病毒性出血性败血症病毒可视化核酸试纸条检测引物组和检测方法

摘要

本发明公开了一种病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测引物组和检测方法，所述引物的序列如下：VHSV281-F：5’-FITC-CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT-3’，5’端标记FITC；VHSV281-R：5’-biotin-TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA-3’，5’端标记biotin。检测方法，包括以下步骤：①RT-PCR扩增；②PCR产物试纸条检测试验。本发明的方法具有操作便利、特异性强、灵敏度高，结果直观、稳定、可靠、对环境友好等多项优点，适合口岸检疫实验室进行VHSV的快速筛查，提高了出入境口岸的鉴定工作效率，能更好地适应进出口贸易快速通关的要求，所使用的RT-PCR产物检测试纸条是个通用型试纸条，可以广泛应用于ＰＣＲ诊断试剂的开发，该检测方法无需电泳仪、凝胶成像仪等仪器设备投入，应用成本低，对于ＰＣＲ检测方法在基层实验室的推广应用将有着巨大的推动作用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测引物组和检 测方法。

背景技术：

病毒性出血性败血症（viralhaemorrhaicsepticaemia，VHS）是由弹状病毒引起鲑、 鳟、狗鱼和大菱鲆等数十种鱼类的一种烈性传染病，表现为出血性败血症，致死率达90%~ 100%。本病主要流行于北半球，是世界动物卫生组织（OIE）要求须申报的疫病，我国将其列 为二类疫病。VHSV基因组为一段单链负链RNA，其线性基因组编码5个蛋白，包括：核衣壳蛋 白(N蛋白)，两个结构蛋白(M1和M2蛋白)，糖蛋白(G蛋白)和RNA聚合酶(L蛋白)。VHSV 粒子长约180nm，宽约70nm。其基因组长度约12k个碱基。

目前国际上检测病毒性出血性败血症病毒通常采用的方法是细胞培养分离病毒 法、血清学方法、反转录聚合酶链反应法以及酶联免疫吸附试验。细胞培养分离VHSV法结果 可靠，但是检测周期长，不适用于快速鉴别诊断;传统的病毒细胞培养法和血清学法均受限 于各自的特点，检测费时费力，难于满足快速检测的需要。因此，探讨其快速诊断方法，对病 毒性出血性败血症病毒的疫情监控及流行病学调查，从而采取相应的防治措施具有重要意 义。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种可以快速诊断病毒性出血性败血症病毒 (VHSV)的方法。本发明在病毒性出血性败血症病毒5’端设计一对引物，建立VHSV可视化核 酸试纸条检测技术，并对其反应条件进行优化，该方法快速、灵敏、具有良好的特异性。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测引物组，所述引 物的序列如下：

VHSV281-F：5’-FITC-CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT-3’，5’端标记FITC；

VHSV281-R：5’-biotin-TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA-3’，5’端标记biotin。

同时，本发明还提供一种病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条检测 方法，包括以下步骤：

①RT-PCR扩增

提取VHSV总RNA，进行RT-PCR扩增，具体参数为：45℃10min进行逆转录；95℃10min 热启动；然后进行35次PCR循环（94℃30s,55℃30s,72℃30s循环）；72℃7min；4℃ 保温；

②PCR产物试纸条检测试验

取5μL扩增产物滴加在试纸条的样品垫上，同时滴加2～3滴缓冲液，10min后观察质 控线、检测线，判读出阴、阳性的结果；所述的缓冲液是RT-PCR产物检测试纸条配套的缓冲 液。

在检测带区域出现明显红色条带为阳性，否则为阴性。

本发明所使用的RT-PCR产物检测试纸条是个通用型试纸条，包括里面配套使用的 缓冲液。

本发明的有益效果：

本发明通过将逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）与核酸试纸条检测方法相结合，首次建 立了一种核酸试纸条可视化检测VHSV的方法，无需凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物所需要的 制胶、电泳、成像等步骤，将2h的检测时间缩短为10min左右，大大提高了检测效率，灵敏度 试验结果表明核酸试纸条法的检测灵敏度比传统电泳凝胶成像高10倍以上，同时该方法检 测完后只产生少量的纸质垃圾，处理简单，对环境友好，而凝胶电泳法检测结束后，产生染 色凝胶及塑料手套，处理困难，后期处理成本也高。

