蒽铬红A(ACRA)及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用

摘要

本发明涉及磷酸化蛋白质荧光检测技术，具体地说是蒽铬红A(ACRA)及其衍生物在磷酸化蛋白质荧光检测中的应用。本发明还提供了应用ACRA进行磷酸化蛋白质荧光检测的方法，包括步骤：将蛋白质样品电泳后固定；水洗；染色；经2步脱色；检测。本发明具有专属性好、检测限低、操作简易、重现性稳定、染色效果好、线性关系好、成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及磷酸化蛋白质荧光检测技术，具体地说涉及磷酸化蛋白质的一种新的荧光染 料。

背景技术

在生命科学研究领域，离不开对生命的基本物质蛋白质的研究，也就离不开对蛋白质的 检测技术。尤其是最近几年，随着蛋白质组学的飞速发展，使我们对蛋白质的检测技术有了 更高的要求。

蛋白质磷酸化修饰是最常见也是最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一，也是目前蛋白质 组学研究的热点之一，对于目前的研究尚且存在专属性检测方法的不足，磷酸化过程基本上 发生在酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸等氨基酸残基上。蛋白质的这一修饰与细胞的增殖、分化、 发育、凋亡等许多生命活动息息相关，据多年的研究证明，蛋白磷酸化与许多的临床疾病有 着复杂的关系。因此开发一种专属性强的检测方法成为了研究的突破点。

现存的凝胶上磷酸化蛋白质检测方法包括经典的Pro-QDiamond检测技术及Stains-all检 测技术等。其中Pro-QDiamond是目前特异性最强、应用最广、操作较为简便、灵敏度较高 的检测方法。

本发明首次将ACRA及其衍生物应用于磷酸化蛋白质荧光检测，相比于其他检测技术， 具有检测限低，专属性强等众多优点，在蛋白质组学研究中将具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于建立一种蒽铬红A(AnthraceneChromeRedA，ACRA)及其衍生物在 磷酸化蛋白质荧光检测中的应用。

本发明所述的ACRA相关化合物是指以ACRA为母核的钠盐、钾盐、盐酸盐、硫酸盐、 硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸盐、氢碘酸盐等。

ACRA母核为：

下面是本发明一个可用的凝胶检测方法，其包括步骤：

1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定2次，每次10～30min；弃固 定液，然后用去离子水冲洗5～30min；优选的固定时间为15min，去离子水冲洗时间为 15min，固定液可以是含有50％甲醇和10％乙酸的水溶液；

2)加入荧光染色液染色40～90min，其中所述染色液为含按摩尔浓度比1～10μM的ACRA 及按溶液体积比0.1～0.5％的乙酸；优选的ACRA浓度为3μM，优选的乙酸浓度为0.25％， 优选的染色时间为60min；

3)将染色完毕的凝胶置于脱色液中脱色10～30min，其中所述脱色液为含按摩尔浓度比 30～100mM的乙酸钠，按摩尔浓度比5～20μM的铝离子以及按溶液体积比5～20％的丙二 醇和20～40％的乙醇；优选的乙酸钠浓度为50mM，优选的铝离子浓度为9μM，优选的 丙二醇浓度为10％，优选的乙醇浓度为30％，优选的脱色时间为20min；

4)将上述经过脱色的凝胶进行第二次脱色，脱色时间为0.5～5min，其中所述的脱色液为含 按溶液体积比5～20％的丙二醇和20～40％的乙醇；其中优选的脱色时间为1min，优选的 丙二醇浓度为10％，优选的乙醇浓度为30％。

5)检测，运用Typhoon9400^TM扫描仪进行数据采集。

本发明方法具有如下优点：

1)高灵敏度：可媲美经典磷酸化蛋白检测试剂盒Pro-QDiamond；

2)操作简单迅速：操作步骤少，可在130min内完成；

3)重现性稳定：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；

4)染色背景好；

5)线性关系好：精确，能在较大范围内对蛋白质进行半定量测定；

6)可逆性好：容易脱色；

7)兼容性好：可与MALDI-TOF等质谱仪器以及其他染色方法高度兼容；

8)使用安全、环保、低毒；

9)专属性强；

10)成本低。

附图说明

图1.ACRA的化学结构；

图2.ACRA染色法和其他常用染色法灵敏度和特异性的比较。其中(A)为ACRA染色法， (B)为考马斯亮蓝(CBBR)染色法，(C)为Pro-QDiamond染色法，(D)为Stains-all染 法。磷酸化蛋白质为商品化标准品，从上至下分别为磷酸化酶b(phosphorylaseb，非磷酸化 蛋白)，牛血清白蛋白(BSA，非磷酸化蛋白)，卵白蛋白(OVA，磷酸化蛋白)，α-酪蛋白 (α-casein，磷酸化蛋白)，β-酪蛋白(β-casein，磷酸化蛋白)，κ-酪蛋白(κ-casein，磷酸 化蛋白)，卵白素(Avidin，非磷酸化蛋白)和溶解酵素(Lysozyme，非磷酸化蛋白)。蛋白 质载样量(从左至右，每条带)如下：500，250，125，62，32，16，8，4，2，1ng。

图3.ACRA染色法选择性考察。选用α-casein(含8个磷酸化位点)作为研究对象，比较其 去磷酸化后(经磷酸酶处理)，ACRA染色法对其的检测灵敏度的变化。(A)为ACRA染色 法，(B)为Pro-QDiamond染色法，(C)为SYPRORuby染色法。

图4.ACRA染色法对磷酸化蛋白检测的线性动态范围考察。(A)为ACRA染色法，(B)为 Pro-QDiamond染色法。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明， 而不能限制本发明的保护范围。

