一种丹酚酸A的提取分离纯化方法及丹酚酸A盐的制备方法

摘要

本发明涉及一种丹酚酸A的提取分离纯化方法及丹酚酸A盐的制备方法，所述丹酚酸A的提取分离纯化方法包括以白花丹参或丹参为原料经溶剂提取、溶剂萃取、浓缩干燥、分离纯化、MCI柱分离、结晶与重结晶步骤，得丹酚酸A。本发明与大孔吸附树脂柱相比，采用聚酰胺柱色谱法可以更有效的纯化酚酸类成分，纯化效果更好；采用丹酚酸A镁盐络合法，可以省去大孔吸附树脂、或聚酰胺柱色谱的层析过程，纯化方法更简单和省时，成本更低。丹酚酸A镁盐的制备方法简单，更适合于大生产；丹酚酸A铵盐是一种新的丹酚酸A盐类化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物有效成分丹酚酸A的提取分离纯化方法及其盐的制备方法， 属于医药技术领域。

背景技术

丹参是最常用的药材之一，用于治疗心绞痛、高血压、冠心病和中风等心脑血管疾 病。白花丹参(SalviamiltiorrhizaBungevaralba)是唇形科植物丹参的变型，主要分 布在山东省境内，在当地常作丹参使用。研究表明，白花丹参不但与丹参的化学成分基本相 同，其中丹酚酸类成分均以丹酚酸B为主，丹酚酸A的含量都很少。

杜冠华等人对丹酚酸A的活性进行了大量的研究，发现丹酚酸A对大鼠离体心肌缺 血再灌注损伤有明显的保护作用，参见杜冠华,裘月,张均田.丹酚酸A对大鼠心肌缺血再灌 注性损伤的保护作用[J].药学学报,1995,10:731-735。对小鼠脑缺血再灌注引起的脑损伤 有保护作用，参见DuGuanhua,ZhangJuntian.Protectiveeffectofsalvianolicacid Aagainstimpairmentofmemoryinducedbycerebralischemia-reperfusionin mice.ChineseMedicalJournal,1997,110,(1):65-68。还有研究发现，丹酚酸A对异丙肾 上腺素诱导的心肌梗塞大鼠的心肌具有保护作用，参见Lian-huaFANG,Zi-ranNIU,Tian- yiYUAN,LiLi,Yue-huaWang,Guan-huaDU.Protectiveeffectofsalvianolicacid Aagainstisoproterenol-inducedmyocardialinfarctioninmice[J].中国药理学与 毒理学杂志,2015,S1:31。丹酚酸A还具抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集和抗血栓形成等作 用。参见ZhangXC,ChenJQ,LiB,etal.SalvianolicAcidASuppressesCCL-20 ExpressioninTNF-a-treatedMacrophagesandApoE-deficientMice.JCardiovasc Pharmacol,2014,64(4):318-325.FanHY,FuFH,YangMY,etal.Antiplateletand antithromboticactivitiesofsalvianolicacidA.ThrombRes,2010,126(1):17- e22。

中国专利文件CN1384090A公开了从中药丹参中提取丹参总酚酸的方法及其制剂 的制备方法,以及利用本发明方法得到的丹参总酚酸及其制剂在制备防治心脑血管疾病、 防治老年痴呆症及治疗脑缺血引起的学习记忆力下降等药物中的应用；但是，该工艺增加 醇沉使酚酸类损失30％。中国专利文件CN1513848A公开了一种用于肝损伤、肝纤维化等疾 病的防治从中药丹参酚酸各组分的提取方法及其冻干粉针剂；该方法采用水温浸、离心、超 滤、调酸、有机溶剂萃取再经反相柱层析制备丹酚酸A，使用反相硅胶纯化，对被纯化样品要 求极高，反相硅胶的成本也很高，丹酚酸A在药材中含量低，甚至没有，因此丹酚酸A产率低， 生产成本高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种对丹酚酸A高含量药材中丹酚酸A的提取分 离与纯化工艺及丹酚酸A盐的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种丹酚酸A的提纯分离纯化方法，包括以白花丹参或丹参为原料经溶剂提取、溶 剂萃取、浓缩干燥、分离纯化、MCI柱分离、结晶与重结晶步骤，得丹酚酸A；

