黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法

摘要

本发明公开了一种黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法，Cyp24a1序列的全长为2180bp，编码506个氨基酸。黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式为C2602H4112N704O740S26，分子量大小为57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。对黄颡鱼Cyp24a1蛋白结构和功能预测分析,Cyp24a1蛋白没有信号肽序列，并且也没有跨膜结构域。在NCBI上比对黄颡鱼Cyp24a1蛋白发现与斑点叉尾鮰和斑马鱼的同源性分别达到94％和74％。Cyp24a1基因在肝脏中表达最高，在肌肉和肠中微量表达。本发明利用RACE技术填补了该基因在黄颡鱼上的空白，为进一步研究该基因在鱼类上的功能奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地指一种黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列 的方法。

背景技术

维生素D属于固醇类衍生物，具有抗佝偻病的作用，是动物必需的一种维生素。鱼 体不能合成维生素D而必须由食物供给。由于鱼体对维生素D₃的利用率高于维生素D₂，所以 维生素D₃是鱼体中维生素D的主要贮存形式。维生素D₃经鱼体的肠的吸收后，被乳糜微粒经 血液运送至肝脏。在肝脏中，维生素D₃在25位羟基化形成25-羟基维生素D₃[25(OH)D₃]。25 (OH)D₃随后在25-羟基维生素D₃-1α-羟化酶(CYP24A1)的催化下转变为具有生物活性的1α, 25-二羟维生素D₃[1α,25(OH)₂D₃]。

一些体内研究已经表明，维生素D₃最活跃的代谢物1α,25(OH)₂D₃可以减弱上皮细 胞的增殖作用、促进大肠癌细胞的分化和凋亡，并且还具有降低肿瘤浸润程度、抑制肿瘤细 胞转移和远处迁移等一系列的抗癌作用。Cyp24a1基因编码抑制维生素D₃代谢活化的酶25- 羟基维生素D₃-24-羟化酶(CYP24A1)，该酶能将1α,25(OH)₂D₃转换成失活形式的维生素D₃- 23-羧酸，减少1α,25(OH)₂D₃的生成，降低其发挥生物学功能。然而，Cyp24a1基因在鱼类上的 研究还较为缺乏。

发明内容

本发明的目的提供了一种黄颡鱼Cyp24a1基因及其获得全长序列的方法。黄颡鱼 Cyp24a1基因填补了该基因在黄颡鱼上的空白，为进一步研究黄颡鱼的该基因奠定了分子 基础。

为实现上述目的，本发明提供的一种黄颡鱼Cyp24a1蛋白，所述黄颡鱼Cyp24a1的 氨基酸序列为：

(1)由SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)与序列SEQIDNo.3限定的氨基酸序列同源性在90～100％编码相同功能蛋白 质的氨基酸序列；

(3)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中密码子的第三个碱基替换的一个或多个氨 基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

此外，应当理解，鉴于密码子兼并性及物种具有密码子偏好性的特点，本领域技术 人员，可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

进一步地，所述黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式为C₂₆₀₂H₄₁₁₂N₇₀₄O₇₄₀S₂₆，分子量大小为 57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。

编码蛋白的黄颡鱼Cyp24a1基因的开放阅读框ORF，所述开放阅读框ORF的序列为 SEQIDNo.1所示。

包含所述ORF的黄颡鱼Cyp24a1基因全长序列，其特征在于：所述的黄颡鱼Cyp24a1 基因全长序列为SEQIDNo.2所示。

获取黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列的方法，包括以下步骤：

1)肝脏组织总RNA的提取；

2)cDNA第一链的合成；

3)Cyp24a1核心片段的PCR扩增；

4)RACE-PCR扩增；

5)RACE片段的分离与回收；

6)连接和转化；

7)将阳性克隆菌液送出测序；

8)Cyp24a1的生物信息学分析；即得到黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列。

进一步地，具体包括以下步骤：

1)肝脏组织总RNA的提取

总RNA提取过程严格按照无菌操作的要求进行，具体包括以下步骤：

(1)从-80℃冰箱中取出100mg的肝脏组织，放入用高温灭菌处理过的研钵中，加入 液氮并磨成粉末；

(2)向2mL的离心管中加入1mL预冷的RNAisoPlus裂解液，然后迅速把组织粉末加 入到离心管中，剧烈震荡，使其充分溶解，室温静置5min；

(3)4℃条件下12000×g离心5min，小心吸取上清液，移入新的1.5mL离心管中；

(4)吸取0.2mL氯仿加入离心管中，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，混合至溶液 乳化呈白色，在室温静置5min；

