一种玉米成熟种子粉质胚乳指甲油辅助完整切片制作方法

摘要

本发明公开了一种玉米成熟种子粉质胚乳指甲油辅助完整切片制作方法，包括种子的粘贴固定、修块、指甲油包埋、再修块、半薄切片、切片染色和观察等步骤，其特点是：①采用强力胶水将成熟种子粘贴固定于树脂底座上；②使用无色透明指甲油作为包埋剂，快速包埋胚乳组织；③建立一种适用于玉米成熟种子粉质胚乳的快速简便干切技术，获得种子的完整切片；④切片有多种用途，可以进行碘液染色或者偏光观察淀粉粒的形态和大小以及在胚乳组织中的空间分布。本发明解决了石蜡切片和树脂切片无法制备玉米成熟种子完整切片的问题，同时克服了干切法不能制备粉质胚乳切片的缺陷，从而为研究玉米成熟种子粉质胚乳的形态结构提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明涉及植物显微组织切片技术领域，特别是涉及一种玉米成熟种子粉质胚乳完整切片 制作方法。

背景技术

玉米是人类粮食、动物饲料和工业原料的主要来源作物之一。玉米种子含有较大的胚乳， 是玉米重要的营养贮藏组织，它的发育和充实状况决定着种子的重量与品质。玉米胚乳分为 角质和粉质两类，前者胚乳细胞充实，而后者胚乳细胞不充实。淀粉是胚乳最主要的贮藏物 质，其形态、大小和在胚乳组织中的分布一直是玉米育种学家非常关注的问题。

对玉米胚乳进行形态结构观察，首先要对种子进行切片。目前玉米胚乳形态结构的研究 主要集中在发育种子，而对成熟种子的研究很少，尤其是粉质胚乳的研究鲜有报道，主要原 因表现在以下几个方面：①常规的植物组织切片用经典的石蜡切片技术，但该方法不适于富 含淀粉的成熟种子。②利用树脂包埋玉米成熟种子，虽然可以制作切片，但玉米种子过大， 难以获得完整的胚乳切片，并且树脂包埋过程比较繁琐耗时，包埋剂价格昂贵。③国外有人 利用干切法对玉米种子进行切片，但只适用于角质胚乳，而粉质胚乳无法完成，并且利用干 切法也无法获得完整的种子切片。因此亟需对现有的切片制作方法进行改良和优化，发明一 种针对玉米成熟种子粉质胚乳的简便快速的完整切片制作方法。

发明内容

为了克服上述现有切片制作方法的不足，本发明提供了一种玉米成熟种子粉质胚乳指甲 油辅助完整切片制作方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种玉米成熟种子粉质胚乳指甲油辅助完整切片制作方法，包括种子的粘贴固定、修块、包 埋、再修块、半薄切片、切片染色和观察等步骤，其特征在于：采用强力胶水将成熟种子粘 贴固定于树脂底座上；使用无色透明指甲油作为包埋剂，快速包埋胚乳组织。

具体步骤如下：

(1)种子粘贴固定：将玉米成熟种子从种子中部横切，用强力胶水粘贴固定在已聚合的 树脂底座上；树脂底座的面积大于样品面积，树脂底座的形状上下均匀；树脂底座的横截面 积要大于样品，以防止切片时样品震颤影响切片，同时树脂底座还要小于样品夹的大小，以 便将底座完全夹住；强力胶水粘贴样品与底座需要过夜，以便完全粘牢，防止震颤发生；

