三个多肽片段在制备抗纤维化药物中的医药用途

摘要

本发明公开了三个具有抗纤维化作用的多肽片断，应用于制备抗纤维化药物。这三个多肽的氨基酸序列为：Pep69：KFYIHSDY、Pep70：PGLYYFD和Pep71：PGLYYFD。

说明书

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及到三个多肽片段在制备抗纤维化药物的用途。

背景技术

纤维化是细胞外基质在组织中的过度沉积和器官组织重构的病理过程，其疾病谱大，包括累及多系统的疾病，如系统性硬化症、多灶性纤维化、硬皮病、肾源性的多系统纤维化，也包括器官组织特异性疾病如肺、肝脏、肾脏纤维化等。转化生长因子(TGF-β)是纤维化中的关键因子，负责起始和维持成纤维细胞的激活和成肌纤维细胞的分化，因而阻断TGF-β信号通路是经典的治疗纤维化疾病的手段。TGF-β信号通路涉及细胞因子较多，寻找有效的目标细胞因子是治疗纤维化疾病的关键。

近期研究表明，脂联素受体被脂联素激活后，能够诱导一磷酸腺苷酸激活的蛋白激酶(AMPK)阻断TGF-β经典信号通路，成为纤维化疾病治疗的重要途径。脂联素是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性蛋白质，具有调节体内能量平衡、糖脂代谢、抗炎症、抗动脉硬化等多种作用，是一种具有广泛生物效应的细胞因子。人体内的脂联素由244个氨基酸组成，包含氨基端的信号序列，胶原重复序列以及碳端的球状结构域，其中球状结构域是脂联素生物活性的关键部位。脂联素受体在体内主要有两个亚型，AdipoR1和AdipoR2，同源性为66.7％，在物种间高度保守，均为7次跨膜蛋白。脂联素通过与AdipoR1相互作用激活AMPK信号通路，AMPK的激活能够减少TGF-β诱导的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原-α1(COL1A1)的产生，从而达到抗纤维化的作用。动物实验也证明了脂联素通过与AdipoR1作用能够抑制纤维化的进程，说明了AdipoR1激动剂是一类潜在的抗纤维化药物。

发明内容

本发明的目的是提供三个多肽片段能与AdipoR1特异性结合并激动该受体，诱导AMPK通路来阻断TGF-β经典信号通路，进而抑制α-SMA、COL1A1的表达，从而治疗纤维化疾病。

本发明使用同源模建方法构建了AdipoR1的三维结构模型。利用分子对接研究分析了已知活性多肽与AdipoR1的相互作用模式，确认了AdipoR1的关键氨基酸。通过分子对接虚拟筛选出三个评分较高的多肽片段。体外的细胞周期阻滞和抗纤维化活性试验，结果表明，三个多肽片段均能明显抑制α-SMA和COL1A1基因/蛋白表达水平，提示其较强的抗纤维化活性。

本发明包含的三个多肽片段的序列分别为：Pep69：KFYIHSDY、Pep70：PGLYYFD和Pep71：PGLYYFD。它们均可通过阻断TGF-β经典信号通路，下调α-SMA和COL1A1基因表达水平，进而抑制α-SMA和COL1A1的蛋白表达，从而达到治疗纤维化疾病的目的。

进一步地，本发明还提供了三种多肽片段在制备抗纤维化药物中的应用。

三个多肽片段制备药物，可以是单独一个多肽片段制剂，也可以是三个多肽片段以任意比例混合的制剂，也可以是三个多肽片段以任意比例与药学上可接受的载体组成的各种制剂，如注射剂、口服液、丸剂、片剂、胶囊等，这些药学上可接受的载体可以是：所述载体材料包括填充剂、崩解剂、润湿剂、粘合剂、泡腾剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、矫嗅剂、着色剂以及其他种类的固体制剂的赋形剂。

本发明中的多肽片段含有以下氨基酸序列：KFYIHSDY、PGLYYFD或PGLYYFD。

附图说明

图1：三个多肽片段对HSC-T6细胞增殖的影响；图2：三个多肽片段对HSC-T6细胞周期的影响；图3：三个多肽片段对α-SMA(A)、COL1A1(B)和TGF-β1(C)基因表达水平的影响；图4：三个多肽片段对α-SMA、COL1A1和TGF-β1蛋白表达水平的影响。