(5)4℃条件下12000×g离心15min，吸取上清液并转移到新的1.5mL离心管中；

(6)向上清液中加入等体积的异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒离心管使其充分地 混匀，在室温静置10min；

(7)4℃条件下12000×g离心10min，在离心管底部可见胶状RNA沉淀；

(8)小心弃去上清，沿着离心管壁缓慢地加入75％的乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤 离心管管壁；

(9)4℃条件下7500×g离心5min后小心弃去上清；

(10)打开离心管盖，室温干燥沉淀3～5min，沉淀干燥后，加入适量的RNase-free 水溶解沉淀；

(11)用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余的总RNA放入-80℃冰箱 中保存；

2)cDNA第一链的合成

(1)在冰上配制DNA清除反应体系，如下：

(2)4℃条件下反应2min；

(3)在冰上配制反转录反应体系，如下：

(4)在PCR仪器上37℃15min，85℃5s，在-20℃冰箱中保存；

3)Cyp24a1核心片段的PCR扩增

根据转录组的数据设计引物对

Cyp24a1-F：CGAGGTGCTGAAGAAGAAGT；

Cyp24a1-R：CTGGCTCATAATCTGTTGCTAC；

PCR扩增的反应条件为：

95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5分钟；PCR产物连入 pMD19-T载体中，转化E.coliDH5α，涂布含氨卞青霉素的LB筛选平板，挑选若干个阳性克隆 进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，对PCR阳性克隆产物进行测序；

4)RACE-PCR扩增

4.1RACE引物设计

根据已获得Cyp24a1核心序列分别设计RACE的巣式引物；

5’RACE引物

Cyp24a1-GSP1：GGCACCACTTCTCTGATCTCCTT

Cyp24a1-NGSP1：CAGACTCTTGTGGAGACTTACTGGAG

3’RACE引物

Cyp24a1-GSP2：GGGCTCCTTGCTTGCTGGAGGCACTGT

Cyp24a1-NGSP2：GTGGTGCCTCCTGGACAGGATCCATGCG

4.2RACE-ReadycDNA准备

(1)在冰上分别配制5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液

(2)混匀试剂，瞬时离心，然后在PCR仪器孵育，反应条件为72℃3min，42℃2min，冷 却后用14000×g离心10s；

(3)在5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液中都加入下列试剂

(4)混匀试剂，瞬时离心；然后在PCR仪器中进行反转录反应，

反应条件为42℃90min，70℃10min终止反应，用TE缓冲液稀释第一链反应物，并 在-20℃中保存；

4.3RACE-PCR扩增

(1)RACE-PCR反应液的配制

(2)混匀试剂，瞬时离心；

按照如下条件进行“Touchdown”PCR：94℃3min；94℃30s，72℃3min，反应5个循环； 94℃30s，70℃30s，70℃3min，反应5个循环；94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应25个循环；最 后72℃延伸10min；

(3)用Tricine-EDTAbuffer稀释第一步PCR的反应液并作为模版，以3’/5’RACE Cyp24a1-NGSP和UPM为Short引物进行PCR反应；程序为94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应20 个循环；

5)3’/5’RACE片段的分离与回收

(1)切割含目的DNA片段的凝胶块时，要吸干胶上的水分，切胶尽可能的要小，放入 到1.5mL离心管中；

(2)称重离心管后，每100mg凝胶加入200μlBufferNT1；

(3)在50℃条件下，约5～10min溶解凝胶，每2min混匀一下，待凝胶完全溶解；

(4)将PCRClean-Up柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至Clean-Up柱中，11000× g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；

(5)在Clean-Up柱中加入700μlBufferNT3，11000×g离心30s，倒掉收集管中的 废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；

(6)11000×g离心1min，确保BufferNT3完全清除；

(7)将Clean-Up柱放入新的离心管中，在Clean-Up柱子膜中央加20μlBufferNE， 室温静置1min，11000×g离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA目的片段；

