一种降胆固醇菌制剂及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种菌制剂，由植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum？subsp.plantarum)CICC？NO.6240I4和保护剂组成，保护剂可有效提高菌制剂冻干剂中植物乳杆菌的存活率。该菌制剂可降低胆固醇，经添加保护剂后的植物乳杆菌冻干剂降低胆固醇的效果，与未经冻干的植物乳杆菌活菌降低胆固醇的效果相当。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种菌制剂及其制备方法和应用。

背景技术

随着乳酸菌对人体健康有益作用机理的不断深入研究和揭示，乳酸菌产品越 来越受到消费者的重视。菌制剂以及经菌制剂发酵得到的发酵乳制品的关注度不 断得到提升，直投式菌制剂以及直投式酸奶发酵剂因其活力强、含菌量高、菌量 稳定，保存期长、耐储运，使用方便，发酵产品稳定等优点而成为了市场热点与 研发热点。作为提升发酵剂活力的关键工艺，冻干保护剂能有效防止细菌细胞死 亡，保证活菌量和延长菌种保藏期。

目前乳酸菌菌制剂可采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等不同的方法进行 制备，而其中真空冷冻干燥比较常用且有优势，其基本原理是热力学相平衡理论： 即将欲保藏的微生物细胞悬浮液冻结后，在真空条件下使冰升华，最后达到干燥。 该方法主要是根据微生物生理、生化特点，使微生物的代谢不活泼，生长繁殖受 到抑制，达到休眠状态，以保特菌株原有特性。

真空冷冻干燥过程中影响乳酸菌发酵剂菌体存活率、发酵活力及贮藏稳定性 的主要因素有:培养基、培养条件、收获期、起始细胞浓度、冻干保护剂介质、 冷冻速度、干燥过程、水分活度、包装方式、保藏温度和复水条件等,其中冻干 保护剂是最为关键的因素。由于不同的保护剂对不同菌种的保护效果不同,如果 冻干工艺中保护剂选择不当,将导致菌体的存活率下降。

直投式发酵剂是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接 加入热处理的原料进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其他预处理工作。

发明内容

本发明提供了一种菌制剂，由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp. plantarum)CICCNO.6240和保护剂组成。

本发明所述植物乳杆菌CICCNO.6240，属于植物乳杆菌植物亚种，拉丁文 名称为Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum，在本发明申请日前就是已知的生 物材料。

本发明所述植物乳杆菌CICCNO.6240保藏于位于北京市朝阳区酒仙桥中 路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenterofIndustrial CultureCollection,CICC)。此外，本发明所述的植物乳杆菌CICCNO.6240同 时还保藏于其他的生物材料保藏中心，包括：保藏于中国科学院微生物研究所， 保藏编号AS1.2437；保藏于日本微生物菌种保藏中心，保藏编号JCM1149；保 藏于美国模式培养物集存库，保藏编号ATCC14917；德国微生物菌种保藏中心， 保藏编号DSM20174；日本发酵研究所，保藏编号IFO15981。

本发明所述植物乳杆菌CICCNO.6240在本发明申请日前可以通过国内外 商业渠道购买，如可向中国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenterof IndustrialCultureCollection,CICC)购买该菌株；向美国模式培养物集存库 (Americantypeculturecollection，ATCC)等机构购买。

具体的，本发明提供了一种菌制剂，该菌制剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240和保护剂组成；

所述菌制剂的保护剂为海藻糖、谷氨酸钠、蔗糖和脱脂乳粉，以重量百分比 计，每克菌制剂含有海藻糖4～4.1％、谷氨酸钠2.9～3％、蔗糖10～10.5％、脱脂 乳粉14.5～15％；

所述菌制剂每克含有植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum) CICC6240的活菌数为8×10¹²cfu/g～8.1×10¹²cfu/g。