本发明的方法具有操作便利、特异性强、灵敏度高，结果直观、稳定、可靠、对环境 友好等多项优点，适合口岸检疫实验室进行VHSV的快速筛查，提高了出入境口岸的鉴定工 作效率，能更好地适应进出口贸易快速通关的要求，所使用的RT-PCR产物检测试纸条是个 通用型试纸条，可以广泛应用于PCR诊断试剂的开发，该检测方法无需电泳仪、凝胶成像仪 等仪器设备投入，应用成本低，对于PCR检测方法在基层实验室的推广应用将有着巨大的推 动作用。

附图或附表说明：

图1是VHSV核酸试纸条检测结果。

图2是核酸试纸条检测VHSV的特异性。

图3是VHSV核酸试纸条方法的灵敏度测试。

图4是实际样品的VHSV的核酸试纸条检测方法结果。

图5是实际样品的VHSV的凝胶成像检测方法结果。

上述附图中，每次核酸试纸条检测都是做两次平行试验。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图或附表进一步阐述本发明。

1.1病毒和细胞系

病毒性出血性败血症病毒（VHSV）及RNA、传染性造血组织坏死病病毒（infectious haematopoieticnecrosisvirus，IHNV）RNA和鲤春病毒（springviraemiaofcarp virus，SVCV）RNA等病毒均由山东出入境检验检疫局实验室保存。

1.2试剂与仪器

DL2000DNAmarker、TaqDNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖购自美 国Promega公司；ABIProflexPCR仪；RT-PCR试剂盒（ABIAM1005）购自ABI公司、通用型核 酸扩增物快速检测试纸条（购自杭州优思达生物技术有限公司）。

1.3引物设计和RT-PCR扩增

在VHSV5’端设计保守引物，引物序列为

VHSV281-F（CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT）（5’端标记FITC）；

VHSV281-R（TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA）（5’端标记biotin），扩增长度为281bp。

RT-PCR扩增参数为：45℃10min进行逆转录；95℃10min热启动；然后进行35 次PCR循环（94℃30s,55℃30s,72℃30s循环）；72℃7min；4℃保温。

实施例1：VHSV试纸条检测

PCR产物试纸条检测试验

取5μL扩增产物滴加在试纸条的样品垫上，同时滴加3滴缓冲液，10min后观察质控 线、检测线，判读出阴、阳性的结果。

扩增产物滴加在试纸条的样品垫上检测,在检测带区域出现明显红色条带，空白 对照没有红色条带（图1）。

实施例2：核酸试纸条方法的特异性

用VHSV281-F和VHSV281-R引物对对VHSV、IHNV、SVCVRNA进行RT-PCR扩增并进行核酸 试纸条检测，从检测结果可以看出（图2），只有VHSV扩增产物出现特异性红色条带，IHNV、 SVCV和空白对照在检测线位置均无条带出现，显示了该检测方法良好的特异性。

实施例3：核酸试纸条方法的灵敏度

提取并测定VHSV假病毒RNA的浓度，分别稀释成6.6、33、66、6.6×10²、6.6×10³、6.6× 10⁴、6.6×10⁵、6.6×10⁶、6.6×10⁷拷贝/μL,进行RT-PCR,用核酸试纸条进行检测，从结果 可以看出（图3），核酸试纸条方法可以检测限可以达到33拷贝/μL。

实施例4：实际样品的VHSV检测和灵敏度比较

提取并测定VHSV病毒RNA的浓度，分别进行10倍稀释至109倍,进行RT-PCR,分别用凝 胶成像法和核酸试纸条法进行检测，从结果可以看出（图4和图5），核酸试纸条方法可以检 测可以达到108稀释倍数，比凝胶成像法灵敏度高出10倍。

核苷酸序列表

<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>病毒性出血性败血症病毒可视化核酸试纸条检测引物组和检测方法

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<400>1

CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT20

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(23)

<400>2

TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA23