一种美丽库蠓特异基因及其分子鉴定方法

摘要

本发明公开一种美丽库蠓特异基因及其分子鉴定方法，其特征在于采用分子生物学方法获取该库蠓的COⅠ基因序列，通过基因序列相似性的比对，对该库蠓进行种类鉴定。本发明提供的美丽库蠓分子鉴定方法，有利于实现美丽库蠓准确、快速的鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种库蠓的COⅠ基因序列及其分子鉴定方法。

背景技术

库蠓是我国三大吸血蠓之一，可传播蓝舌病、住球虫病等多种人兽共患病，是一种 重要的病媒生物。因此，对吸血蠓的鉴定和识别，是监测与控制蠓传疾病发生的基础，也是 疾病预防控制领域的核心步骤。目前，对吸血蠓的鉴定主要依靠经验丰富的分类学专家识 别形态学特征来实现，一旦遇到近缘种和形态特征掌握不全的标本鉴定就很棘手；而且，对 吸血蠓的形态鉴定需要通过制作玻片标本来完成，操作步骤繁琐、周期长、难度大，因此，亟 需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

DNA条形码（DNAbarcode）是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异 的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码技术是利用生物体DNA中一段保守片段对物种 进行快速准确鉴定的新兴技术。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物 鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对 经验的过度依赖，有利于帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系 等。

作为DNA条形码的标准目的基因，一方面必须足够保守，便于利用通用引物进行 大范围的扩增；另一方面要有足够的变异来区分不同物种。因此，鉴定不同的物种类群需要 选择有效的目的基因。目前，在系统发育研究中广泛应用的标志基因是核糖体12S和16S基 因，但因其存在大量的插入和缺失现象，不宜用做条形编码基因。线粒体基因组中存在的13 个蛋白编码基因中仅细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（CytochromeOxidaseSubunitⅠ,COⅠ）、线 粒体细胞色素b（Cytb）、ND4、ND5这4个基因满足基因插入和缺失现象较少、长度在900

bp左右这两个条件，但ND4和ND5进化太快，不可能设计出通用引物，限制了它们作 为全面DNA鉴定系统的目标基因。故人们最终选定COⅠ基因中的一个片段作为DNA条形编 码基因。迄今为止，已有诸多研究证明COⅠ基因在鸟类、鱼类、鳞翅目昆虫、蚊类、蚁类和弹 尾目等类群的分类鉴定中行之有效。因此，可采用基于COⅠ基因的DNA条形码技术对吸血 蠓进行分子鉴定。该方法与传统的分类方法互为佐证，不仅可解决鉴定中标本残缺不全等 问题，而且可实现吸血蠓的快速鉴定。目前，通过该方法已获得多种吸血蠓的COⅠ基因序列 并上传Genbank中，但至今尚无美丽库蠓的相关基因序列。本发明提供的美丽库蠓基因序列 有利于实现美丽库蠓的快速鉴定，缩短鉴定时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种库蠓的COⅠ基因序列。通过分子生物学方法获取美丽 库蠓（Culicoidesbellulus）的COⅠ基因序列，通过基因序列相似性的比对，可准确、快速地 鉴定美丽库蠓。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

采用小型昆虫微量DNA模板制备方法，通过改进的PCR反应条件，由合成的引物扩增 该库蠓的COⅠ基因，PCR产物序列送由专业生物公司测定。测序结果通过手工校对、序列拼 接，并在NCBI中进行Blast相似性搜索，确保所得序列为目标序列。本发明所述的美丽库 蠓特异基因，为COⅠ基因，所述库蠓的COⅠ基因序列如SEQIDNo.1所示（不含引物）：

本发明所述的美丽库蠓COⅠ基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列为：

正向引物5’AATCATAAAGATATTGGAAC3’

反向引物5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG3’。

本发明所述的美丽库蠓的分子鉴定方法，包括：

1）从待测的昆虫组织中分离提取DNA；

2）以该DNA为模板，采用的引物为：正向引物5’AATCATAAAGATATTGGAAC3’，反向引物 5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG3’，通过聚合酶链式反应扩增出该昆虫的COⅠ基因；

3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应扩增出的COⅠ基因用琼脂糖电泳分离，经溴乙 锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果。若能相应地特异性扩增出大小 约为658bp的条带，送生物公司测序；

