海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒及其制备方法和在制备电化学免疫探针中的应用

摘要

本发明公开了一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒及其制备方法和在制备电化学免疫探针中的应用。本发明通过在微乳液中用镉离子、铅离子或铜离子分别交联海藻酸钠制备了纳米级的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜球形颗粒，且能产生可分辨电化学信号。本发明制备方法的特点是制备条件温和，无需外加信号物质即可直接用于标记。使用此海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒标记不同抗体制备的电化学免疫传感器，能够实现不分区的三靶标的同时检测。本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒免疫探针，以及由其制备得到的电化学免疫传感器在免疫传感领域将具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒的制备方法和在制 备免疫探针中的应用，属于电化学传感器领域，它可以用于免疫分析和检测。

背景技术

癌症是一类恶性肿瘤的统称。我国每年有300万人被确诊为癌症，并且这 一数字还在逐年上升。癌症的治疗难度大，死亡率高，是困扰人类的难题之一。 研究表明，早发现早治疗能够有效的提高癌症治愈率同时降低死亡率。癌症的 早期筛查主要针对的是肿瘤标志物。肿瘤标志物通常由胚胎组织和肿瘤组织直 接产生，它的浓度变化能够反应肿瘤的动态变化，并与瘤体大小和临床分期有 关(JosephA.Ludwig,JohnN.Weinstein,BiomarkersinCancerStaging,Prognosis andTreatmentSelection,Nat.Rev.Cancer,2005,5,845–856.)。一种肿瘤标志物 浓度的升高可能与多种癌症有关，而一种癌症可以分泌多种肿瘤标志物。因此， 为了避免单一肿瘤标志物的检测引起“假阳性”，提高诊断准确率，降低测试 费用，同时检测几种肿瘤标志物是目前研究的一个热点问题。

电化学免疫分析技术是一种快速、经济、灵敏度高、可微型化的检测肿瘤 标志物的分析方法(BhaskaraV.Chikkaveeraiah,AshwinkumarA.Bhirde,Nicole Y.Morgan,HenryS.Eden,XiaoyuanChen,ElectrochemicalImmunosensorsfor DetectionofCancerProteinBiomarkers,ACSNano,2012,6,6546–6561.)。实现 多组分同时检测的电化学免疫分析技术主要有以下两种。一种是基于位置分辨 的阵列方法，此方法通常需要特殊的多通道工作电极，如溅射沉积电极或热解 石墨电极等，这些电极材料为一次性材料，导致测试成本高并产生大量废弃物。 另一种是基于标志物分辨的多探针标记方法，即在不同的二级抗体上标记不同 的电化学活性信号物质，构建夹心型电化学传感界面，直接在一根电极上实现 多种肿瘤标志物的同时检测。后者的优点在于电极可以反复使用，能有效降低 成本节约资源。

构建电化学免疫传感器的常用电化学活性物质有二茂铁类聚合物，硫堇、 甲苯胺蓝、普鲁士蓝等有机染料类，醌、酚、醚等聚合物类，由于这类物质难 以与抗体直接结合进行标记，通常需要键合亲水官能团进行改性，或借助纳米 材料作为支撑体制成复合材料，间接标记抗体，制备过程复杂。Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、 Cd²⁺等过渡金属类，具有特征的氧化还原电极电势，常在溶出伏安方法中用作电 活性信号物质，但需要强酸溶解，并在电极上镀汞膜富集，过程繁琐。

海藻酸钠是由α-L-古洛糖醛酸(G单元)和β-D-甘露糖醛酸(M单元)两种 结构单元构成无支链的嵌段共聚物，是一种天然的多糖。它的生物相容性好， 并具有很好的亲水性，并含有大量的官能团如羧基和羟基，常用于蛋白细胞等 生物活性物质的包埋。G单元上的Na⁺与二价金属离子发生离子交换后，使G 集团堆积交联成网状结构，发生不可逆的凝胶化作用。利用此作用可以制备海 藻酸交联二价离子的微球。目前制备海藻酸微球的方法主要有：滴注法、乳化 法、溶剂蒸发法、高压静电液滴法和喷雾干燥法。这些方法制备的海藻酸微球 都在微米级别，目前制备粒径均匀、球形度好、纳米级别的海藻酸微球，依然 是有待解决的难题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球 及其制备方法；

