同时检测蔬菜/水果中杀线威和杀线威肟残留量的方法

摘要

本发明公开了一种同时检测蔬菜/水果中杀线威和杀线威肟残留量的方法，步骤如下：(1)提取：取待检测的蔬菜/水果样品，加入乙腈、NaCl，匀浆，离心；(2)净化：取上层乙腈相，置于装有基质分散固相萃取剂的离心管中，离心，取上清液，氮气吹干，流动相定容，过0.22μm有机系滤膜，得样品液；(3)测定和结果计算：采用液相色谱-质谱/质谱联用仪对样品液进行检测，测得杀线威或杀线威肟的色谱峰面积，代入标准曲线，计算得到样品液中杀线威或杀线威肟含量。本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速的样品前处理方法，杀线威和杀线威肟的检出限分别为0.002mg/kg和0.001mg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种农药及其代谢物残留量的检测方法，具体涉及一种同时检测蔬菜、水果中杀线威及代谢物杀线威肟残留量的检测方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

杀线威是一种氨基甲酸酯类杀线虫剂、杀螨剂和杀虫剂，其通用名OXAMYL，化学名N，N-二甲基-2-甲基氨基甲酰基氧代亚氨-2-甲硫基乙酰胺。杀虫机理是通过抑制乙酰胆碱酯酶活性达到防治的目的。该药能防治蓟马、蚜虫、马铃薯瓢虫、螨等，广泛应用于柑桔、棉花、大豆、烟草、果树、蔬菜和某些观赏作物。该药是广谱性的杀线虫剂，可叶面处理亦可土壤处理，可在植物体内吸收传导，也可保留在土壤中对线虫起作用，可同时杀灭地上和地下害虫。同时，该药还可与多菌灵、克菌丹等多种杀菌剂混用，防治某些病害，具有杀虫谱广、杀伤力强、见效期快、不杀伤天敌等特点，因此该品种在国内外得到广泛应用。

杀线威为剧毒农药，有神经毒性，能抑制脑、红细胞和血浆中的胆碱酯酶活性，由于使用广泛，杀线威通过环境进入人体的几率大，对人的身体健康影响较大。杀线威的检测方法主要有液相色谱-紫外检测器法、液相色谱-质谱/质谱法、气液色谱法-火焰光度检测器法等。NY/T1453-2007《蔬菜及水果中多菌灵等16种农药残留测定液相色谱-质谱-质谱联用法》采用乙酸乙酯提取，硅胶小柱净化，液相色谱-质谱/质谱联用仪检测的方法。SN/T0134-2010《进出口食品中杀线威等12种氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》采用乙腈提取，乙腈饱和的正己烷液-液分配净化，氟罗里硅土和活性炭固相小柱净化，液相色谱-质谱/质谱检测的方法。这两种标准只有检测杀线威的方法，未提到杀线威代谢物杀线威肟的检测方法。而GB2763-2014《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定杀线威的残留物为杀线威和杀线威肟之和，以杀线威表示。因此，建立一种简便、快速、准确的蔬菜和水果中杀线威及其代谢物杀线威肟残留量同时检测的方法非常必要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种同时检测蔬菜、水果中杀线威及其代谢物杀线威肟残留量的方法，试验结果表明该方法操作简便、快速、分离效果好，准确度和精密度均能达到定量分析的要求，具有灵敏度高、重复性好、操作简便、快速、准确等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种同时检测蔬菜/水果中杀线威和杀线威肟残留量的方法，包括以下步骤：

(1)提取：取待检测的蔬菜/水果样品，切成小段或小块，置于离心管中，加入乙腈匀浆，加入NaCl，再次匀浆，离心；

所述乙腈的加入比例为：每1克蔬菜/水果样品加入1ml的乙腈；

所述NaCl的加入比例为：每1克蔬菜/水果样品加入0.5克的NaCl；

当蔬菜/水果样品为脱水蔬菜/水果时，切成小段或小块后，加入适量水充分浸润(浸润5～30分钟)，然后再加入乙腈进行匀浆；

所述离心的参数为3800r/min离心5min；

(2)净化：上述离心后，取上层乙腈相，置于装有基质分散固相萃取剂的离心管中，混匀，离心，取上清液，氮气吹干，流动相定容，过0.22μm有机系滤膜，得样品液；

所述基质分散固相萃取剂由乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷键合相(C18)和石墨化炭黑(GCB)组成，PSA、C18和GCB三者的用量比例为100mg：50mg：10mg；每1ml乙腈相对应的PSA、C18和GCB三者的用量分别为100mg、50mg、10mg；