优选的，以重量百分比计，本发明菌制剂每克含有海藻糖4.04％、谷氨酸钠 2.9％、蔗糖10.38％、脱脂乳粉14.84％；每克菌制剂含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240的活菌数为8.08×10¹²cfu/g；

或者，优选的，以重量百分比计，本发明菌制剂每克含有海藻糖4.％、谷氨酸 钠3％、蔗糖10％、脱脂乳粉15％，其中每克菌制剂含有植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum)CICCNO.6240的活菌数为8.03×10¹²cfu/g。

本发明还提供落了上述优选菌制剂的制备方法，包括以下步骤：菌种活化， 扩大培养，离心收集菌体，加保护剂，分装，预冻，真空冷冻干燥，从而得到所 述发酵剂；其制备步骤还包括：对保护剂灭菌或除菌后，再加入菌体中。

具体的，上述优选菌制剂由以下步骤制备得到：

(1)取活化的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICC6240， 接种到10mL液体培养基中,37℃下静置培养18h,经两次扩大培养得种子培 养液；将种子培养液以4％的接种量接种增菌培养基中，37℃下静置培养18h；

(2)将菌液移入无菌离心管,以4000转/分钟的转速离心10min,弃上清液,用质 量体积浓度为0.9％的无菌生理盐水洗涤沉淀菌体后,以4000转/分钟的转速离 心10min,弃上清液，得乳酸菌菌泥；

(3)取海藻糖、蔗糖和谷氨酸钠，分别溶于蒸馏水，采用膜孔径为0.22μm的 滤菌器除菌，得海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液；取脱脂乳粉，溶于蒸馏 水，110℃下保温10分钟杀菌，得脱脂乳粉溶液；

(4)将步骤(2)制备得到的菌泥与步骤(3)制备的海藻糖溶液、蔗糖溶液、 谷氨酸钠溶液、脱脂乳粉溶液混合，混匀，得菌悬液；

(5)取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中,-70℃下预冻2h，在 冻干条件为真空度5Pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度-55℃的真空冻干机中 冻干,冻干时间30h，得冻干菌制剂。

本发明所述的菌制剂，优选为冻干剂，如冻干粉、冻干粉针等。

此外，本发明还提供了所述菌制剂作为直投式发酵剂的用途；可用途乳制品 等的发酵。

以及，本发明所述菌制剂用于制备降低胆固醇产品的用途；

同时，本发明还提供了使用所述菌制剂发酵得到的发酵产品，以及该发酵产 品制备降低胆固醇产品的用途；所述发酵产品包括发酵的乳制品。

本发明还提供了一种菌制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)取活化的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarum)CICCNO. 6240接种到10mL液体培养基中,37℃下静置培养18h,经两次扩大培养得种 子培养液；将种子培养液以4％的接种量接种增菌培养基中，37℃下静置培养 18h；

(2)将菌液移入无菌离心管,以4000转/分钟的转速离心10min,弃上清液,用质 量体积浓度为0.9％的无菌生理盐水洗涤沉淀菌体后,以4000转/分钟的转速离 心10min,弃上清液，得乳酸菌菌泥；

(3)制备保护剂溶液：分别称取海藻糖4.04g、蔗糖10.38g、谷氨酸钠2.9g，分 别在40℃下溶于10ml蒸馏水中，吸入5ml注射器，采用膜孔径为0.22μm的 滤菌器除菌，将10ml过滤除菌的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液，分别 注入90ml无菌水中，得到4.04％海藻糖溶液，2.9％谷氨酸钠溶液，10.38％蔗糖 溶液，备用；取脱脂乳粉14.84g，溶于100ml蒸馏水中，得14.84％脱脂乳粉溶 液，110℃灭菌，备用；

(4)取步骤(2)制备得到的菌泥与步骤(3)制备的海藻糖溶液、蔗糖溶液、 谷氨酸钠溶液、脱脂乳粉溶液，将1g菌泥与5ml海藻糖溶液、5ml蔗糖溶液、 5ml谷氨酸钠溶液和5ml脱脂乳粉溶液一起混合，搅拌均匀，得菌悬液；