所述的溶剂提取步骤为：以70wt％-90wt％的乙醇溶液为提取溶剂进行提取，所用 溶剂体积量与白花丹参或丹参原料的重量比为(8～12):1(v/w)，重复提取次数2-4次，超声 加热至30℃-70℃，加热30-50分钟，除去药渣，合并滤液。

根据本发明，溶剂提取步骤中，所述乙醇溶液浓度优选75wt％；

所用溶剂体积量与白花丹参或丹参原料的重量比优选12:1；

所述反应温度优选30℃；

所述超声时间优选40分钟；

所述重复提取次数优选3次。

根据本发明，优选的，溶剂萃取步骤为：将溶剂提取步骤所得滤液，减压浓缩至无 乙醇，加水稀释，加水量为稀释前浓缩液重量的2倍，再以有机溶剂萃取脱脂，弃去有机层， 以2.5N盐酸调pH＝1～2，再以有机溶剂第二次萃取，得含丹酚酸A的有机层；

所述萃取脱脂用的有机溶剂为石油醚、二氯甲烷或氯仿，优选为二氯甲烷；

所述第二次萃取用的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸丁酯，优选的为乙酸 乙酯。

根据本发明，优选的，浓缩干燥步骤为：将含丹酚酸A的有机层，采用减压浓缩或者 常压浓缩，干燥采用冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥，得丹酚酸A粗品粉末；

进一步优选的，浓缩采用减压浓缩，干燥采用冷冻干燥。

根据本发明，优选的，分离与纯化步骤为：采用聚酰胺柱色谱分离纯化或镁盐络合 分离纯化；

所述的聚酰胺柱色谱分离纯化步骤为：将浓缩干燥得到丹酚酸A粗品粉末，用水或 者10wt-20wt％乙醇溶液溶解后，配成7g/L～20g/L的样品溶液，直接加到聚酰胺柱的顶端， 使其缓慢流过聚酰胺柱，然后以水或者10wt-20wt％乙醇洗脱至流出液遇三氯化铁阴性反 应；先用15wt％-25wt％乙醇溶液第一次洗脱，再以40wt％-50wt％乙醇溶液第二次洗脱，洗 脱液减压浓缩至无乙醇，浓缩干燥，得纯化的丹酚酸A粉末；

所述的镁盐络合分离纯化步骤为：(1)分别取MgCl₂和NaHCO₃，溶于蒸馏水中，制备 以Mg(HCO₃)₂计其浓度为1wt～10wt％混合溶液；(2)取浓缩干燥得到的丹酚酸A粗品粉末，加 入步骤(1)所制得混合溶液中，溶解完全，用混合溶液等体积量的二氯甲烷萃取2次，弃去二 氯甲烷层，所得水层以2.5N盐酸调pH＝1～2后以等水层体积量的乙酸乙酯进行萃取3次，乙 酸乙酯层萃取液减压浓缩，干燥，得纯化的丹酚酸A样品。

根据本发明，镁盐络合分离纯化步骤中，步骤(1)中所述MgCl₂与NaHCO₃的摩尔比优 选为1:2，所述的混合溶液以Mg(HCO₃)₂计浓度优选为3wt～5wt％。

根据本发明，聚酰胺柱色谱分离纯化步骤中，所述聚酰胺树脂柱径高比优选为1: 4；

所述溶解丹酚酸A粗品粉末的溶剂优选为10wt％乙醇溶液；

所述丹酚酸A粗品溶液的质量浓度优选为10～12g/L；

所述聚酰胺树脂柱的上样量优选为每克聚酰胺树脂上样1.6g-1.7g丹酚酸A粗品 粉末，吸附的丹酚酸A量为60mg-70mg；

所述聚酰胺树脂柱的上样体积优选为每克聚酰胺树脂上样150ml；

所述第二次洗脱聚酰胺柱的乙醇溶液浓度优选为50wt％，洗脱体积优选为10个保 留体积。

根据本发明，优选的，MCI柱分离步骤为：将分离与纯化步骤所得丹酚酸A样品，采 用MCI柱色谱法分离，干法上样，以20％～100％(v/v)甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓 缩，得纯度更高的丹酚酸A。