6)连接和转化

6.1连接

(1)在200μl的离心管中依次加入下列试剂：

(2)混匀试剂，瞬时离心；在50℃条件下孵育15min，然后转移到冰上；

6.2转化

(1)取Stellar感受态细胞100μl，加入5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置；

(2)再加入预热的SOC培养基至1mL，37℃预表达1h；

(3)取100μl预表达的菌液放入1.5mL的离心管，在分别加入10μlIPTG和40μlX- gal，并混匀；

(4)将菌液均匀涂布在含氨卞青霉素的LB筛选平板上，37℃正面放置30min，带菌 液完全吸收培养基后，37℃倒置培养12～16h；

7)将阳性克隆菌液送出测序

(1)挑取白色单一菌落10个，分别接种于1mL含5μl氨苄SOC培养基，37℃230r/min 震荡培养4～6h；

(2)对这10个菌液进行菌液PCR鉴定；

(3)挑选若干个阳性克隆菌液500μl进行测序；

8)Cyp24a1的生物信息学分析；即得到黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列。

本发明的有益效果在于：

Cyp24a1序列的全长为2180bp，如SEQIDNo.2所示，包含了1521bp的开放阅读框， 47bp的5′非编码区和595bp的3′非编码区，编码506个氨基酸。黄颡鱼Cyp24a1蛋白的分子式 为C₂₆₀₂H₄₁₁₂N₇₀₄O₇₄₀S₂₆，分子量大小为57.93kDa，等电点为8.82，总平均疏水指数为-0.351。 对黄颡鱼Cyp24a1蛋白结构和功能预测分析，发现，Cyp24a1蛋白没有信号肽序列，并且也没 有跨膜结构域。在NCBI上比对黄颡鱼Cyp24a1蛋白发现与斑点叉尾鮰和斑马鱼的同源性分 别达到94％和74％。利用荧光定量PCR验证该基因在黄颡鱼组织中的表达情况，结果发现 Cyp24a1基因在肝脏中表达最高，在肌肉和肠中微量表达。本发明利用RACE技术填补了该基 因在黄颡鱼上的空白，为进一步研究该基因在鱼类上的功能奠定了基础。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

获取黄颡鱼Cyp24a1基因的全长序列的方法，包括以下步骤：

1、肝脏组织总RNA的提取

总RNA提取过程严格按照无菌操作的要求进行，具体包括以下步骤：

(1)从-80℃冰箱中取出约100mg左右的肝脏组织，放入用高温灭菌处理过的研钵 中，加入液氮并磨成粉末；

(2)向2mL的离心管中加入1mL预冷的RNAisoPlus裂解液，然后迅速把组织粉末加 入到离心管中，剧烈震荡，使其充分溶解，室温(15-30℃)静置5min；

(3)4℃条件下12000×g离心5min，小心吸取上清液，移入新的1.5mL离心管中(切 勿吸取沉淀)；

(4)吸取0.2mL氯仿加入离心管中，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，混合至溶液 乳化呈白色，在室温静置5min；

(5)4℃条件下12000×g离心15min，吸取上清液并转移到新的1.5mL离心管中；

(6)向上清液中加入等体积的异丙醇，盖紧离心管盖，上下颠倒离心管使其充分地 混匀，在室温静置10min；

(7)4℃条件下12000×g离心10min，在离心管底部可见胶状RNA沉淀；

(8)小心弃去上清(切勿触及沉淀)，沿着离心管壁缓慢地加入75％的乙醇1mL，轻 轻上下颠倒洗涤离心管管壁；

(9)4℃条件下7500×g离心5min后小心弃去上清(切勿触及沉淀)；

(10)打开离心管盖，室温干燥沉淀3-5min，沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水 溶解沉淀；

(11)用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，剩余的总RNA放入-80℃冰箱 中保存。

2、cDNA第一链的合成

(1)在冰上配制DNA清除反应体系，如下：

(2)4℃条件下反应2min；

(3)在冰上配制反转录反应体系，如下：

(4)在PCR仪器上37℃15min，85℃5s，在-20℃冰箱中保存。

3、Cyp24a1核心片段的PCR扩增

根据转录组的数据(AccessionNo.SSR2239572)设计引物

Cyp24a1-F：CGAGGTGCTGAAGAAGAAGT；

Cyp24a1-R：CTGGCTCATAATCTGTTGCTAC。

PCR扩增的反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5 分钟。PCR产物连入pMD19-T(大连宝生物工程公司，中国)载体中，转化E.coliDH5α(大连宝 生物工程公司，中国)，涂布含氨卞青霉素(上海生物工程有限公司，中国)的LB筛选平板，挑 选若干个阳性克隆进行PCR鉴定及进一步的测序鉴定，将PCR阳性克隆产物送到大连宝生物 工程公司测序。