实施例1ACRA染色

槲皮素磷酸化蛋白质荧光染色实验采用下述步骤进行：

(1)固定：将电泳结束后的凝胶放置于50mL50％乙醇/10％乙酸的固定液中固定2次，每 次30分钟；

(2)水洗：将凝胶放入50mL去离子水中水洗15分钟；

(3)染色：将凝胶放入50mL3μMACRA/0.25％乙酸染色液中染色60分钟；

(4)脱色：将凝胶放入50mM乙酸钠/9μMAl³⁺/10％丙二醇/30％乙醇脱色液中脱色20分钟；

(5)脱色：将凝胶放置于50mL10％丙二醇/30％乙醇溶液中脱色1分钟。

(6)运用Typhoon9400^TM扫描仪进行数据采集。

按照上述方法分别用ACRA的钠盐、钾盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、鞣酸 盐、氢碘酸盐进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能得到类似于槲皮素的检测结果。 SDS-PAGE参照《分子克隆实验指南》第三版相关部分进行。

实验例1ACRA与其他常用染色法效果对比

采用不同方法进行染色，(A)为ACRA染色法，(B)为考马斯亮蓝(CBBR)染色法，(C) 为Pro-QDiamond染色法，(D)为Stains-all染法。磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白为商品化标准 品，从上至下分别为磷酸化酶b(phosphorylaseb，非磷酸化蛋白)，牛血清白蛋白(BSA， 非磷酸化蛋白)，卵白蛋白(OVA，磷酸化蛋白)，α-酪蛋白(α-casein，磷酸化蛋白)，β-酪蛋 白(β-casein，磷酸化蛋白)，κ-酪蛋白(κ-casein，磷酸化蛋白)，卵白素(Avidin，非磷酸 化蛋白)和溶解酵素(Lysozyme，非磷酸化蛋白)。蛋白质载样量(从左至右，每条带)如下： 500，250，125，62，32，16，8，4，2，1ng。结果如图2所示，ACRA染色法灵敏度比Stains-all 染色法高8-16倍，与Pro-QDiamond染色法相当。其中ACRA染色法采用实施例1的方法进 行，Pro-QDiamond，Stains-all，SYPRORuby和CBBR染色法分别按下述方式进行：

Pro-QDiamond^[1]：

(1)固定：将电泳完毕后的凝胶放置于50mL50％甲醇/10％乙酸的固定液中固定2次， 每次30分钟；

(2)水洗：将凝胶放置于50mL去离子水中平缓振摇，洗涤3次，每次10分钟；

(3)染色：将水洗之后的凝胶放置于50mL染色液中染色60～90分钟；

(4)脱色：将染色完毕的凝胶放置于50mL脱色液中脱色3次，每次30分钟。

Stains-all^[2]：

(1)水洗：将电泳完毕后的凝胶放置于30mL25％异丙醇中水洗2次，每次15分钟，50℃ 水浴条件下进行；

(2)染色：将水洗完毕后的凝胶放置于30mL0.005％Stains-all，10％甲酰胺，25％异丙醇， pH8.815mMTris-HCl的染色液中避光染色过夜；

(3)脱色：将染色完毕的凝胶放置于50mL的去离子水中避光脱色，直至对比度良好。

SYPRORuby^[3]：

(1)染色：将电泳完毕后的凝胶放置于50mLSYPRORuby中染色3小时；

(2)脱色：将染色结束的凝胶放置于50mL10％甲醇/7％乙酸的脱色液中脱色30分钟。

CBBR^[4]：

(1)固定：将电泳完毕后的凝胶放置于50mL40％甲醇/10％乙酸的固定液中固定2小时；

(2)染色：将固定完毕的凝胶放置于50mL0.1％CBBR/40％甲醇/10％乙酸染色液中染色1 小时；

(3)脱色：将染色结束后的凝胶放置于50mL40％甲醇/10％乙酸的脱色液中脱色1小时。

实验例2ACRA染色法选择性考察

采用不同染料进行染色，选用α-casein(含8个磷酸化位点)作为研究对象，比较其去 磷酸化后(经磷酸酶处理)，ACRA染色法对其的检测灵敏度的变化，考察方法的选择性。(A) 为ACRA染色法，(B)为Pro-QDiamond染色法，(C)为SYPRORuby染色法。结果如图3 所示，α-casein经磷酸酶处理，在ACRA染色法中，其检测信号大为减弱，同样的现象可在 Pro-QDiamond染色法中发现。表明ACRA染色法的选择性可与作为磷酸化蛋白质检测技术 黄金准则的Pro-QDiamond染色法相媲美。

实验例3ACRA染色法与Pro-QDiamond染色法线性动态范围的对比

四种不同分子量的标准蛋白质(卵白蛋白(OVA)，α-酪蛋白(α-casein)，β-酪蛋白 (β-casein)，κ-酪蛋白(κ-casein))在10％聚丙烯酰胺凝胶中分离，经(A)ACRA染色法； (B)Pro-QDiamond染色法染色后，用Tina2.09图像软件分析标准蛋白上样量与条带强度的 线性曲线，从而比较两种染色方法的线性范围。标准蛋白质上样量范围为卵白蛋白(OVA) 2～500ng，α-酪蛋白(α-casein)2～500ng，β-酪蛋白(β-casein)2～500ng，κ-酪蛋白(κ-casein) 8～500ng。由图4显示ACRA染色法与Pro-QDiamond染色法具有一致的线性范围。

参考文献：

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[3]KieraN.Berggren，BirteSchulenberg，MaryF.Lopez.，etal.AnimprovedformulationofSYPRORuby proteingelstain：ComparisonwiththeoriginalformulationandwitharutheniumIItris(bathophenanthroline disulfonate)formulation.Proteomics2002，2：486-498

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