根据本发明，优选的，MCI柱分离步骤中，先采用20％～30％(v/v)甲醇洗脱MCI柱 除杂质，再用40％～50％(v/v)甲醇洗脱MCI柱，收集洗脱液。

根据本发明，优选的，结晶与重结晶步骤为：将MCI柱分离所得丹酚酸A以二氯甲 烷-甲醇混合溶剂进行结晶和重结晶，过滤结晶；再以同样方法进行重结晶，过滤结晶，即得 高纯度的丹酚酸A，纯度大于90％。

根据本发明，优选的，结晶与重结晶步骤中，所述的二氯甲烷-甲醇混合溶剂为1:9 ～9:1(v/v)，进一步优选为3:7～4:6(v/v)。

根据本发明，优选的，原料白花丹参或丹参可参考中国专利文件CN102793745A(申 请号：201210334295.7)公开的方法进行预处理。

本发明的丹酚酸A提取纯化方法，采用溶剂提取、溶剂萃取、浓缩干燥、分离纯化、 MCI柱分离、结晶与重结晶步骤，达到分离纯化丹酚酸A的目的。该方法最终提取物丹酚酸A 的纯度高达90％以上，性能稳定，工艺简单，生产成本低。

根据本发明，一种丹酚酸A铵的制备方法，步骤如下：

上述制备的高纯度丹酚酸A粉末，加入50％浓度的乙醇，滴入pH＝10浓氨溶液，将 溶液pH调至6.5～7.4，在55℃条件下减压蒸干，即得丹酚酸A铵盐。此过程中溶液颜色没有 显著性变化，依然呈淡黄色。

根据本发明丹酚酸A铵的制备方法，优选的，所述的pH值优选为pH＝6.8；

所述的50％浓度的乙醇用量为丹酚酸A(毫克数):50％浓度的乙醇(毫升数)＝1: (1～5)(w/v)，优选的为1:(3～4)。

根据本发明，一种丹酚酸A镁盐的制备方法，步骤如下：

取MgCl₂溶于蒸馏水，配制成浓度为0.1wt％～5wt％的溶液，加入上述制备的高纯 度丹酚酸A粉末，室温下搅拌，然后滴加0.1wt％～5wt％NaHCO₃或KHCO₃的蒸馏水溶液，滴加 完毕后，继续搅拌2～5分钟，然后冷冻干燥，即得含有氯化钠(或氯化钾)的丹酚酸A镁盐络 合物粉末。

根据本发明丹酚酸A镁盐的制备方法，优选的，丹酚酸A与MgCl₂量的摩尔数比为2: 1；

所述MgCl₂与NaHCO₃或KHCO₃摩尔比优选为1:2；

所述的MgCl₂、NaHCO₃或KHCO₃溶液浓度优选为0.1wt～5wt％。

本发明的有益效果：

本发明提供了丹酚酸A的提取分离与纯化工艺，与大孔吸附树脂柱相比，采用聚酰 胺柱色谱法可以更有效的纯化酚酸类成分，纯化效果更好；采用丹酚酸A镁盐络合法，可以 省去大孔吸附树脂、或聚酰胺柱色谱的层析过程，纯化方法更简单和省时，成本更低。丹酚 酸A镁盐的制备方法简单，更适合于大生产；丹酚酸A铵盐是一种新的丹酚酸A盐类化合物。 因此，本发明为丹酚酸A的制备提供了一种简单易行的方法，有利于丹酚酸A开发和应用。