所述离心的参数为：5000r/min离心5min；

(3)测定和结果计算：进行定性或/和定量测定；

定性测定：检测样品中目标化合物(杀线威和杀线威肟)的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作液一致；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准液的离子相对丰度偏差不超过30％时，则判断该样品中存在杀线威和杀线威肟；若上述两个条件不能同时满足，则判断样品中不含杀线威和杀线威肟；

所述标准工作液是指杀线威或杀线威肟的标准工作液；

所述空白基质标准液是指不含杀线威或杀线威肟的样品经步骤(1)(2)处理后得到的样品液；

定量测定：采用液相色谱-质谱/质谱联用仪对样品液进行检测，测得样品液中杀线威或杀线威肟的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中杀线威或杀线威肟含量，然后根据样品液所代表样品的质量计算得到待检测的蔬菜/水果样品中杀线威或杀线威肟残留量。

优选的，所述液相色谱-质谱/质谱联用仪为Agilent1260-6420-Agilent，USA，色谱柱为EclipseplusC18，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm。

所述液相色谱和质谱条件为：流速：0.4mL/min；柱温：35℃；进样量：5μL；离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；毛细管电压：4KV(-)；脱溶剂温度：300℃；脱溶剂气流量：10L/min；雾化器压力：35psi；所用流动相为0.1％(体积百分比)甲酸水溶液-甲醇，洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱方式见表1。

表1

时间(min)0.1％甲酸水(％)甲醇(％)0.0080201.0060403.0040605.0020807.0020807.01802012.008020

所述杀线威检测方式为多重反应监测(MRM)，杀线威肟检测方式为选择离子监测(SIM)，具体如表2所示。

表2

所述标准曲线是通过以下方法得到的：配制系列浓度的杀线威标准工作液和杀线威肟标准工作液，在与样品液的检测条件相同的条件下进行HPLC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

所述系列浓度的杀线威标准工作液的浓度依次为0.01、0.05、0.1、0.5、5μg/mL，由杀线威标准品配置而成。

所述系列浓度的杀线威肟标准工作液的浓度依次为0.01、0.05、0.1、0.5、5μg/mL，由杀线威肟标准品配置而成。

现有技术中，杀线威肟在液相色谱-质谱/质谱仪上只能扫描到母离子185.1，不能再进一步打碎优化。为解决该问题，本方法选择了离子监测(SIM)的方式对杀线威肟进行检测，多重反应监测(MRM)的方式对杀线威进行检测。但在做果蔬样品时，样品中的杂质峰对杀线威肟的定性、定量产生了干扰，为克服该难题，clipseplusC18柱采用长150mm、内径4.6mm、粒径5μm的柱子，流动相梯度洗脱的方法，样品中的干扰峰很好的与目标峰分离，实现了采用液相色谱-质谱/质谱联用仪对果蔬样品中杀线威和杀线威肟同时检测的目的。

本发明同时检测蔬菜/水果中杀线威和杀线威肟残留量的方法，优点为：本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于蔬菜/水果中杀线威及杀线威肟残留量的同时检测，杀线威和杀线威肟的平均回收率分别为92.0％～96.8％和90.5～95.1％，平均相对标准偏差(RSD)分别为1.0％～4.3％和1.7～3.1％，检出限分别为0.002mg/kg和0.001mg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。本发明的方法能满足我国、美国、欧盟对杀线威在蔬菜/水果中安全检测的技术要求，为保障我国人民食品安全、对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1：50ng/mL杀线威和杀线威肟辣椒基质标液的色谱图。

图2：不含杀线威和杀线威肟的辣椒空白样品的色谱图。

图3：杀线威辣椒基质标准工作曲线示意图。

图4：杀线威肟辣椒基质标准工作曲线示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明的实施例中使用的仪器与试剂：