(5)取步骤(4)制备的菌悬液分装入菌带塞的玻璃瓶中,-70℃下预冻2h，在 冻干条件为真空度5Pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度-55℃的真空冻干机中 冻干,冻干时间30h，得冻干菌制剂。其中，步骤(1)所述的接种量是指是指菌 液体积与培养基培养液的体积比。

本发明菌制剂，优选为冻干菌制剂，由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)CICCNO.6240和保护剂组成，所述保护剂组分包括海藻糖、 蔗糖、谷氨酸钠和脱脂乳粉。保护剂组成按照本发明特定比例配伍后，有效增强 了对植物乳杆菌CICCNO.6240的保护作用，较选用其他保护剂组方成分、或其 他配比比例，明显提高了植物乳杆菌CICCNO.6240的存活率和降低胆固醇的能 力。本发明保护剂组方对植物乳杆菌CICCNO.6240的保护作用，具有协同增效 的作用，有效提高了经冻干工艺所得冻干菌制剂的活菌存活率，并维持了冻干菌 制剂降胆固醇的活性，使植物乳杆菌CICCNO.6240冻干后降胆固醇的效果与植 物乳杆菌CICCNO.6240冻干前降低胆固醇的效果相当。

本发明提供了一种植物乳杆菌CICCNO.6240的专属冻干保护剂配方，该保 护剂配方各组分按本发明的特定比例配伍，协同增效的增强了对植物乳杆菌 CICCNO.6240存活率和活性的保护效力，有效避免了冻干过程对菌株存活率的 降低作用，使并维持了冻干菌制剂降胆固醇的活性，使植物乳杆菌冻干后降低胆 固醇的效果与冻干前降低胆固醇的效果相当，在提高冻干粉中菌株活性的同时大 大降低了发生产成本。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在 不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替 换或者变更。

以下以实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容在做进一步的详细 说明，但不应理解为下述实施例用于限定本发明的保护范围。

具体实施方法

1、本发明实验仪器和实验材料。

1.1实验仪器

UV-2600A型紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；自动台式 灭菌锅(山东新华医疗器械股份有限公司)；微孔过滤器及滤膜(0.22μm)；Heto Lyolab3000冻干机(上海汇分电子科技有限公司)

1.2实验材料

蔗糖(成都市科龙化工试剂厂)；海藻糖(河南豫兴生物科技有限公司)； 脱脂乳粉(郑州市伟丰生物科技有限公司)；谷氨酸钠(河南凯成化工产品有限 公司)；甘露醇(上海陆安生物科技有限公司)；菌种：植物乳杆菌CICCNO.6240， 保藏于位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏 管理中心(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection,CICC)。

实施例一、植物乳杆菌CICCNO.6240菌泥的制备

(1)菌体的富集培养

取植物乳杆菌CICCNO.6240菌粉，接种到10ml本领域常规的液体培养基 中活化,37℃下静置培养18h,经两次活化培养得种子培养液。将种子液以4％的 接种量接种到100ml增菌培养基中，37℃下静置培养18h。接种量指种子培养液 与培养基的体积比。

(2)菌体的收集

当发酵进行至对数期后期,将菌液移入无菌离心管中,,4000r/min离心10min, 弃上清液,用无菌0.9％生理盐水洗涤沉淀菌体,再以同样的条件离心10min, 弃上清液即得植物乳杆菌CICCNO.6240菌泥。

将菌泥/菌泥混悬液平均分为10份。

实施例二、冻干菌制剂的制备

(1)首先，配制保护剂各组分的溶液。按照表一记载的保护剂配方和比例， 分别取海藻糖、谷氨酸钠、蔗糖，甘露醇，以蒸馏水为溶剂制备溶液，采用膜孔 径为0.22μm的滤菌器除菌，分装在灭菌的带塞玻璃瓶中，经培养检验确认无 菌后冷藏备用，可根据需要进一步稀释；按照表一记载的保护剂配方和比例，取 脱脂乳粉，溶解于蒸馏水中，110℃下保温10min杀菌，备用。

