病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)焦磷酸测序检测技术的建立

摘要

近年来随着鱼类养殖品种的增多和养殖规模的扩大；鱼类国际贸易和地区贸易的发展，鱼类传染性疾病不断爆发和流行，严重制约了水产养殖业的健康可持续发展。在各种传染性病原中，病毒是最重要的致病病原，传染性造血器官坏死病毒（IHNV）和病毒性出血性败血症病毒（VHSV）已经成为严重危害世界鱼类养殖业发展的重要病原体。
　　本研究通过参考OIE《水生动物疫病诊断手册》2015版，扩增了IHNV、VHSV的核酸保守序列，将序列插入改造后的pET32a表达载体，从而制备了IHNV、VHSV假病毒。通过对 IHNV、VHSV假病毒的定值将其制备成标准品，并为后续检测方法的构建提供了一个物质平台。
　　通过收集 IHNV、VHSV基因序列，设计了两种病毒最为保守的指纹序列，以及测序引物，建立了 IHNV、VHSV焦磷酸测序检测方法。运用该方法对所构建的IHNV、VHSV假病毒进行检测，均能快速而准确测出指纹序列。对所构建的IHNV、VHSV焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测，试验结果表明所建立的方法特异性好，在6种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒，检测方法灵敏度高，最低检出核酸量为10 pg。
　　最后，对建立的焦磷酸测序检测方法行了实际应用研究，选取国内采集与进口的鱼类样本共计80批次进行IHNV、VHSV检测，并将检测结果与OIE推荐的常规RT-PCR检测方法进行对比。结果显示，焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RT-PCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本，检测结果与定量PCR一致，该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。
　　本研究建立的焦磷酸测序检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便、通量高，检测结果真实可靠，满足水生动物疫病检测的要求，具有重要的经济意义与社会意义。

目录

声明

缩略语

第一章 前言

1 传染性造血器官坏死病毒（IHNV）和病毒性出血性败血症病毒（VHSV）概述

2 水生动物疫病常用检测技术

3 标准物质与假病毒

4 焦磷酸测序技术简介

5 研究目的

第二章IHNV、VHSV标准物质的构建

1 材料

2 实验方法

3 试验结果

4讨论

第三章 IHNV、VHSV焦磷酸检测方法的建立

1 生物信息学分析及测序引物设计

2.测序引物的RT-PCR扩增

3. 焦磷酸测序的建立

4 讨论

第四章 VHSV、IHNV焦磷酸测序方法验证与应用

1 材料与方法

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第五章 总结

参考文献

致谢