一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基

摘要

本发明公开了一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基，包括芽启动培养基、试管苗增殖培养基、体细胞胚诱导培养基、不定芽诱导培养基、壮苗培养基和生根培养基，使用本发明培养基繁殖国槐幼苗，再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到95％以上，种苗生长健壮，不但可有效解决优良种苗种质退化问题，还可为国槐遗传转化或诱变育种提供一个理想的受体系统。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基。

背景技术

国槐(SophorajaponicaLinn)，别名家槐、中国槐，属蝶形花亚科、槐属。国槐为落叶乔木，树势优美，花期较长，极耐修剪，耐寒、耐旱、耐空气污染，又是吉祥、幸福、美好的象征，是理想的行道树种和庭院绿化树种，而且国槐材质优良，花、果实、根皮、树皮可入药，种子可榨油制皂，具有较高的经济价值，应用前景十分广阔。目前，国槐是嫁接龙爪槐、金枝槐、聊红槐、蝴蝶槐等观赏品种的唯一砧木树种，苗木需求大。国槐主要以种子繁殖为主，但其开花结果具有大小年现象，且种子易受病虫害危害，干瘪、空洞现象严重。常规的育种方法，依靠种子或扦插繁殖，难以满足生产的需求，基于此有必要对国槐进行组培快繁研究，提供优质、大量国槐种苗，切实解决国槐苗木需求的瓶颈。

国槐古树资源历经千百年的风霜岁月，具有最原始的长寿和抗逆基因，但由于各种原因，衰老死亡的现象时常发生。就古槐衰败的现状来看，常表现为树干腐朽空洞、冠形残缺、顶梢枯萎、枝叶凋零、病虫害严重、根系生长不良等等。这些古槐是大自然和前人留给我们的宝贵的基因资源。

近年来，利用生物转基因技术培育具有抗性如抗逆、抗虫、抗病等新型品种是国槐育种的新趋势。到目前为止，对槐树的形成层培养、茎培养、叶片培养、胚培养、未授粉子房的培养均已获得了完整的植株，对原生质的培养也取得了一定的进展。袁秀云等利用国槐的子叶和下胚轴产生了不定芽，王喆之等利用花药培养形成了单倍体植株，HanK.H等(1993，1997)将直径为0.5～1.0cm的枝条消毒后，取出形成层接入愈伤诱导培养基中诱导愈伤，再将愈伤组织转入分化培养基中，获得了丛生芽，将成苗转入生根培养基中，可诱导生根。上述的方法存在的缺点：由于国槐为多年生木本植物，其再生率普遍较低，出芽少，直接影响了国槐的遗传转化。利用植物体胚诱导技术不但能达到保存母株优良基因、快速繁育的目的，还是提高基因遗传转化或诱变育种的重要途径。目前，有关国槐的体细胞胚诱导技术研究的较少，可以参考的现有技术比较少。国槐为多年生乔木，基因组庞大，鉴于基因型的限制，其他物种的体细胞胚诱导的繁殖技术对国槐没有参考价值。在这一方面，即使是同一物种，不同的品种之间，体胚诱导培养基也不相同。例如，同样是国槐，同一种培养基，对黄金槐适合，对金叶槐就不适合。

专利CN102499086A公开了一种刺槐的繁殖方法，以不同胚龄的合子胚为外植体，以MS+2，4-D+BA+蔗糖+琼脂为胚性愈伤组织的诱导培养基；以MS基本培养基+MES+谷氨酰胺+水解酪蛋白+萘乙酸+6-苄氨基腺嘌呤+蔗糖+琼脂为体细胞胚诱导培养基，通过对愈伤组织的诱导，形成球形胚后将其转接到MS+水解酪蛋白培养基上，进行体细胞胚的成熟培养，然后转接到MS基本培养基上萌发形成完整小植株。该专利使用刺槐的不同胚龄的合子胚(荚果)作为原料进行体细胞培养，不论是刺槐还是国槐，其每年的花期以及果实期都是固定的两个月左右，所以在进行体细胞培养时具有时间的局限性；国槐的离体叶片、不成熟的合子胚均可诱导产生胚状体。但是，在山东地区，最近几年的国槐小峰危害非常严重，很难采到无虫害的完整种子。其次，相对于国槐叶片诱导来说，不成熟合子胚的诱导时间更长，且诱导出的丛生芽也不如叶片诱导的多。因此，本专利采用取材方便、诱导率高的叶片进行国槐体胚诱导。国槐与刺槐分属不同的属，物种差别较大，不能参考荚果的体细胞培养得到叶片的体细胞培养。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于国槐离体叶片体胚诱导快繁的成套培养基，包括芽启动培养基、试管苗增殖培养基、体细胞胚诱导培养基、不定芽诱导培养基、壮苗培养基和生根培养基，其中：