例如，配制表一中保护剂配方编号6的各保护剂成分的特定浓度的溶液：分 别称取海藻糖4.04g、蔗糖10.38g、谷氨酸钠2.9g，分别在40℃下溶于10ml蒸 馏水中，吸入5ml注射器，采用膜孔径为0.22μm的滤菌器除菌，将10ml过滤 除菌的海藻糖溶液、蔗糖溶液、谷氨酸钠溶液，分别注入90ml无菌水中，得到 4.04％海藻糖溶液，2.9％谷氨酸钠溶液，10.38％蔗糖溶液，备用；取脱脂乳粉 14.84g，溶于蒸馏水中，得14.84％脱脂乳粉溶液100ml，110℃灭菌，备用。其 他编号的保护剂配方，在替换相应的投料量后，可参照类似方法配制溶液。

(2)配制菌悬液，制备冻干制剂。分别按照下表一保护剂配方中的组别编 号和保护剂具体组分及其浓度配制保护剂溶液，备用；分别取实施例一制备的菌 泥9份，按照菌泥质量与配方中各种保护剂溶液体积之比为1:5的比例，将菌泥 与各保护剂溶液混合，得菌悬液9份。例如，以表一中保护剂配方编号6制备菌 悬液，即按照保护剂配方6规定的保护剂浓度，按1g菌泥：(5ml海藻糖溶液 +5ml蔗糖溶液+5ml谷氨酸钠溶液+5ml脱脂乳粉溶液)的比例，将保护剂溶液 添加至菌泥中，混合混匀，配制需要的菌悬液。

分别从9份菌悬液中取5mL菌悬液分装入10mL无菌带塞的玻璃瓶中,放 在-70℃下预冻,2h后取出在真空冻干机中冻干,冻干条件为真空度5Pa、隔板 加热温度20℃、冷阱温度-55℃,冻干时间约30h，分别得冻干菌制剂9份。

添加保护剂配方1、保护剂配方2、保护剂配方3、保护剂配方4、保护剂配 方5、保护剂配方6、复方保护剂配方7、保护剂配方8、保护剂配方9后制备得 到的冻干剂，分别对应冻干菌制剂1、冻干菌制剂2、冻干菌制剂3、冻干菌制 剂4、冻干菌制剂5、冻干菌制剂6、冻干菌制剂7、冻干菌制剂8、冻干菌制剂 9。

表一：保护剂配方(浓度单位：w/v即质量体积浓度：g/ml)

以下为实验例：

实验例一菌泥活菌测定

取实施例一制备的菌泥1份，测定活菌含量。采用梯度稀释平板计数法,即 在无菌操作条件下,吸取充分混匀的样液0.5mL,加入灭菌生理盐水中,制成1∶10 的均匀稀释液,再依次进行10倍递增稀释,至1:10¹²。吸取0.5mL置于灭菌培养皿 中,再倒入45℃左右的MRS琼脂计数培养基约15mL,混匀。待其凝固后,于37℃ 恒温培养箱中倒置培养36h,用菌落计数器计数，得菌泥的活菌含量为9.7× 10¹²cfu/g。

实验例二

(1)冻干制剂活菌测定

取实施例二制备的冻干菌制剂1-9，分别用5mL灭菌的PBS缓冲液复水,然 后采用梯度稀释平板计数法,即在无菌操作条件下,吸取充分混匀的样液0.5mL,加 入灭菌生理盐水中,制成1∶10的均匀稀释液,再依次进行10倍递增稀释,至 1:1012。吸取0.5mL置于灭菌培养皿中,再倒入45℃左右的MRS琼脂计数培养基 约15mL,混匀。待其凝固后,于37℃恒温培养箱中倒置培养36h,用菌落计数器 计数。