本发明的目的之二在于提供一种由所述新型海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸 铜纳米微球制备得到的藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针；

本发明的目的之三在于提供一种由藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球 免疫探针制备得到的电化学免疫传感器。

本发明的上述目的是通过以下技术手段实现的：

本发明在微乳液中利用二价金属离子Cd²⁺、Pb²⁺或Cu²⁺分别与海藻酸钠交 联，形成海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。这种海藻酸镉、海藻酸铅 和海藻酸铜纳米微球，用戊二醛活化后可以直接偶联抗体制成免疫探针，其中 的二价金属离子产生特征的可分辨的电化学信号峰，金属离子的氧化还原峰与 标记的抗体建立一一对应的关系，峰高与检测的抗原的浓度有关，从而实现三 种肿瘤标志物的同时监测。

本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过 以下方法制备得到：

(1)将1-3g曲拉通，0.5-1.5g正己醇，4-6g正辛烷，1-2mL海藻酸钠水溶 液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液1；

(2)将1-3g曲拉通，0.5-1.5g正己醇，4-6g正辛烷，与1-2mLCdCl₂水溶 液、Pb(NO₃)₂水溶液或CuCl₂水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液2；

(3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应1-6h，产物离心， 沉淀用去离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。

在本发明中，优选的，步骤(1)所述的海藻酸钠的水溶液的质量百分比浓 度为1-2％。

在本发明中，优选的，步骤(2)所述的CdCl₂的水溶液的浓度为0.1-2.0M， Pb(NO₃)₂的水溶液的浓度为0.1-2.0M，CuCl₂的水溶液的浓度为0.1-2.0M。

本发明方法简单，且制备得到纳米尺寸的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜 微球，具有可分辨的金属离子的电化学信号峰。因此使用该海藻酸镉、海藻酸 铅和海藻酸铜纳米微球制备的免疫探针制备电化学免疫传感器，可以实现三种 肿瘤标志物的同时检测。

因此，进一步的，本发明还提出了所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜 纳米微球在制备海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针中的应用。

本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征 在于通过以下方法制备得到：

(1)将以上所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子水洗 涤、分散；

(2)将海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨 基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；

(3)室温下，将活化的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球分别与抗体 溶液偶联，离心除去上清液；

(4)沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜 纳米微球免疫探针于4℃储存。

在本发明中，优选的，步骤(2)中所用戊二醛的质量百分比浓度为5-15％。

更进一步的，本发明还提出了所述的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米 微球免疫探针在制备电化学免疫传感器中的应用。按照本发明所述的方法分别 制备偶联三种抗体的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针，将制 得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针固定在电极的表面，得 到能够同时对三种肿瘤标志物进行同时检测的电化学免疫传感器。

在本发明的具体实施例中，作为范例，给出了一种能够同时实现对肿瘤标 志物CEA、AFP和PSA进行检测的电化学免疫传感器，其特征在于通过以下方 法制备得到：

(1)将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球 用去离子水洗涤、分散；

(2)将海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨 基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；

(3)室温下，将活化的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别与抗肿 瘤标志物CEA、AFP或PSA的抗体溶液偶联，离心除去上清液；

(4)沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜 纳米微球免疫探针于4℃储存。

(5)通过免疫反应将制得的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫 探针固定在电极的表面，即得。

