一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为KC1-D蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。编码所述KC1-D蛋白的基因(KC1-D基因)也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述KC1-D基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物满足如下(d1)至(d3)中的至少一种表型：(d1)钾离子吸收能力高于所述目的植物；(d2)钾离子吸收速率高于所述目的植物；(d3)对低钾环境的耐逆性高于所述目的植物。本发明在作物分子改良中具有较大应用价值，对于培育耐受低钾胁迫的作物具有重要的理论意义和实践意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用。

背景技术

钾是植物细胞中最丰富的阳离子之一，也是植物生长所必需的三大营养元素之 一。钾在植物活细胞的诸多方面，如渗透势调节、电荷平衡、糖类转运、蛋白质合成以及细胞 中多种酶活力的调控方面，都起到了不可替代的作用。钾在植物生长发育中发挥着重要作 用，它参与了植物的诸多生理、生化代谢过程，对植物的正常生长发育及产量获得等具有重 要影响。

我国作为农业大国，大部分耕地土壤呈现缺钾态势。然而我国钾矿储量低，钾肥严 重匮乏，大约一半以上依赖进口。因而钾肥资源的匮乏已成为限制我国农业生产发展的重 要因素之一。尽管提高钾肥施用量可以大幅度地提高作物产量，但大量进口钾肥无论从经 济上还是从长远的战略意义上考虑，都有一定的局限性。因此，了解和认识植物对低钾胁迫 的反应机制，挖掘能够提高农作物耐低钾能力的关键基因或优良等位变异，已成为提高农 作物钾营养利用效率和粮食产量的重要研究工作。

针对我国土壤缺钾且钾肥资源极其匮乏这一问题，克隆植物耐低钾基因并对其功 能进行研究，进而通过基因工程、同源基因等位变异、作物分子改良等方法获得钾营养高效 的品种，对于培育耐低钾植物/作物品种有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种钾离子通道蛋白KC1-D及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，获自拟南芥，命名为KC1-D蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与植物对低钾环境的耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的KC1-D蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸 序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述(b)中的KC1-D蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。上述(b)中的KC1-D蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个 或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/ 或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述KC1-D蛋白的基因(KC1-D基因)也属于本发明的保护范围。

所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物对低钾环境的耐逆性相关 蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物对低钾环境的耐逆 性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂 交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有所述KC1-D基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发 明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有KC1-D基因的重组表达载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用KC1-D基因构建重组表达载 体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动 子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用KC1-D基因构建重组表达 载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始 密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正 确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成 的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物 进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化 的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基 因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在Super1300载体的多克隆位点插入所述KC1-D基因 得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为将Super1300载体XbaⅠ和SacⅠ之间的小片 段取代为序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护所述KC1-D蛋白的应用，为如下(c1)至(c6)中的至少一种：

(c1)调控植物的钾离子吸收能力；

(c2)促进植物的钾离子吸收能力增加；

(c3)调控植物的钾离子吸收速率；

(c4)促进植物的钾离子吸收增加；

(c5)调控植物对低钾环境的耐逆性；

(c6)增加植物对低钾环境的耐逆性。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如kc1 突变株拟南芥。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述KC1-D基因导入目的植物中， 得到转基因植物；所述转基因植物满足如下(d1)至(d3)中的至少一种表型：

(d1)钾离子吸收能力高于所述目的植物；

(d2)钾离子吸收速率高于所述目的植物；

(d3)对低钾环境的耐逆性高于所述目的植物。

携带有所述KC1-D基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直 接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。

所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例 如kc1突变株拟南芥。

本发明还保护所述KC1-D蛋白、所述KC1-D基因、所述重组表达载体、所述表达盒、 所述转基因细胞系、所述重组菌或以上任一所述方法在植物育种中的应用。

所述育种的目的为培育钾离子吸收能力高和/或钾离子吸收速率高和/或对低钾 环境的耐逆性高的植物。

所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，例如kc1 突变株拟南芥。

以上任一所述低钾具体可为钾浓度为100μM。

本发明中，通过试验证实了将KC1-D基因在目的植物中表达后，可以增加植物对低 钾环境的耐受能力，增加植物对钾离子的吸收能力和吸收速度。本发明对培育耐低钾新品 种，以及植物对低钾耐受的研究具有重要意义。本发明在作物分子改良中具有较大应用价 值，对于培育耐受低钾胁迫的作物具有重要的理论意义和实践意义。

附图说明

图1为表型观察的照片。

图2为钾离子含量检测的结果。

图3为钾离子吸收速率检测的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。

Super1300载体：购自上海北诺生物科技有限公司，货号为addgene0595。

农杆菌菌株GV3101：CloughSJ,BentAF(1998)Floraldip:asimplified methodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsis thaliana.PlantJ.16:735-743。