(2)计算方法

其中，“冻干前1ml菌悬液的活菌数×菌悬液体积”，即1份菌悬液中的活 菌数，相当于添加保护剂之前的1份菌泥中的活菌数，与实验例一测定的1份菌 泥的活菌数相当。

(3)计算结果

实验数据显示，冻干菌制剂5、冻干菌制剂6具有最高的植物乳杆菌CICCNO. 6240存活率，较其他保护剂配方的冻干菌制剂，显著提高了植物乳杆菌CICCNO. 6240的存活率。

实验例二、菌制剂降胆固醇能力测试

(1)冻干后菌制剂降胆固醇能力的测定

分别将实施例二制备的冻干菌制剂菌粉，以0.5％的接种量(w:v)接种于胆固 醇培养基中，37℃静置培养48h，以未接种的培养基为空白对照。将培养液漩涡 振荡摇匀，吸取0.5ml菌悬液和4.5ml无水乙醇加入离心管中。静置提取10min 后，3000r离心15min。取上清液0.5ml加入洁净试管中，再加入1mg/ml邻苯二 甲醛液0.2ml、混合酸(1:1浓硫酸、冰乙酸)4.3ml，制成实验组，对照组用无 水乙醇代替离心后的上清液，振荡摇匀。静置反应30min后，在波长550nm处 测定吸光度，计算其胆固醇降解率。

胆固醇降解率(％)＝(C-A)/C*100

式中：A为实验菌株培养后的培养液550nm处OD值对应的胆固醇浓度；C 为空白对照的OD值对应的胆固醇浓度；重复试验3次求平均值。

(2)菌泥降胆固醇能力的测定

将实施例一制备的菌泥(即未经冻干的菌泥)以0.5％的接种量接种于胆固 醇培养基中，37℃静置培养48h，以未接种的培养基为空白对照。将培养液漩涡 振荡摇匀，吸取0.5ml菌悬液和4.5ml无水乙醇加入离心管中。静置提取10min 后，3000r离心15min。取上清液0.5ml加入洁净试管中，再加入1mg/ml邻苯二 甲醛液0.2ml、混合酸(1:1浓硫酸、冰乙酸)4.3ml，制成实验组，对照组用无 水乙醇代替离心后的上清液，振荡摇匀。静置反应30min后，在波长550nm处 测定吸光度，计算其胆固醇降解率。

胆固醇降解率(％)＝(C-A)/C*100

式中：A为实验菌株培养后的培养液550nm处OD值对应的胆固醇浓度；C 为空白对照的OD值对应的胆固醇浓度；重复试验3次求平均值。

(3)实验结果

经本发明优选的保护剂配方得到的冻干菌制剂5、冻干菌制剂6，其胆固醇 降解率分别为35.8±1.32、36.2±1.75(％，n＝3)，与未冻干的菌泥37.3±1.50(％， n＝3)的胆固醇降解率相当，没有显著差异，表明本发明优选的保护剂配方得到的 冻干菌制剂胆固醇降解率没有明显变化，冻干对植物乳杆菌I4的降胆固醇能力 没有明显影响。

而其他冻干菌制剂与未冻干的菌泥的降胆固醇能力相比，降胆固醇的能力具 有显著差异，即降低胆固醇的能力显著降低。

以下为显著性检验分析数据：

单一样本统计资料

单一样本检定

使用spss软件，对上述降低胆固醇的实验效果进行单样本T检验。数据分 析显示，仅冻干菌制剂第5号和冻干菌制剂第6号的p值＞0.05，表明冻干菌制 剂第5号和冻干菌制剂第6号与未冻干菌泥降胆固醇效果的差异不显著。其余各 组冻干菌制剂的p值均＜0.05，表明与未冻干菌泥降胆固醇效果的差异显著。