本发明通过将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别偶联了甲胎蛋 白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异性抗原(PSA)的抗体后，制备了 海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针，通过免疫反应将制得的海 藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针固定在电极的表面从而得到了 一种电化学免疫传感器，使用该电化学免疫传感器可以实现对甲胎蛋白、癌胚 抗原和前列腺特异性抗原的同时检测，并且具有较低的检出限、较宽的检测范 围和良好的重现性。

实验证明：利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球电化学免疫探针 同时检测不同浓度的甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特异性抗原 (PSA)，其检测线性范围均为0.01-100ng/mL。检出限分别为0.01ng/mL， 0.0086ng/mL和0.0075ng/mL。

附图说明

图1为本发明一实施例制备的(A)海藻酸镉纳米微球的透射电镜图片，(B) 海藻酸铅纳米微球的透射电镜图片，(C)海藻酸铜纳米微球的透射电镜图片， (D)海藻酸镉纳米微球的扫描电镜图片，(E)海藻酸铅纳米微球的扫描电镜 图片，(F)海藻酸铜纳米微球的扫描电镜图片；

图2为利用制备的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针同时 检测不同浓度的AFP、CEA和PSA的差分脉冲伏安图(A)、电流与AFP浓度 对数(B)、电流与CEA浓度对数(C)、电流与PSA浓度对数(D)的线性关 系图。从图中可以看出该免疫传感器对AFP、CEA和PSA的检测线性范围均为 0.01-100ng/mL。其检出限分别为，0.01ng/mL、0.0086ng/mL和0.0075ng/mL。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。 本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明 技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保 护范围内。

实施例1：

1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备

(1)将2.0g曲拉通，1.0g正己醇，3.0g正辛烷，1.5mL1.5％(w/w)的 海藻酸钠水溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。

(2)将2.0g曲拉通，1.0g正己醇，3.0g正辛烷，与0.5M1.5mL的CdCl₂水溶液、Pb(NO₃)₂水溶液或CuCl₂水溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液 2。

(3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应4h，产物离心，沉 淀用去离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球；透射电镜 观察得到的海藻酸镉，海藻酸铅以及海藻酸铜纳米微球的形貌如图1A、1B和 1C所示。扫描电镜观察得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的形貌 如图1D、1E和1F所示。

2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫 性能实例：

2.1被检测样品：人血清

2.2方法

(1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；

(2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用10％(w/w)的戊二 醛水溶液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；

(3)室温下，将1mL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球 的溶液分别与100μL，1mg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上 清液；

(4)沉淀加入1mL5％的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附， 离心去除上清液。

(5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球 免疫探针分散到1mL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免 疫探针于4℃储存。

(6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20μL200μgmL^-1的AFP、 CEA和PSA的捕获抗体混合溶液，于4℃孵化过夜，用0.01MpH＝7.3的磷酸 缓冲液清洗掉未偶联的抗体。然后，在电极上滴涂80μL,5％的牛血清白蛋白溶 液封闭1小时，以消除非特异性吸附。电极用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液将 过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37℃下孵育超过40min。未反应的人血清 使用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液清洗掉，在37℃下，与以等比例混合的三种 海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40分钟。然后，免 疫传感电极用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫反应 完成后，在0.2M，pH＝5.0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应 信号。

同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统 ELISA方法测定结果的符合程度。

3、结果

对血清样品的检测结果如下表1所示：

表1

实施例2：

1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备

(1)将2.5g曲拉通，1.5g正己醇，3.5g正辛烷，2.0mL1.5％(w/w)的 海藻酸钠水溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。

(2)将2.5g曲拉通，1.5g正己醇，3.5g正辛烷，与1.0M2.0mL的CdCl₂水溶液、Pb(NO₃)₂水溶液或CuCl₂水溶液混合搅拌1小时制备成均匀的微乳液2。

(3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应5h，产物离心，沉 淀用去离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。

2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫 性能实例：

2.1被检测样品：人血清

2.2方法

(1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；

(2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用12％(w/w)的戊二 醛水溶液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；

(3)室温下，将1mL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球 的溶液分别与100μL，1mg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上 清液；