哥伦比亚生态型拟南芥，用Col表示。

从ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)购买编号为SALK_140579的 T-DNA插入突变体(插入位置位于KC1基因中)，将其命名为kc1突变株拟南芥。经测序，kc1突 变株拟南芥为纯合突变株，T-DNA取代了序列表的序列4第1505至1529位核苷酸之间的小片 段，从而敲除了KC1基因全长的表达。

MS液体培养基(pH5.8)：每升含1650mgNH₄NO₃，1900mgKNO₃，370mgMgSO₄·7H₂O， 170mgKH₂PO₄，440mgCaCl₂·2H₂O，22.3mgMnSO₄·4H₂O，0.83mgKI，0.025mgCuSO₄·5H₂O， 6.25mgH₃BO₅，0.025mgCoCl·6H₂O，8.65mgZnSO₄·7H₂O，0.25mgNa₂MoO₄·2H₂O，27.8mg FeSO₄·7H₂O和37.3mgNa₂-EDTA，用电阻大于18MΩ的双蒸水定容至1L。MS培养基中钾浓度 为20.7mM。MS固体培养基：在MS液体培养基的基础上，每升加入30g蔗糖、9g琼脂粉。

LK液体培养基(pH5.8)：每升含2300mg/LNH₄NO₃，370mg/LMgSO₄·7H₂O，144mg/L NH₄H₂PO₄，440mg/LCaCl₂·2H₂O，22.3mgMnSO₄·4H₂O，0.83mgKI，0.025mgCuSO₄·5H₂O， 6.25mgH₃BO₅，0.025mgCoCl·6H₂O，8.65mgZnSO₄·7H₂O，0.25mgNa₂MoO₄·2H₂O，27.8mg FeSO₄·7H₂O和37.3mgNa₂-EDTA，用电阻大于18MΩ的双蒸水定容至1L。LK培养基中钾浓度 为100μM。LK固体培养基：在LK液体培养基的基础上，每升加入30g蔗糖、9g琼脂粉。

1/4MS液体培养基：各个溶质的含量均为MS液体培养基的四分之一。

1/4LK液体培养基：各个溶质的含量均为LK液体培养基的四分之一。

LK1培养基：KCl的浓度为250μM，其它溶质的含量均为LK液体培养基的四分之一。

实施例1、KC1-D蛋白及其编码基因的获得

通过对EMS随机诱变的数十万株哥伦比亚生态型拟南芥幼苗进行低钾胁迫筛选， 获得的具有耐低钾性状的突变体。经测序发现，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，该突变体在 某一开放阅读框中发生了一个SNP突变(由G突变为A)。突变体中的相应开放阅读框如序列 表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的蛋白质。哥伦比亚生态型拟南芥中的相应开放 阅读框如序列表的序列4所示，编码序列表的序列3所示的蛋白质。

与序列3相比，序列1的差异仅在于将序列3中的第322位氨基酸残基由甘氨酸突变 为了天冬氨酸。与序列4相比，序列2的差异仅在于将序列4中的第965位核苷酸由G突变为了 A。

将序列表的序列1所示的蛋白质命名为KC1-D蛋白。将编码KC1-D蛋白的基因命名 为KC1-D基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。

将序列表的序列3所示的蛋白质命名为KC1蛋白。将编码KC1蛋白的基因命名为KC1 基因，其开放阅读框如序列表的序列4所示。

实施例2、KC1-D蛋白的功能验证

一、构建重组质粒

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1得到的双链DNA分子为模板，采用Primer1和Primer2组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，回收约2000bp的DNA片段。

Primer1：5'-GCTCTAGAATGTCTACGACGACTACTGAGG-3'；

Primer2：5'-TCGAGCTCTTAGAAAATATATAAATGATCGTT-3'。

3、用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切步骤2得到的DNA片段，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切Super1300载体，回收约10000bp左右的载体 骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果， 对重组质粒甲进行结构描述如下：将Super1300载体XbaⅠ和SacⅠ之间的小片段取代为了序 列表的序列2所示的双链DNA分子。

6、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。

7、以步骤6得到的双链DNA分子为模板，采用Primer1和Primer2组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，回收约2000bp的DNA片段。

8、用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切步骤7得到的DNA片段，回收酶切产物。

9、将步骤8的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果， 对重组质粒乙进行结构描述如下：将Super1300载体XbaⅠ和SacⅠ之间的小片段取代为了序 列表的序列4所示的双链DNA分子。

二、培育转基因植物

1、将重组质粒甲导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。

2、采用花芽浸泡法(CloughandBent,Floraldip:asimplifiedmethodfor Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.Plant Journal1998,16:735-743.)，用步骤1得到的重组农杆菌侵染kc1突变株拟南芥，收获T₁代 种子。T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及 由它所长成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固体培养基平板上筛选T₁代植株并进行T₂代和 T₃代的分离比统计，在T₃代得到转KC1-D基因拟南芥单拷贝纯合株系，随机取两个株系，命名 为株系1和株系2。

