香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途

摘要

本发明属于医药领域，涉及一种香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用途。本发明从山芝麻属Helicteres植物山芝麻H.angustifolia中提取分离得到一种香豆素类化合物6,7,9α-三羟基-3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素并证实其抗乙肝病毒活性。所述的化合物经与阳性对照拉米呋啶药理试验比较，结果证实前者具有显著的抗乙肝病毒作用，对HBsAg的IC

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及香豆素类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的用 途，具体涉及一种从药用植物山芝麻中分离得到的香豆素类化合物6,7,9α-三羟基 -3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素在制备抗乙肝病毒药物中的用途。

背景技术

据有关统计显示，全世界约有3亿多人为慢性乙肝病毒(HBV)携带者， 我国约占半数。乙肝病毒感染已成为全球性的影响人类健康的主要疾病之一，由 于HBV感染可以导致慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌，因此成为影响人类寿命 的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者较非携带者发生肝癌的相对危险率为 217，因此在全世界每年大约有200万人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我国 又是乙型肝炎的高发区，每年约有25万人死于与乙肝相关的慢性肝病(肝硬化 与肝癌)。上述疾病给人民健康和国民经济带来巨大损失。因此，寻求高效低毒 的抗HBV药物已成为刻不容缓的问题。

药物化学工作者在筛选抗HBV药物的过程中进行了不懈的努力，但到目前 为止还在寻找能治愈HBV感染的特效药。临床上已获得FDA正式批准使用的 α-干扰素和核苷类药物拉米呋啶能在某种程度上获得治疗效果，但对大多数病人 还达不到治愈的目的，且停止治疗后的“反跳”现象是医药工作者最感棘手的问 题，所以开发研制高效、低毒、不“反跳”的抗HBV新药向药物化学工作者提出 了挑战。在筛选抗HBV新药的过程中，越来越多的药物化学工作者将注意力转 向了植物来源丰富、价廉易得、毒副作用小、分子结构复杂多样的天然化合物。

山芝麻为梧桐科植物山芝麻(HelicteresangustifoliaL.)的干燥根或全株， 味苦、性寒，归肺、大肠经，可解表清热、解毒消肿，用于治疗感冒发热、痄腮、 乳娥、麻疹、咳嗽、泄泻痢疾、痈肿。药理研究表明山芝麻具有抗菌、抗炎、抗 病毒及抗肿瘤等活性。有研究表明山芝麻粗提物具有抗HBV活性，但对其抗HBV 的药效物质却缺乏研究，迄今为止，尚未见有关涉及本发明的6,7,9α-三羟基 -3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素抗HBV活性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从山芝麻中分离得到的香豆素类化合物6,7,9α-三 羟基-3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素在制备抗乙肝病毒药物中的用途。

本发明应用现代药理筛选方法，从梧桐科山芝麻属(Helicteres)植物山芝麻 (H.angustifolia)中提取分离得到1个香豆素类化合物：6,7,9α-三羟基-3,8,11α- 三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素，并经与阳性对照拉米呋啶药理试验比较，结果证 实前者具有显著的抗乙肝病毒作用，对HBsAg的IC₅₀值为11.8μg/ml，对HBeAg 的IC₅₀值为34.2μg/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶。

本发明所述的活性化合物具有如下的化学结构：

本发明的化合物通过下述方法制备：

取山芝麻干燥根25kg，95％乙醇回流提取，浓缩后分别用石油醚、乙酸乙 酯和正丁醇萃取，共得0.95kg，取乙酸乙酯萃取物200g进行硅胶柱色谱，以二 氯甲烷-甲醇梯度洗脱，所得流份以不同洗脱剂进行反复硅胶柱色谱、MPLC和 半制备HPLC等分离纯化手段分离得到化合物6,7,9α-三羟基-3,8,11α-三甲基环己 烷嵌-[d,e]-香豆素。

本发明所述的6,7,9α-三羟基-3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素可作为活 性成分用于制备抗HBV的药物。

附图说明

图1是6,7,9α-三羟基-3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素的提取分离工艺 流程图。

具体实施方式

实施例1制备6,7,9α-三羟基-3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素

取山芝麻干燥根25kg，粉碎，用95％乙醇回流提取3次(50L×3)，每次 2h，合并提取液并浓缩得浸膏0.95kg，加水(4L)混悬，分别以等体积石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇萃取5次，合并萃取液并浓缩至干，得乙酸乙酯萃取物200g。 将乙酸乙酯萃取部位经硅胶(200-300目)柱色谱分离，依次以二氯甲烷-甲醇 (50:1-0:1)梯度洗脱，得到11个流份(Fr.1-11)，其中流份Fr.3(32g)再经硅 胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇，30:1,20:1,10:1,5:1,3:1,1:1)、MPLC(甲醇-水， 20:80-80:20梯度洗脱)和半制备HPLC等手段纯化，分离得到化合物6,7,9α-三 羟基-3,8,11α-三甲基环己烷嵌-[d,e]-香豆素 (6,7,9α-trihydroxy-3,8,11α-trimethylcyclohexo-[d,e]-coumarin,1)。

所得化合物为棕色无定型粉末，+27.6(c1.15,MeOH)；UV(MeOH) λ_maxnm(logε):322.3(3.54),210.6(4.67)；IR(KBr):υ_max(cm^-1):3358,2939,1687, 1626,1562,1392,1238；ESI-MSm/z:277[M+H]⁺。¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆) δ_H:4.90(1H,brs,H-9),3.33(1H,m,H-11),2.19(3H,s,13-OCH₃),2.10(3H,s, 12-OCH₃),2.06(1H,brd,J＝14.4Hz,H-10a),1.85(1H,m,H-10b),1.37(3H,d,J＝7.2 Hz,14-OCH₃)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ_C:163.1(C-2),147.7(C-8a),147.5 (C-7),145.7(C-6),139.0(C-4),125.1(C-5),117.2(C-3),109.4(C-8),107.5(C-4a), 62.8(C-9),35.6(C-10),25.6(C-11),22.1(14-OCH₃),12.2(12-OCH₃),8.9 (13-OCH₃)。

实施例2体外抗HBV实验

应用HepG2的2.2.15细胞株(教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室， 上海)，以每孔10×10⁵个细胞接种于24孔板，培养基为DMEM，生长液含10％ 胎牛血清，380μg/mlG418，0.03％谷胺酰胺，青霉素、链霉素各100μg/ml，在 5％CO₂孵箱中37℃培养，48小时后，换成二甲基亚砜助溶的含药物的培养液， 每种药物设3～5个浓度，每个浓度设4个平行孔，继续培养9天(每3天换液一 次)，收集上清液用ELISA检测HBsAg及HBeAg含量。同样条件下以不含药物 的培养液上清液作为对照组。同时用上述细胞株，用MTT法测定药物的细胞毒 性。阳性对照为拉米呋啶(3TC)，结果证实本发明所述化合物具有显著的抗HBV 活性，且有效浓度低，其对HBsAg的IC₅₀值为11.8μg/ml，对HBeAg的IC₅₀值 为34.2μg/ml，显著高于阳性对照拉米呋啶(如表1所示)。

表1.化合物1对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用

/：当细胞毒性≥25％时不进行抑制率测试

本发明中实验采用的试剂均为本领域公知技术，可市购。