T18Basic均质器(IKA，Germany)；Agilent1260-6420液相色谱仪-质谱/质谱联用仪(Agilent，USA)；VORTEX4基本型旋涡混合器(IKA，Germany)；HeraeusMultifugeX1R离心机(ThermoFisher，USA)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂(40～60μm)、十八烷基硅烷键合相(C₁₈)净化剂(40～60μm)、石墨化炭黑(GCB)净化剂(120-400目)均购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。

试剂：乙腈(HPLC级，Merke，Germany)；氯化钠为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：杀线威(100mg/L)，杀线威肟(纯度98.5％)，购自上海安谱科学仪器有限公司。

实施例1辣椒中杀线威和杀线威肟残留量的检测

(1)样品前处理：取待检测的辣椒样品，切成长度1cm左右的小段，充分混匀；称取处理好的辣椒样品10.0克，加入10mL乙腈，匀浆1min，加入5g氯化钠，再次匀浆1min，3800r/min离心5min；取上清液6mL，转移至装有0.6gPSA、0.3gC18和0.06gGCB的15mL离心管中，3000r/min涡旋1min，4℃5000r/min离心5min，取上清液5mL于10mL离心管中，40℃氮气吹干，加1mL的流动相溶解残渣，混匀，过0.22μm滤膜，得样品液，移入进样瓶中待HPLC-MS/MS测定。

(2)基质标准工作溶液的配制：

基质标准工作溶液的配制：准确称取50±0.1mg标准品(杀线威、杀线威肟)于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，分别定容得1000.0μg/mL标准储备液；分别移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容得到10.0μg/mL混合标准中间液；将混合标准中间液用辣椒基质空白逐步稀释配成浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、5μg/mL的混合基质标准溶液。0.05μg/mL杀线威和杀线威肟辣椒基质标液的色谱图见图1。

辣椒基质空白：不含杀线威、杀线威肟的辣椒样品，按辣椒前处理方法处理得到的待进样液。辣椒基质空白样品色谱图见图2。

(3)液相色谱-质谱/质谱联用仪(HPLC-MS/MS)测定：

将上述配制的不同浓度梯度的标准工作液分别注入HPLC-MS/MS，以外标法进行杀线威和杀线威肟含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品液注入HPLC-MS/MS进行测定，测得样品液中杀线威和杀线威肟的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中杀线威和杀线威肟含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中杀线威和杀线威肟残留量。其中，色谱条件为：色谱柱为EclipseplusC18，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm；流速：0.4mL/min；柱温：35℃；进样量：5μL。流动相采用梯度洗脱方式，见表3所示。

表3

时间(min)0.1％甲酸水(％)甲醇(％)0.0080201.0060403.0040605.0020807.0020807.01802012.008020

质谱条件为：离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；毛细管电压：4KV(-)；脱溶剂温度：300℃；脱溶剂气流量：10L/min；雾化器压力：35psi。

检测方式：杀线威检测方式为多重反应监测(MRM)，杀线威肟检测方式为选择离子监测(SIM)，如表4所示。

表4

所得到的标准工作曲线如表5、图3、图4所示。

表5杀线威和杀线威肟的辣椒基质标准曲线

名称保留时间(min)回归方程相关系数杀线威7.27Y＝25349x+55130.9929杀线威肟6.95Y＝91338x+177360.9925

加标回收率和重复性：

在不含杀线威和杀线威肟的辣椒中加入0.002、0.5和5mg/kg3个浓度水平的杀线威标准溶液，加入0.001、0.5和5mg/kg3个浓度水平的杀线威肟标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差，测定结果见表6。

表6杀线威、杀线威肟在辣椒中的回收率和重复性(n＝5)

从表6中可以看出，在3个加标水平上，杀线威的平均回收率为93.1％～96.8％，平均相对标准偏差(RSD)为1.0％～4.3％，杀线威肟的平均回收率为91.7％～95.1％，平均相对标准偏差(RSD)为1.7％～3.1％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