附图说明

图1是实施例1参考中国专利文件CN102793745A(申请号：201210334295.7)公开的 方法进行预处理后白花丹参的HPLC图；

图2、图3和图5分别是实施例1中提取所得丹酚酸A粗品、聚酰胺树脂纯化后丹酚酸 A、MCI树脂柱纯化后丹酚酸A的HPLC图；

图4是实施例2中丹酚酸A镁盐络合法纯化后丹酚酸A样品的HPLC图；

图6是对比例1中不同浓度乙醇为提取溶剂的提取结果曲线。

图7是对比例2中不同浓度的乙醇洗脱聚酰胺树脂柱的洗脱曲线。

图8是对比例3中40％乙醇洗脱聚酰胺柱的洗脱曲线。

图9是对比例3中50％乙醇洗脱聚酰胺柱的洗脱曲线。

图10为实施例5中丹酚酸A铵盐的¹H-NMR图谱。

图11为实施例5中丹酚酸A铵盐的¹³C-NMR图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例1

一种丹酚酸A的提纯分离纯化方法，步骤如下：

将白花丹参参考中国专利文件CN102793745A(申请号：201210334295.7)公开的方 法进行预处理；处理后白花丹参的HPLC图如图1所示。

(1)溶剂提取：以处理过的白花丹参为原料，取500g，加入12倍量75wt％的乙醇溶 液为提取溶剂进行超声提取，超声温度为30℃，提取次数3次，每次30分钟，除去药渣，合并 滤液。

(2)溶剂萃取：将上述滤液，减压浓缩至无乙醇，加水稀释，加水量为浓缩液重量的 2倍，再以等体积二氯甲烷萃取2次脱脂，弃去二氯甲烷层，以2.5N盐酸调pH＝1-2，再以等体 积乙酸乙酯萃取3次，至乙酸乙酯层呈淡黄色，合并乙酸乙酯层。

(3)浓缩干燥：将步骤(2)中的乙酸乙酯层，减压浓缩至无乙酸乙酯味，冷冻干燥得 丹酚酸A样品粗品粉末。其HPLC图如图2所示。

(4)聚酰胺树脂柱层析，纯化丹酚酸A

将步骤(3)中所获取的丹酚酸A粗品粉末，用10wt％乙醇溶液溶解后，配成11g/L的 样品溶液150ml，直接加到1g聚酰胺柱的顶端，使其缓慢流过聚酰胺柱，以10wt％乙醇洗脱 至流出液遇三氯化铁阴性反应，用20wt％乙醇溶液洗脱除杂，再用50wt％乙醇溶液洗脱丹 酚酸A，收集50wt％乙醇洗脱液，减压浓缩至无乙醇，冷冻干燥，得纯化的丹酚酸A粉末。其 HPLC图如图3所示。

(5)MCI柱进一步纯化丹酚酸A样品

将步骤(4)纯化的丹酚酸A样品，干法上MCI柱子，以30wt％甲醇溶液洗脱除杂， 40wt％甲醇洗脱丹酚酸A收集洗脱液，浓缩，干燥，得纯度更高的丹酚酸A。其HPLC图如图5所 示。

(6)结晶与重结晶

将MCI柱分离所得丹酚酸A以二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行结晶和重结晶，所述的 二氯甲烷-甲醇混合溶剂中二氯甲烷：甲醇的体积比为3:7，过滤结晶；再以同样方法进行重 结晶，过滤结晶，即得高纯度的丹酚酸A，纯度为95.1％。

实施例2

一种丹酚酸A的提纯分离纯化方法，步骤如下：

将白花丹参参考中国专利文件CN102793745A(申请号：201210334295.7)公开的方 法进行预处理；

(1)溶剂提取：以处理过的丹参为原料，取500g，加入8倍量75wt％的乙醇溶液为提 取溶剂进行超声提取，超声温度为30℃，提取次数4次，每次30分钟，除去药渣，合并滤液。