3、将重组质粒乙导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。

4、采用花芽浸泡法(CloughandBent,Floraldip:asimplifiedmethodfor Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.Plant Journal1998,16:735-743.)，用步骤3得到的重组农杆菌侵染kc1突变株拟南芥，收获T₁代 种子。T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及 由它所长成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固体培养基平板上筛选T₁代植株并进行T₂代和 T₃代的分离比统计，在T₃代得到转KC1基因拟南芥单拷贝纯合株系，随机取两个株系，命名为 株系3和株系4。

三、表型检测

待测植物分别为：株系1的T₃代植株、株系2的T₃代植株、株系3的T₃代植株、株系4的 T₃代植株、kc1突变株拟南芥、哥伦比亚生态型拟南芥。

1、表型观察

(1)将待测植物的种子播种于MS固体培养基，培养4天。

(2)完成步骤(1)后，将幼苗分成两组，分别移苗至MS固体培养基和LK固体培养基， 培养12天后拍照。

培养条件：22℃、24小时光照(光强60μmol/m²/s)。

每种待测植物进行三次重复试验，每次重复试验中每个待测植物取200粒种子。

部分照片见图1。在MS固体培养基中培养，各个待测植株的表型基本一致，没有显 著差异。在LK固体培养基中培养，kc1突变株拟南芥、哥伦比亚生态型拟南芥冠部均开始表 现出发黄的缺钾症状，株系3和株系4的表型与kc1突变株拟南芥一致(冠部均开始表现出发 黄的缺钾症状)，株系1的冠部仍保能保持绿色，株系2的表型与株系1一致(冠部仍保能保持 绿色)。结果表明，导入KC1-D基因可以增加植物对低钾环境的耐逆性。

2、钾离子含量检测

(1)将待测植物的种子播种于MS固体培养基，培养4天。

(2)完成步骤(1)后，将幼苗分成两组，分别移苗至MS固体培养基和LK固体培养基， 培养10天，然后分地上部分(冠))和地下部分(根)取样。

(3)取步骤(2)得到的样品，用超纯水冲洗，然后在80℃烘箱中烘至恒重(称干重)， 然后在马弗炉进行灰化处理(300℃炭化1h、575℃灰化5h)。

(4)取步骤(3)的产物，用10mL0.1MHCl水溶液溶解，室温放置2h后进行稀释，稀 释液中的钾浓度位于30-200μM区间。

(5)通过安捷伦4100微波等离子体原子发射光谱仪测定步骤(4)得到的稀释液中 的钾离子浓度，计算单位干重中的钾含量。

培养条件：22℃、24小时光照(光强60μmol/m²/s)。

每种待测植物进行三次重复试验，每次重复试验中每个待测植物取2000粒种子， 结果取平均值。

部分结果见图2。在MS固体培养基中，株系1的根部的钾离子含量显著高于kc1突变 株拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥，株系1和株系2根部的钾离子含量没有显著差异，株系 3、株系4和kc1突变株拟南芥根部的钾离子含量没有显著差异。在MS固体培养基中，株系1的 冠部的钾离子含量显著高于kc1突变株拟南芥和哥伦比亚生态型拟南芥，株系1和株系2冠 部的钾离子含量没有显著差异，株系3、株系4和kc1突变株拟南芥冠部的钾离子含量没有显 著差异。在LK固体培养基中，株系1的冠部的钾离子含量显著高于kc1突变株拟南芥和哥伦 比亚生态型拟南芥，株系1和株系2冠部的钾离子含量没有显著差异，株系3、株系4和kc1突 变株拟南芥冠部的钾离子含量没有显著差异。

3、钾离子吸收速度检测

(1)将待测植物的种子播种于MS固体培养基，培养5天。

(2)完成步骤(1)后，将幼苗转移至1/4MS液体培养基中，培养12小时。

(3)完成步骤(2)后，将幼苗转移至1/4LK液体培养基中，培养4天(每隔12小时更换 新的1/4LK液体培养基)。

(4)完成步骤(3)后，将幼苗转移至LK1培养基中，培养，间隔时间取LK1培养基，检 测其中的钾离子浓度。

部分结果见图3。培养株系1的LK1培养基中的钾离子浓度显著低于培养kc1突变株 拟南芥的LK1培养基中的钾离子浓度，培养株系1的LK1培养基中的钾离子浓度与培养株系2 的LK1培养基中的钾离子浓度没有显著差异，培养株系3的LK1培养基中的钾离子浓度和培 养株系4的LK1培养基中的钾离子浓度均与培养kc1突变株拟南芥的LK1培养基中的钾离子 浓度没有显著差异。结果表明，导入KC1-D基因可以增加植物吸收钾离子的速度。