灵敏度：

以实际添加样品的最低检测浓度为检出限，本实施例杀线威在辣椒的检出限为0.002mg/kg，本实施例杀线威肟在辣椒的检出限为0.001mg/kg。

实施例2苹果中杀线威和杀线威肟残留量的检测

(1)样品前处理：取待检测的苹果样品，切成长宽高各1cm左右的小块，充分混匀。称取处理好的苹果样品10.0克，加入5mL蒸馏水，加入10mL乙腈，匀浆1min，加入5g氯化钠，再次匀浆1min，3800r/min离心5min；取上清液6mL，转移至装有0.6gPSA、0.3gC18和0.06gGCB的15mL离心管中，3000r/min涡旋1min，4℃5000r/min离心5min，取上清液5mL于10mL离心管中，40℃氮气吹干，加1mL的流动相溶解残渣，混匀，过0.22μm滤膜，得样品液，移入进样瓶中待HPLC-MS/MS测定。

(2)标准工作溶液的配制：

基质标准工作溶液的配制：准确称取50±0.1mg标准品(杀线威、杀线威肟)于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，分别定容得1000.0μg/mL标准储备液；分别移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容得到10.0μg/mL混合标准中间液；将混合标准中间液用苹果基质空白逐步稀释配成浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、5μg/mL的混合基质标准溶液。

苹果基质空白：不含杀线威的苹果，按苹果的前处理方法处理得到的待进样液为苹果基质空白。

(3)液相色谱-质谱/质谱联用仪(HPLC-MS/MS)测定：

操作步骤、色谱和质谱条件与上述辣椒样品中杀线威和杀线威肟的测定一致。

以苹果基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表7所示。

表7杀线威和杀线威肟的苹果基质标准曲线

名称保留时间(min)回归方程相关系数杀线威7.27Y＝25349x+55130.9929杀线威肟6.95Y＝91338x+177360.9925

加标回收率和重复性：

在不含杀线威和杀线威肟的苹果中加入0.002、0.5和5mg/kg3个浓度水平的杀线威标准溶液，加入0.001、0.5和5mg/kg3个浓度水平的杀线威肟标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定5次，得其相对标准偏差，测定结果见表8。

表8苹果中杀线威、杀线威肟的回收率和重复性(n＝5)

从表8中可以看出，在3个加标水平上，杀线威的平均回收率为92.0％～94.2％，平均相对标准偏差(RSD)为1.1％～2.3％，杀线威肟的平均回收率为90.5％～93.4％，平均相对标准偏差(RSD)为1.8％～2.3％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

灵敏度：

以实际添加样品的最低检测浓度为检出限，本实施例中杀线威在苹果的检出限为0.002mg/kg，杀线威肟在苹果的检出限为0.001mg/kg。

实施例3油菜、葡萄中杀线威和杀线威肟残留量的检测

取待检测的油菜、葡萄样品，油菜切成长度1cm左右的小段，葡萄切成长宽高各1cm左右的小块，充分混匀。称取处理好的样品10.0克，加入10mL乙腈，匀浆1min，加入5g氯化钠，再次匀浆1min，3800r/min离心5min；取上清液6mL，转移至装有0.6gPSA、0.3gC18和0.06gGCB的15mL离心管中，3000r/min涡旋1min，4℃5000r/min离心5min，取上清液5mL于10mL离心管中，40℃氮气吹干，加1mL的流动相溶解残渣，混匀，过0.22μm滤膜，得样品液，移入进样瓶中待HPLC-MS/MS测定(检测方法同实施例1)。

对比实例：采用SN/T0134-2010《进出口食品中杀线威等12种氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法液相色谱-质谱/质谱法》的方法对样品进行前处理和检测。

检测结果及比较如表9所示。

表9杀线威、杀线威肟的回收率、重复性(n＝5)及检出限

从以上结果可以看出，实施例3杀线威、杀线威肟在油菜和葡萄中的最低检出浓度分别为0.002mg/kg、0.001mg/kg，对比实例杀线威在油菜和葡萄中的最低检出浓度为0.005mg/kg，对比实例未有杀线威肟的检测方法。实施例3杀线威在油菜、葡萄添加浓度0.005mg/kg，平均回收率为95.4％和93.8％，RSD为2.1％和2.5％，对比实例杀线威在油菜、葡萄添加浓度0.005mg/kg，平均回收率为83.7％和80.2％，RSD为4.5％和5.2％。相对对比实例，实施例3简单快速，试剂用量少，对环境及操作人员安全环保。说明本方法不但能完成杀线威和杀线威肟的同时检测，且检出线低，回收率高，重复性好，具有简便快速、安全环保等优点。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。