所述芽启动培养基是指：MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；

所述试管苗增殖培养基是指：MS+1.0～2.0mg/LBA+1.0～2.0mg/LIBA+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；

所述体细胞胚诱导培养基是指：MS+3.0～5.0mg/L2,4-D+0.5～1.0mg/LBA+0.5～1.0mg/LNAA+0.1～0.5mg/LTDZ+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；

所述不定芽诱导培养基是指:MS+0.1～0.5mg/LBA+0.1～0.5mg/LNAA+0.5～1.0mg/L谷氨酰胺+0.5～1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；

所述壮苗培养基MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；

所述生根培养基是指：1/2MS+0.1～0.5mg/LIBA+0～0.05mg/LNAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗糖,pH值5.8～6.0；所述1/2MS指的是MS全量减半。

所述MS包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。

所述的常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，七水硫酸镁370mg/L，无水磷酸二氢钾170mg/L，二水氯化钙440mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L。

所述的微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：四水硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L。

所述的有机试剂的组分和其对应的浓度如下：盐酸硫胺素10mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，肌醇100mg/L。

有益效果：

体细胞胚发生的因素包括内因和外因，内因包括物种和基因型，外因主要涉及培养基中附加成分的种类和浓度。即使是同一属的植物，由于基因型不同，体细胞胚发生频率相差极大，原因如下:一是不同基因型体细胞胚发生频率不同，二是不同基因型的最适诱导条件不同。外植体的生理状态和发育程度都直接影响体细胞胚的发生，一般生理代谢旺盛而分化程度较低的组织有利于体细胞胚的诱导。

对于培养基中必需的生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸，还原性氮盐和外源氨基酸，pH值等其他因素，他们的作用方向、作用程度都不相同。诱导植物体细胞胚发生的因素众多，但它们的作用程度不尽相同，各种因子通过转录与翻译水平复杂而精确地调控，使体细胞胚发生的相关基因在时间上和空间上得以选择性激活和表达，只有各种因素配合使用时才能快速、高效地诱导出体细胞胚。

外植体的生理状态和发育程度都直接影响体细胞胚的发生，一般生理代谢旺盛而分化程度较低的组织有利于体细胞胚的诱导，叶片相较于花芽、花药、子叶、子房中的合子胚，各种单细胞，游离的小孢子、原生质体以及体细胞胚本身的分化程度都高，做体细胞诱导的难度也更大。

发明人综合考虑影响国槐叶片体细胞胚发生的各种因素，围绕提高再生率、增加出芽，提高植株移栽成活率等目的，设计了本发明的一套培养基，该培养基相较于其他的培养基再生率高、出芽多，植株移栽成活率可达到95％以上，种苗生长健壮，不但可有效解决优良种苗种质退化问题，还可为国槐遗传转化或诱变育种提供一个理想的受体系统

使用本发明的培养基繁殖国槐幼苗，可省去先建立国槐快繁再生体系这一步骤，大大节省时间。

附图说明

图1离体叶片划伤口；

图2经过暗培养形成胚性愈伤组织；

图3光照培养形成黏性愈伤组织；

图4愈伤组织诱导出丛生芽；

图5切割丛生芽进行快繁培养；

图6长成小苗；

图7小苗生根；

图8移栽到花盆中炼苗；

图9成活后花盆中单株种植。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。

实施例一：

选取生长健壮、性状表现优良的单株，取其无病虫害的当年生嫩枝，除去多余的茎叶，用洗洁精仔细清洗后，流水冲洗1小时，清洗干净后，切割成适当大小准备消毒。

将试材置于超净工作台上，用70％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞灭菌10min，无菌水冲洗5次，用灭菌滤纸吸干水分，然后剪取1cm左右带一个腋芽或顶芽的茎段，垂直插入芽启动培养基(MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。每瓶接种3个茎段，诱导顶芽和腋芽萌发。经过15d的培养，茎段腋芽或顶芽开始萌动，茎尖明显伸长，40d左右芽点可长成2cm左右的新梢。