4）根据测序结果，若目标基因序列与SEQIDNo.1的相似性在98%以上，即可判断所述 的待测组织为美丽库蠓。

美丽库蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结 果的可靠性。

所述引物根据文献合成，正向引物5’AATCATAAAGATATTGGAAC3’，反向引物5’ CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG3’。

本发明可用琼脂糖凝胶电泳检测方法检测扩增结果。

本发明的优点为：

1）本发明采用传统的形态学鉴定与分子分类方法相结合，对所述库蠓进行鉴定，可确 保物种鉴定的准确性和可靠性。

2）与传统的形态学鉴定方法相比，本发明建立的美丽库蠓分子鉴定方法可有效缩 短美丽库蠓的鉴定时间。

附图说明

图1为美丽库蠓COⅠ基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为阴性对 照，2-5均为美丽库蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为658bp的条带。M为DL2000的DNA marker。

图2为未知库蠓雌虫COⅠ基因PCR扩增结果电泳鉴定图。编号说明如下：泳道1为阴 性对照，2为未知库蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为658bp的条带。M为DL2000的DNA marker。

具体实施方式

实施例1美丽库蠓（Culicoidesbellulus）COⅠ基因序列的获取

1、美丽库蠓标本的获取

美丽库蠓为野外采集获得的标本，经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。标本制成玻片 后经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。标本制作前，挑取美丽库蠓胸部末端和腹部前 几节置于95%酒精中，供DNA提取。

2、DNA模板制备

采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取美丽库蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法 与技术导论[M].北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存备用。

3、引物合成

本实施例所用引物如下：

正向引物5’AATCATAAAGATATTGGAAC3’

反向引物5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG3’。

4、PCR扩增

本实施例的PCR反应体系如表1所示。

表1美丽库蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）

本实施例的反应程序如表2所示。

表2美丽库蠓COⅠ基因PCR反应程序

PCR产物于4℃保存备用。

5、PCR扩增产物检测

取5μLPCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35min）。溴乙锭染色，凝胶 成像系统检测，电泳图谱参见附图1。

6、基因序列测定

选取3-5个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物与PCR所 用引物相同），所得基因序列经校正拼接后即为美丽库蠓的CO基因序列—SEQIDNo.1。

实施例2未知库蠓的鉴定

1、标本的采集与保存

采用挥网法或灯诱法进行采集，采获的标本经冷冻处死后直接保存于95%酒精中。

2、DNA模板制备

在解剖镜或体视显微镜下，从采集到的蠓类标本中随机挑选出一只雌性库蠓，采用小 型昆虫微量DNA模板制备方法提取库蠓DNA（文礼章主编.昆虫学研究方法与技术导论[M]. 北京：科学出版社，2010.278-286），提取的DNA样品于-20℃保存备用，每份标本一个编号。

3、目的基因序列的获取

3.1引物合成

以获得的未知库蠓DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下：

正向引物5’AATCATAAAGATATTGGAAC3’

反向引物5’CCAAAAAATCAAAATAAATGTTG3’。

3.2PCR扩增

本实施例的PCR反应体系如表3所示。

表3未知库蠓COⅠ基因PCR反应体系（50uL体系）

成分 体积（uL） 模板 2 引物1 1 引物2 1 10×缓冲液 5 dNTPs 1 Taq DNA聚合酶 2.5 ddH₂O 37.5

本实施例的反应程序如表4所示。

表4未知库蠓COⅠ基因PCR反应程序

步骤 反应温度（℃） 时间 循环数 预变性 94 3 min — 变性 94 45 s 35 退火 48 45 s 35 延伸 72 60 s 35 延伸 72 7 min —

PCR产物于4℃保存备用。

3.3PCR扩增产物检测与基因序列测定

取5μLPCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳（130V电压，电泳35min）。溴化乙锭染色。凝 胶成像系统检测，电泳图谱参见附图2。由附图2看出实施例2的未知库蠓也能特异性扩增出 大小约为658bp的产物，将大小约为658bp的产物送生物公司测序，结果显示与基因序 列SEQIDNO.1的相似性为99.9%，因而可判定该未知库蠓为美丽库蠓。