(2)粗修：在超薄切片机上使用双面刀片和玻璃刀对样品进行粗修块，将样品面修理平 整，确保样品面是籽粒的横切面；

(3)精修：换用锋利的玻璃刀对已经平整的样品表面进行精修块，使样品表面呈镜面；

(4)指甲油包埋：用指甲油配带的毛刷沾取少量指甲油，对已经修成镜面的样品表面进 行适量涂抹，确保完全覆盖即可，动作要轻柔；室温干燥15分钟；

(5)再修块：使用玻璃刀将样品表面上多余的指甲油切除，切到样品随即停止。由于渗 透深度是有限的，因此不能多切，否则会浪费被渗透的样品；

(6)半薄切片：对样品切取厚度为2微米的切片，将切片放在载玻片上的水滴上，45摄 氏度烤片台上干燥，使切片展平；

(7)染色观察：滴加碘液后避光静置10分钟，用盖玻片封片后显微镜下观察；

切片经碘液染色后，或者不染色进行50％浓度甘油封片后，分别在带有CCD的偏光显 微镜的可见光模式和偏光模式下观察拍照，即可获得完整种子的显微结构(图1)，淀粉粒在 胚乳组织中的形态和大小及在胚乳中的分布(图2)，淀粉粒的偏光图像(图3)。偏光观察必 须使用50％浓度甘油封片，使用水封片时易干，出现气泡，影响观察效果。

步骤(2)具体是：将树脂底座夹在切片机的样品夹上，在切片机的体视显微镜观察下用锋利 的刀片将切片部位尽量修平；之后安装好玻璃刀，经过适当的对刀后，使用回刀的方式转动 样品臂升降钮使样品臂上下运动，同时控制操作面板，使带有玻璃刀的底座缓慢前进，直到 刀锋刚好切到材料整个切面，充分修平为止。

步骤(3)中所述样品精修块时切片厚度为500纳米。

步骤(4)具体是：①指甲油涂抹：切面修成镜面之后，使用指甲油自带的毛刷沾取足量指 甲油，均匀缓慢地涂抹在整个样品面上，动作要轻柔，避免毛刷划到样品，切面上有划痕会 影响所得切片的视觉效果；还要涂抹均匀，避免产生气泡影响观察；②指甲油渗透：涂抹好 指甲油后，静置15分钟左右，让指甲油进行充分地渗透和适当的凝固；渗透时间过短，指甲 油渗透不充分，无法对淀粉粒进行良好的固定，静置时间过长会导致渗透的部位凝固过硬， 切片易碎；指甲油凝固后，所渗透的部位即完成包埋；本发明采用指甲油作为包埋剂，并进 一步解决了样品的位置固定、确立包埋方法、涂抹方法以及渗透时间等技术问题。

与现有切片制作方法相比，本发明的优势在于：

(1)建立了适用于玉米成熟种子粉质胚乳的快速完整切片制作方法；

(2)使用无色透明指甲油作为快速包埋剂，相比较于树脂等更经济；

(3)操作过程简便，简单易学，易于推广；

(4)节省固定、包埋等样品前处理步骤，更为便利；

(5)指甲油相比较于树脂和各种固定液，毒性更低，使用起来更为安全；

(6)可以更加快速且完整地切下种子的完整切片；

(7)该方法获得切片有多种用途：可以用碘液对淀粉粒进行特异性染色或者偏光观察。 碘染色淀粉粒或偏光下淀粉粒的“十字花环”结构清晰，反差明显，易于观察。快速简便， 并且切片经过浸泡清洗后可以重复利用。

附图说明

图1为玉米品种先玉335成熟种子(富含粉质胚乳)指甲油辅助完整切片，切片经碘染 色，在可见光下显示淀粉在胚乳组织中的分布；

图2为图1局部区域放大，示粉质胚乳内淀粉粒的形态和大小；

图3为胚乳切片在偏光显微镜下的图片，示淀粉粒的“十字花环”。

具体实施方式

下面结合实例附图对本发明作进一步说明：

1、切片样品的准备：

种子粘贴固定：首先用锉刀将玉米成熟籽粒沿横切方向打磨到目标切片部位，再采用锋 利刀片或者线锯从玉米种子中部横切得到样品块；将大小合适且形状均匀的树脂底座顶端用 锉刀磨平并且用酒精擦拭干净，酒精干后滴加适量强力胶水，将样品块横放在树脂底座上的 胶水中，轻按10秒钟，放置过夜即可确保粘贴牢固。树脂底座的横截面积要大于样品，以防 止切片时样品震颤影响切片，同时树脂底座还要小于样品夹的大小，以便将底座完全夹住； 强力胶水粘贴样品与底座需要过夜，以便完全粘牢，防止震颤发生；

