，取待测血浆，按CA1500操作说明，分别用原花 青素含量不同的纤维蛋白试剂，测定待测血浆的凝固时间，从绘制的标准曲线上，求得血浆的 纤维蛋白原浓度。结果表明，当原花青素的加入量分别为0％、0.10％、0.50％、1％和1.50％时， 测定的正常血浆的纤维蛋白原浓度值分别为3.6g/L、3.7g/L、3.6g/L、3.8g/L和3.7g/L，检测 结果均在正常范围以内，这表明在上述加入量条件下，原花青素的加入不影响纤维蛋白原的测 定值。即在上述浓度条件下，原花青素的加入量对纤维蛋白测定值没有影响。所有检测值均位 于标准的偏离区间之内。与不加原花青素的试剂相比，在相同的测试条件下，测试值没有显著 差异。

实施例4

原花青素对凝血酶试剂稳定性的影响

先配制50mMTris缓冲液，按质量体积百分比，加入其中原花青素1.0％、α-丙氨酸1.5％、 氯化钙9mM、聚乙二醇0.1％、甘露醇2.3％、麦芽糖1.6％、山梨酸钾1％。混合均匀后，加入 凝血酶冻干粉，制备凝血酶终浓度为100U/mL的溶液，即得液态纤维蛋白原测定试剂。作为 对比，另一组试剂中不添加原花青素，其余组成完全相同。

将配制的液态纤维蛋白原测定试剂，用CA1500全自动血凝仪，对纤维蛋白原浓度为3.8g/L 的质控血浆的纤维蛋白原浓度随时间的变化情况进行检测。具体地，将制备的液态纤维蛋白原 测定试剂，在2-8℃条件下保存，每月定时取样一次，连取12个月，按实施例3的方法，检测 纤维蛋白原浓度为3.8g/L的质控血浆的纤维蛋白原浓度变化，同时与不添加原花青素的液态纤 维蛋白原测定试剂进行对比。结果见表1。

表1原花青素对纤维蛋白原测定试剂稳定性的影响单位：g/L

上述结果表明，增添原花青素后的液态纤维蛋白原测定试剂的稳定性显著增强。

由于在纤维蛋白原测定试剂中添加原花青素不会抑制凝血酶的蛋白活性，因此，我们认为 试剂稳定性的提升，受益于原花青素对抗活性氧较强的消除能力、对影响凝血酶稳定性的二价 金属离子的螯合效应以及多酚类的抗菌性能。