将诱导出的新梢，切下接种在试管苗增殖培养基(MS+2.0mg/LBA+2.0mg/LIBA+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。一般茎基部有少量愈伤产生并从愈伤处长出2～3个小芽，25d继代1次，通过连续几次继代培养，可获得试验所需无菌试管苗。

以试管苗第3到第6片展开叶片为材料，叶片带短叶柄，叶片背面朝上放置在培养皿中，用手术刀片垂直于叶片主脉轻轻划3刀，不要划至叶边缘。叶背朝下紧贴培养基放置，接种在体胚诱导培养基(MS+3.0mg/L2，4-D+0.5mg/LBA+0.5mg/LNAA+0.1mg/LTDZ+0.5mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。暗培养30d，诱导体胚的形成。开始，叶片慢慢变硬变厚，逐渐形成愈伤组织，经过30d的暗培养，外植体变为浅黄色黏状愈伤组织。

将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基(MS+0.3mg/LBA+0.1mg/LNAA+0.5mg/L谷氨酰胺+0.5mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。放入温度白天25±2℃，夜晚20±2℃，光照强度1000～1500lx，光照时间16h/d的培养室中培养，愈伤组织逐渐增殖。在此环境中培养90d，中间用同种培养基继代两次。继代一次后，愈伤组织出现绿色的芽点。再继续继代一次，绿色的芽点逐渐长成1～2cm的小苗。

将小苗从基部切下，转入壮苗培养基(MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中，进行壮苗培养。培养环境同上。大约培养25d，小苗长至3～4cm高。

将小苗从基部剪下，去除小苗下半部分的叶片，插入生根培养基(1/2MS+0.1mg/LIBA+0.05mg/LNAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.8)中。12d左右，小苗基部有根原基长出，15d，有新根长出，待新根长至0.5cm以上时，即可炼苗移栽。

首先将试管苗封口膜绑绳松开，在培养室适应1～2d，转入遮光度50％的温室中(不要通风)，去掉封口膜，炼苗2～3d，待小苗气孔可自主开合后，用镊子轻轻将小苗夹出，清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的花盆中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持相对湿度在80％以上，如此驯化炼苗5～10d后，长出新根，新芽萌出，逐渐减少浇水次数并进行常规管理。

花盆混合育苗基质的成分以体积比计为：珍珠岩：锯末：腐殖土＝30：30：40。

所述繁殖过程中的发育情况如图1-图3所示。

按照该实施例的结果如下表：

实施例二：

选取生长健壮、性状表现优良的单株，取其无病虫害的当年生嫩枝，除去多余的茎叶，用洗洁精仔细清洗后，流水冲洗1小时，清洗干净后，切割成适当大小准备消毒。

将试材置于超净工作台上，用70％的酒精消毒40s，无菌水冲洗4次，再用0.1％升汞灭菌12min，无菌水冲洗6次，用灭菌滤纸吸干水分，然后剪取1cm左右带一个腋芽或顶芽的茎段，垂直插入芽启动培养基(MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。每瓶接种3个茎段，诱导芽萌发。经过18d的培养，茎段腋芽或顶芽开始萌动，茎尖明显伸长，44d左右芽点可长成2cm左右的新梢。

将诱导出的新梢，切下接种在试管苗增殖培养基(MS+1.0mg/LBA+1.0mg/LIBA+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。一般茎基部有少量愈伤产生并从愈伤处长出2～3个小芽，25d继代1次，通过连续几次继代培养，可获得试验所需无菌试管苗。

以试管苗第3到第6片展开叶为外植体，叶片带短叶柄，叶片背面朝上放置在培养皿中，用手术刀片垂直于叶片主脉轻轻划3刀，不要划至叶边缘。叶背朝下紧贴培养基放置，接种在体胚诱导培养基(MS+4.0mg/L2，4-D+0.7mg/LBA+0.7mg/LNAA+0.4mg/LTDZ+0.8mg/L－谷氨酰胺+0.8mg/LCH(水解酪蛋白)++5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。经过28d的暗培养，外植体由绿色的叶片变为浅黄色黏状愈伤组织。

将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基(MS+0.4mg/LBA+0.2mg/LNAA+0.8mg/L谷氨酰胺+0.8mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。放入温度白天25±2℃，夜晚20±2℃，光照强度1000～1500lx，光照时间16h/d的培养室中培养，愈伤组织逐渐增殖。在此环境中培养80d，中间用同种培养基继代两次。继代一次后，愈伤组织出现绿色的芽点。再继续继代一次，绿色的芽点逐渐长成1～2cm的小苗。