(2)溶剂萃取：将上述滤液，减压浓缩至无乙醇，加水稀释，加水量为浓缩液重量的 2倍，再以等体积二氯甲烷萃取脱脂，至二氯甲烷层呈淡色，弃去二氯甲烷层，以2.5N盐酸调 pH＝1-2，再以等体积乙酸乙酯萃取，至乙酸乙酯层呈淡黄色，合并乙酸乙酯层。

(3)浓缩干燥：同实施例1中的步骤(3)。

(4)镁盐络合法纯化丹酚酸A

取氯化镁约106mg，加入100mL水，加入约188mg碳酸氢钠，混匀，过滤，将所得溶液 立倒入步骤(3)所得样品中，轻轻振摇加速反应，至样品溶于该溶液即为反应结束，反应时 间约2min。加入等体积二氯甲烷溶液萃取2次，弃去二氯甲烷层，水层中再加入2.5N盐酸调 pH＝1-2再以等体积乙酸乙酯萃取三次，至乙酸乙酯层近无色，合并乙酸乙酯层，浓缩，干 燥，得纯化的丹酚酸A样品。其HPLC图如图4所示。

(5)MCI柱进一步纯化丹酚酸A样品

将步骤4纯化的丹酚酸A样品，干法上MCI柱子，以30wt％甲醇溶液洗脱除杂， 40wt％甲醇洗脱丹酚酸A收集洗脱液，浓缩，干燥，得纯度更高的丹酚酸A。

(6)结晶与重结晶

将MCI柱分离所得丹酚酸A以二氯甲烷-甲醇混合溶剂进行结晶和重结晶，所述的 二氯甲烷-甲醇混合溶剂中二氯甲烷：甲醇的体积比为4:6，过滤结晶；再以同样方法进行重 结晶，过滤结晶，即得高纯度的丹酚酸A，纯度94.7％。

实施例3

与实施例1基本相同，所不同的是步骤(1)加入10倍量75wt％的乙醇溶液为提取溶 剂进行超声提取，超声温度为50℃，提取次数3次，每次40分钟，得丹酚酸A纯度为92.4％。

实施例4

与实施例2基本相同，所不同的是步骤(1)加入12倍量75wt％的乙醇溶液为提取溶 剂进行超声提取，超声温度为70℃，提取次数4次，每次50分钟，得丹酚酸A纯度为93.6％。

实施例5

一种丹酚酸A铵盐的制备方法，步骤如下：

取5mg实施例1所得的高纯度的丹酚酸A粉末，加入到3ml的50％乙醇水中，滴加pH ＝10浓氨溶液调溶液pH调至6.8，溶液颜色依然呈淡黄色，在55℃条件下减压蒸干，即得丹 酚酸A铵盐。¹HNMR(600MHz,D₂O)δ7.45(d,J＝15.8Hz,1H),6.90(s,1H),6.75–6.68(m,2H), 6.62(dd,J＝18.9,8.3Hz,3H),6.52(d,J＝7.9Hz,1H),6.46(d,J＝7.3Hz,1H),6.43(d,J＝ 8.0Hz,1H),6.11(d,J＝16.4Hz,1H),5.89(d,J＝15.8Hz,1H),4.89(dd,J＝7.7,3.9Hz,1H), 2.90(d,J＝11.0Hz,1H),2.83(dd,J＝14.3,8.3Hz,1H)。¹³CNMR(151MHz,D₂O)δ177.17, 168.69,145.85,144.91,144.05,143.86,143.52,142.35,141.34,135.98,130.02,129.83, 126.89,124.45,121.69,120.03,119.73,118.82,116.63,115.96,115.73,114.20,114.20, 113.44,76.16,36.61。