2、修块：

(1)粗修：

①将树脂底座夹在切片机的样品夹上，确保夹牢；

②在切片机的体视显微镜下用锋利的刀片将切片部位尽量修平；

③安装玻璃刀，放在刀座上夹紧；

④调整好样品块和玻璃刀的位置，在体视镜下对刀，使刀锋和样品面尽量对齐：

a)打开底部的背光灯，关闭其他照明灯，进刀使样品面与刀锋靠近，可以看见样品面上 出现一个亮条，利用这个亮条判断样品与刀是否对齐；

b)先调整样品面上下两条边与刀锋平行：观察亮条的上下两条边是否平行，若不平行， 则调整样品夹旋转旋钮，使其平行；

c)再调整样品面的左右与刀锋平行：观察亮条的左右两条边是否等长，若不等长，则调 整刀锋旋转旋钮，使其相等；

d)最后调整样品面的上下与刀锋平行：上下移动样品面，观察亮条左右两条边的长度是 否变化，若有变化，则调整样品面旋转旋钮，使其长度不变；

⑤对刀完成后，进刀使刀锋与样品接近，样品面下缘与刀锋等高，转动样品臂升降钮 使样品臂上下运动，使刀锋刚好切到材料为止；

⑥使用回刀的方式快速来回升降样品臂，同时控制操作面板，使带有玻璃刀的底座缓 慢前进，使样品面充分修平；

(2)精修：更换锋利玻璃刀，确保刀口齐平。重新进行上述对刀后，顺时针转动样品臂 升降钮，对样品进行精修，切片厚度为500纳米，将样品面修成镜面；

(4)指甲油包埋：

①指甲油涂抹：切面修成镜面之后，使用指甲油自带的毛刷沾取足量指甲油，均匀缓慢 地涂抹在整个样品面上，动作要轻柔，避免毛刷划到样品，切面上有划痕会影响所得切片的 视觉效果；还要涂抹均匀，避免产生气泡影响渗透；

②指甲油渗透：涂抹好指甲油后，静置15分钟左右，让指甲油进行充分地渗透和适当 的凝固；渗透时间过短，指甲油渗透不充分，无法对淀粉粒进行良好的固定，静置时间过长 会导致渗透的部位凝固过硬，切片易碎；指甲油凝固后，所渗透的部位即完成包埋；

4、切片：

(1)再修块：包埋完成后，将之前的玻璃刀往后稍微退刀，再在体视镜观察下缓慢向前 进刀，顺时针转动样品臂，将样品面上多余的指甲油全部切掉，至恰好切到完整样品面为止； 由于渗透深度是有限的，因此不能多切，否则会浪费被渗透的样品；

(2)半薄切片：

①切片厚度设置为2微米，进行手动切片：右手缓慢转动样品臂升降钮开始切片，在 切片的整个过程中，左手拿睫毛笔轻轻放在切片前端边缘的正上方，防止其卷曲；当切片被 切出较多时，睫毛笔要放置在切片下面，防止其粘贴在玻璃刀上；此过程最为关键，左手要 始终保持稳定，防止睫毛碰到刀锋或戳破切片；

②取干净的载玻片，滴加适量蒸馏水，用镊子小心夹住切片边缘，将切片以和水平面 成45度角轻轻放在水滴上，45摄氏度烤片台上干燥，使切片展平；

③将切片放于烘箱中，60摄氏度12小时，防止染色过程中脱片。

5、染色与拍照：

(1)碘液染色：

①碘液配制：5克碘加10克碘化钾加85毫升蒸馏水，完全溶解后用50％甘油稀释80 倍作为染液。

②碘染色(染淀粉，呈蓝紫色)：滴加碘液后避光静置10分钟，用盖玻片封片后显微 镜下观察；

(2)拍照：

切片经上述碘液染色封片或者使用50％浓度甘油封片后，分别用OlympusBX53偏光显 微镜的正常光模式和偏光模式观察胚乳细胞的显微结构，用附带的CCD进行拍照，获得分辨 率高、反差适中的光学显微图片(图1和图2)和偏光图片(图3)。