4、RACE-PCR扩增

4.1RACE引物设计

根据已获得Cyp24a1核心序列分别设计RACE的巣式引物。

5’RACE引物

Cyp24a1-GSP1：GGCACCACTTCTCTGATCTCCTT

Cyp24a1-NGSP1：CAGACTCTTGTGGAGACTTACTGGAG

3’RACE引物

Cyp24a1-GSP2：GGGCTCCTTGCTTGCTGGAGGCACTGT

Cyp24a1-NGSP2：GTGGTGCCTCCTGGACAGGATCCATGCG

(在5’和3’RACE引物的5’段都加入一段“GATTACGCCAAGCTT”序列)

4.2RACE-ReadycDNA准备

(1)在冰上分别配制5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液

(2)混匀试剂，瞬时离心。然后在PCR仪器孵育，反应条件为72℃3min，42℃2min，冷 却后用14000×g离心10s；

(3)在5’-和3’-RACE-ReadycDNA反应液中都加入下列试剂

(4)混匀试剂，瞬时离心，然后在PCR仪器中进行反转录反应，

反应条件为42℃90min，70℃10min终止反应，用TE缓冲液稀释第一链反应物，并 在-20℃中保存；

4.3RACE-PCR扩增

(1)RACE-PCR反应液的配制

(2)混匀试剂，瞬时离心：按照如下条件进行“Touchdown”PCR：94℃3min；94℃30s， 72℃3min，反应5个循环；94℃30s，70℃30s，70℃3min，反应5个循环；94℃30s，68℃30s，70 ℃3min，反应25个循环，最后72℃延伸10min；

(3)用Tricine-EDTAbuffer稀释第一步PCR的反应液并作为模版，以3’/5’RACE Cyp24a1-NGSP和UPM为Short引物进行PCR反应；程序为94℃30s，68℃30s，70℃3min，反应20 个循环；

5)3’/5’RACE片段的分离与回收

(1)切割含目的DNA片段的凝胶块时，要吸干胶上的水分，切胶尽可能的要小(可以 提高DNA的回收率)，放入到1.5mL离心管(以称重)中；

(2)称重离心管后，每100mg凝胶加入200μlBufferNT1；

(3)在50℃条件下，约5-10min溶解凝胶，每2min混匀一下，待凝胶完全溶解；

(4)将PCRClean-Up柱装入2mL洗管，将上述混合液转移至Clean-Up柱中，11000× g离心30s，倒掉收集管中的废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；

(5)在Clean-Up柱中加入700μlBufferNT3，11000×g离心30s，倒掉收集管中的 废液，将Clean-Up柱放入同一收集管；

(6)11000×g离心1min，确保BufferNT3完全清除；

(7)将Clean-Up柱放入新的离心管中，在Clean-Up柱子膜中央加20μlBufferNE， 室温静置1min。11000×g离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA目的片段。

6、连接和转化

6.1连接

(1)在200μl的离心管中依次加入下列试剂：

(2)混匀试剂，瞬时离心；在50℃条件下孵育15min，然后转移到冰上。

6.2转化

(1)取Stellar感受态细胞100μl，加入5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置；

(2)再加入预热的SOC培养基至1mL，37℃预表达1h；

(3)取100μl预表达的菌液放入1.5mL的离心管，在分别加入10μlIPTG和40μlX- gal，并混匀。

(4)将菌液均匀涂布在含氨卞青霉素(上海生物工程有限公司，中国)的LB筛选平 板上，37℃正面放置30min，带菌液完全吸收培养基后，37℃倒置培养12-16h。

8、将阳性克隆菌液送出测序

(1)挑取白色单一菌落10个，分别接种于1mL含5μl氨苄SOC培养基，37℃230r/min 震荡培养4-6h；

(2)对这10个菌液进行菌液PCR鉴定；

(3)挑选若干个阳性克隆菌液大约500μl送到大连宝生物工程公司测序。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干具体实施例框架。显然，本 发明不限于以上实施例，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到 的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

9、Cyp24a1的生物信息学分析

利用在线软件ORFfinder分析获得的Cyp24a1基因的全长cDNA序列，找出编码框； ProtParam工具计算编码蛋白质的理论分子量、等电点、氨基酸组成；利用SingalP3.0在线 分析软件分析编码蛋白有无信号肤；ProtSCale在线分析软件分析编码蛋白的疏水性；利用 TMHMM服务器分析编码蛋白有无跨膜结构；BLAsTp软件以及FASTA软件用于同源蛋白的搜 索；利用CDD软件查询NCBI保守区的功能域数据库，查询有无保守功能域。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。