将小苗从基部切下，转入壮苗培养基(MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中，进行壮苗培养。培养环境同上。大约培养25d，小苗长至3～4cm高。

将小苗从基部剪下，去除小苗下半部分的叶片，插入生根培养基(1/2MS+0.3mg/LIBA+0.03mg/LNAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.8)中。10d左右，小苗基部有根原基长出，13d，有新根长出，待新根长至0.5cm以上时，即可炼苗移栽。

首先将试管苗封口膜绑绳松开，在培养室适应1～2d，转入遮光度50％的温室中(不要通风)，去掉瓶盖，炼苗2～3d，待小苗气孔可自主开合后，用镊子轻轻将小苗夹出，清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的花盆中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持相对湿度在80％以上，如此驯化炼苗5～10d后，长出新根，新芽萌出，逐渐减少浇水次数并进行常规管理。

花盆中混合育苗基质的成分以体积比计为：珍珠岩：锯末：腐殖土＝30：30：40。

按照该实施例的结果如下表：

实施例三：

选取生长健壮、性状表现优良的单株，取其无病虫害的当年生嫩枝，除去多余的茎叶，用洗洁精仔细清洗后，流水冲洗1小时，清洗干净后，切割成适当大小准备消毒。

将试材置于超净工作台上，用70％的酒精消毒60s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞灭菌15min，无菌水冲洗6次，用灭菌滤纸吸干水分，然后剪取1cm左右带一个腋芽或顶芽的茎段，垂直插入芽启动培养基(MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。每瓶接种3个茎段，诱导芽萌发。经过20d的培养，茎段腋芽或顶芽开始萌动，茎尖明显伸长，50d左右芽点可长成2cm左右的新梢。

将诱导出的新梢，切下接种在试管苗增殖培养基(MS+1.5mg/LBA+1.5mg/LIBA+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。一般茎基部有少量愈伤产生并从愈伤处长出2～3个小芽，30d继代1次，通过连续几次继代培养，可获得试验所需无菌试管苗。

以试管苗第3到第6片展开叶为外植体，叶片带短叶柄，叶片背面朝上放置在培养皿中，用手术刀片垂直于叶片主脉轻轻划3刀，不要划至叶边缘。叶背朝下紧贴培养基放置，接种在体胚诱导培养基(MS+5.0mg/L2，4-D+1.0mg/LBA+1.0mg/LNAA+0.5mg/LTDZ+1.0mg/L谷氨酰胺+1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。经过25d的暗培养，外植体变为浅黄色黏状愈伤组织。

将上述愈伤组织转接到不定芽诱导培养基(MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+1.0mg/L谷氨酰胺+1.0mg/LCH(水解酪蛋白)+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中。放入温度白天25±2℃，夜晚20±2℃，光照强度1000～1500lx，光照时间16h/d的培养室中培养。在此环境中培养65d，中间用同种培养基继代两次。继代一次后，愈伤组织出现绿色的芽点。再继续继代一次，绿色的芽点逐渐长成1～2cm的小苗。

将小苗从基部切下，转入壮苗培养基(MS+5.0g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值5.8)中，进行壮苗培养。培养环境同上。大约培养25d，小苗长至3～4cm高。

将小苗从基部剪下，去除小苗下半部分的叶片，插入生根培养基(1/2MS+0.5mg/LIBA+0.05mg/LNAA+5.0g/L琼脂+20g/L蔗糖，pH值5.8)中。8d左右，小苗基部有根原基长出，11d，有新根长出，待新根长至0.5cm以上时，即可炼苗移栽。

首先将试管苗封口膜绑绳松开，在培养室适应1～2d，转入遮光度50％的温室中(不要通风)，去掉封口膜，炼苗2-3d，待小苗气孔可自主开合后，用镊子轻轻将小苗夹出，清水洗去基部残留的培养基，移栽到装有混合育苗基质的花盆中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持相对湿度在80％以上，如此驯化炼苗5～10d后，长出新根，新芽萌出，逐渐减少浇水次数并进行常规管理。

花盆中混合育苗基质的成分以体积比计为：珍珠岩：锯末：腐殖土＝30：30：40。

按照该实施例的结果如下表：

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。