具体实施方式

本发明涉及三个多肽片断通过阻断TGF-β信号通路，减少外源性TGF-β诱导的α-SMA和COL-1的产生，从而达到抗纤维化的作用。

下面是本发明的部分抗纤维化试验及结果：

试剂与仪器

试剂：检测活性的多肽片段：Pep69(KFYIHSDY)、Pep70(PGLYYFD)和Pep71(PGLYYFD)，阳性对照肽：ADP355，阴性对照肽Pep56(TETSQVAPA)；细胞株：HSC-T6细胞；试剂：DMEM高糖培养基(含0.1％FBS)、鼠TGF-β1、CCK-8试剂盒、TRIzol、cDNA第一链合成试剂盒。

仪器：流式细胞仪(BDFACSCalibur，BD，USA)、酶标仪(Model550；Bio-Rad，Hercules，CA，USA)、荧光定量qPCR仪(Bio-RadLaboratoriesInc.，USA)。

一、三个多肽片段对HSC-T6细胞增殖及周期的影响：

1.细胞培养

HSC-T6细胞用含有10％热灭活胎牛血清的DMEM高糖完全培养基在37℃、体积分数为5％CO₂、完全饱和湿度条件下常规培养，每48h更换培养基，细胞生长铺满培养瓶底80％后，用0.25％胰蛋白酶联合0.02％EDTA消化传代，实验选用对数生长期细胞。

2.CCK-8法检测三个多肽对HSC-T6细胞增殖的影响

取对数生长期的大鼠肝星状细胞HSC-T6，常规消化、制备单细胞悬液，接种于96孔培养板中，1×10⁴/100μl/孔，另设细胞空白对照组及单纯培养液本底组；细胞铺板24h后，每孔加入不同浓度的各多肽药物(终浓度分别为：0.05，0.5，1.0，5.0，10.0，50和100μM)或PBS继续处理24h，加入CCK-8溶液，10μl/孔，37℃孵育4h；置于酶标仪上测定570nm波长吸光度OD值，按以下公式计算增殖率：增殖率＝(实验组OD值-本底组OD值)/(对照组OD值-本底组OD值)×100％。

3.流式细胞术检测三个多肽对HSC-T6细胞周期的影响

取对数生长期HSC-T6细胞，制备单细胞悬液，接种于24孔培养板中，1×10⁴/500μl/孔，置37℃5％CO₂条件下培养过夜，使各孔细胞贴壁，分别加入不同的多肽药物(终浓度均为：50μM)或PBS预处理1h，接着加入大鼠TGF-β1重组蛋白(终浓度：5ng/mL)刺激24h。收集HSC-T6细胞，1000rpm离心5分钟，预冷PBS洗涤细胞3次，离心弃上清。加入预冷75％乙醇500μl固定，于4℃固定过夜。离心去固定液，采用预冷的PBS洗涤细胞2次，轻轻震荡使细胞悬浮。加入100μg/ml的RNaseA15μl，涡旋振荡混合均匀，4℃避光放置15min。加入500μlPBS含50μg/mlPI，室温避光孵育10min，流式细胞仪检测细胞在各周期的分布情况，其中：激发光波＝488nm，发射光波长＝630nm。

结果判断：三个多肽片段均能抑制大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖；同时，在抑制细胞增殖的基础上，三个多肽片段对HSC-T6细胞还有明显的周期阻滞作用，其中以Pep70抑制活性最强，提示多肽的体外抗纤维活性。结果见图1～2。

本实验分别测定了三个多肽片段对HSC-T6细胞增殖和细胞周期的影响。

由图1可以看出，三个多肽片段均能剂量依赖性地抑制HSC-T6细胞的增殖，当浓度达到100μM时，抑制作用最强。在三个多肽片段中，Pep70对HSC-T6细胞增殖的抑制作用最为明显，在剂量100μM条件下，抑制率达到18.3％，与正常组比较有显著性差异(P＜0.05)。