实施例6

一种丹酚酸A镁盐的制备方法，步骤如下：

取10mg实施例2所得的高纯度的丹酚酸A粉末，加入到3ml浓度为0.064％MgCl₂蒸 馏水溶液中，室温下搅拌，然后滴加浓度为0.0951％NaHCO₃或0.101％KHCO₃蒸馏水溶液2ml， 滴加完毕后，继续搅拌2～5分钟，然后冷冻干燥，即得含有氯化钠(或氯化钾)的丹酚酸A镁 盐络合物粉末。¹HNMR(600MHz,D₂O)δ7.44(d,J＝15.0Hz,1H),6.91(s,1H),6.73–6.67(m, 2H),6.62(dd,J＝18.9,8.1Hz,3H),6.52(d,J＝8.0Hz,1H),6.45(d,J＝7.3Hz,1H),6.41(d, J＝8.0Hz,1H),6.12(d,J＝16.4Hz,1H),5.90(d,J＝15.0Hz,1H),4.89(dd,J＝7.7,3.9Hz, 1H),2.91(d,J＝11.0Hz,1H),2.82(dd,J＝14.2,8.1Hz,1H)。

对比例1

如实施例1所述，不同的是分别取5g相同的药材，以步骤(1)中分别为20wt％- 95wt％不同浓度的乙醇为提取溶剂进行超声提取，提取温度、时间、次数同实施例1，合并提 取液，以250ml容量瓶定容250ml。进样量为10μl，采用高效液相色谱法(HPLC)测定丹酚酸A 的含量，以丹酚酸A的峰面积表示其含量。

HPLC色谱条件：色谱柱：AgilentTC-C18(4.6×250mm，5μm)；流速：1.00mL/min； 检测波长：286nm；柱温：25℃；流动相A：0.05％的磷酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱条 件：0～15min，90％～80％A；15～35min，80％～75％A；35～45min，75％～70％A；45～ 55min，70％～10％A；55～70min，10％A。

不同浓度乙醇为提取溶剂的提取结果曲线如图6所示。

通过对比实施例1和对比例1可知，溶剂提取过程中乙醇溶液的浓度为70-80wt％ 效果比较好，其中75％的乙醇浓度提取效果最佳。

对比例2

如实施例1所述，不同的是步骤(4)中采用10wt％-95wt％不同浓度的乙醇进行洗 脱，每一个不同浓度的乙醇洗脱4个保留体积，分别收集不同浓度的洗脱液，定容。进样量为 10μl，采用高效液相色谱法(HPLC)测定丹酚酸A的含量，以丹酚酸A的峰面积表示其含量。

HPLC色谱条件同对比例1，不同浓度乙醇的洗脱曲线如图7所示。

通过对比实施例1和对比例2可知，聚酰胺树脂柱分离纯化过程中，洗脱除杂用的 乙醇溶液的浓度为20wt％效果最佳。

对比例3

如实施例1所述，不同的是步骤(4)中洗脱丹酚酸A用的乙醇溶液浓度，参照对比例 2的实验结果，分别采用40wt％、50wt％的乙醇进行洗脱，收集流出液，每个保留体积收集1 份。采用HPLC测定丹酚酸A的含量，进样量为10μl，以丹酚酸A的峰面积表示其含量。

HPLC色谱条件同对比例1，40wt％乙醇洗脱的洗脱曲线如下图8,50wt％乙醇洗脱 的洗脱曲线如下图9。

将40wt％乙醇洗脱下来的16个保留体积合并，减压蒸去乙醇，冷冻干燥，以HPLC进 行含量测定，采用丹酚酸A的标准曲线计算其洗脱物中丹酚酸A的含量。则40wt％乙醇洗下 来的丹酚酸A量为29.26mg，固形物质量158.2mg，纯度达18.5％，洗脱率为67.73％。

采用与40wt％乙醇洗脱相同的方法进行处理，50wt％乙醇洗脱16个保留体积，乙 醇洗下来的丹酚酸A量为41.08mg，固形物质量144.8mg，纯度达28.4％，洗脱率为95.1％。

通过对比例2的实验结果以及比较40wt％乙醇和50wt％乙醇的洗脱结果可知，聚 酰胺树脂柱分离纯化过程中，洗脱丹酚酸A用的乙醇溶液的浓度为40wt％-50wt％效果较 好，其中50wt％洗脱效果最佳。