由图2可以看出，三个多肽片段均对HSC-T6细胞的细胞周期产生阻滞作用，随着浓度的增高，G0/G1期细胞比例逐渐上升，而G2/M期细胞比例下降。与模型对照组比较，Pep69和Pep70处理组，在G2/M期的HSC-T6细胞比例明显下降，且具有显著性差异(p＜0.05)。

二、三个多肽片段的体外抗纤维化活性

1.体外细胞纤维化模型的建立

分别取生长状态良好的HSC-T6细胞，以1×10⁴/500μl/孔接种于24孔板。待细胞生长融合度达80％，更换含0.1％FBS的培养基，饥饿处理16h，使细胞同步化，给予大鼠TGF-β1重组蛋白(终浓：5ng/ml)刺激24h。吸弃培养基，采用Trizol提取细胞总RNA，Q-PCR检测α-SMA和COL1A1的基因表达水平，确定建模是否成功。

2.体外抗纤维化活性的测定

2.1三个多肽片段对α-SMA和COL1A1基因表达水平的影响

取生长状态良好的HSC-T6细胞，接种于24孔板上(密度：1×10⁴/500μl/孔)，待细胞生长融合度达80％时，换用含0.1％FBS的培养基处理16h。分组：(1)空白组：加入相应体积的PBS处理；(2)模型组，加入相应体积的PBS+TGF-β1刺激；(3)阳性对照组，分别加入浓度为10，50和100μM的ADP355+TGF-β1刺激；(4)实验组，分别加入浓度为10，50和100μM的Pep69、Pep70、Pep71，并加入TGF-β1刺激；(5)阴性对照组，分别加入浓度为10，50和100μM的Pep56+TGF-β1刺激。在24孔板中按照每组设置3个复孔，给与相应多肽或溶剂预处理1h，TGF-β1刺激组加入外源性的大鼠TGF-β1重组蛋白(终浓度：5ng/ml)刺激24h。吸弃培养基，加入Trizol提取细胞总RNA，采用Q-PCR检测α-SMA和COL1A1的基因表达情况。

2.2三个多肽片段对α-SMA和COL1A1蛋白表达水平的影响

取生长状态良好的HSC-T6细胞，按照2.1中密度进行接种、分组和处理，在加入外源性的大鼠TGF-β1重组蛋白(终浓度：5ng/ml)刺激24h后，吸弃培养基，采用冷HBSS溶液轻柔洗涤2次，加入细胞裂解液冰上放置10min，震荡使细胞充分裂解，采用Westernblot检测α-SMA和COL1A1的蛋白表达情况。

结果判断：外源性的大鼠TGF-β1重组蛋白干预24h，可明显上调α-SMA、COL1A1和TGF-β1基因的表达，提示体外细胞纤维化模型建立成功。三个多肽片段均具有显著的体外抗纤维化活性，能剂量依赖性地抑制外源性TGF-β1上调的纤维化因子α-SMA、COL1A1和TGF-β1的基因和蛋白表达，进而抑制成肌纤维细胞分化和阻滞TGF-β1诱导的胶原蛋白积累，最终实现抗纤维化效应。结果见图3～4。

由图3可以看出，三个多肽片段均能明显抑制外源性TGF-β1诱导的纤维化因子α-SMA、COL1A1和TGF-β1的基因表达，且呈一定的量效关系，其中以Pep70的抗纤维活性最为显著，当其浓度达100μM时，对α-SMA，COL1A1和TGF-β1的抑制率分别为：78.1％、82.5％和85.0％，抑制作用较阳性对照肽(ADP355)稍强。

由图4可以看出，在下调α-SMA、COL1A1和TGF-β1基因水平的基础上，三个多肽片段对这三种纤维化因子对应的蛋白也表达出明显的抑制效应，抑制率分别为：24.0％、52.0％、52.0％(α-SMA)，12.5％、20.8％、29.2％(COL1A1)和61.0％、66.1％、69.5％(TGF-β1)，与模型对照组比较，具有显著性差异(p＜0.05)。表明，三个多肽片段对外源性TGF-β1诱导的纤维化具有显著的抑制效应。