(4)沉淀加入1mL5％的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附， 离心去除上清液。

(5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球 免疫探针分散到1mL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免 疫探针于4℃储存。

(6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20μL200μgmL^-1的AFP、 CEA和PSA的捕获抗体混合溶液，于4℃孵化过夜，用0.01MpH＝7.3的磷酸 缓冲液清洗掉未偶联的抗体。然后，在电极上滴涂80μL,5％的牛血清白蛋白溶 液封闭1小时，以消除非特异性吸附。电极用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液将 过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37℃下孵育超过40min。未反应的人血清 使用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液清洗掉，在37℃下，与以等比例混合的三种 海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40分钟。然后，免 疫传感电极用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫反应 完成后，在0.2M，pH＝5.0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应 信号。

同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统 ELISA方法测定结果的符合程度。

3、结果

对血清样品的检测结果如下表2所示，：

表2

实施例3：

1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备

(1)将1.5g曲拉通，0.5g正己醇，2.5g正辛烷，1.0mL1.5％的海藻酸钠 水溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。

(2)将1.5g曲拉通，0.5g正己醇，2.5g正辛烷，与0.75M1.0mL的CdCl₂水溶液，或Pb(NO₃)₂水溶液或CuCl₂水溶液混合搅拌30min制备成均匀的微乳 液2。

(3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应3h，产物离心，沉 淀用去离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球。

2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫 性能实例：

2.1被检测样品：人血清

2.2方法

(1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；

(2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用8％(w/w)的戊二 醛水溶液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；

(3)室温下，将1mL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球 的溶液分别与100μL，1mg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上 清液；

(4)沉淀加入1mL5％的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附， 离心去除上清液。

(5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球 免疫探针分散到1mL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免 疫探针于4℃储存。

(6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20μL200μgmL^-1的AFP、 CEA和PSA的捕获抗体混合溶液，于4℃孵化过夜，用0.01MpH＝7.3的磷酸 缓冲液清洗掉未偶联的抗体。然后，在电极上滴涂80μL,5％的牛血清白蛋白溶 液封闭1小时，以消除非特异性吸附。电极用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液将 过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37℃下孵育超过40min。未反应的人血清 使用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液清洗掉，在37℃下，与以等比例混合的三种 海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40分钟。然后，免 疫传感电极用0.01M,pH＝7.3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫反应 完成后，在0.2M，pH＝5.0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应 信号。

同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统 ELISA方法测定结果的符合程度。

3、结果

对血清样品的检测结果如下表3所示：

表3

实施例4：本发明的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针的检 测线性范围及检出限的测定

1、海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针的制备：

按照实施例1的方法制备海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针。

2、免疫传感器构建过程：

20μL200μg·mL^-1的AFP、CEA和PSA的捕获抗体混合溶液在4℃条件 下在多孔铂修饰的玻碳电极上孵化过夜。电极表面多余的抗体用0.1M,pH＝7.3 的PBS清洗掉。然后，使用150μL，2％的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消 除非特异性吸附。电极用0.1M,pH＝7.3的PBS过量牛血清白蛋白冲洗后用浓度 分别为0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10,50,100ng·mL^-1的AFP、CEA或PSA抗原混 合溶液在37℃下孵育超过40min。未反应的抗原使用0.1M,pH＝7.3的PBS清 洗掉，在37℃下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米 微球免疫探针孵育超过40分钟。然后，免疫传感电极用0.1M,pH＝7.3的PBS 清洗到过量的免疫探针。免疫反应完成后，以0.1M，pH＝6.5的PBS为检测液， 用方波伏安法检测电流响应信号。

3、结果

图2为海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针同时检测不同浓 度的AFP、CEA和PSA的差分脉冲伏安图(A)、电流与AFP浓度对数(B)、 电流与CEA浓度对数(C)、电流与PSA浓度对数(D)的线性关系图。

从图中可以看出该免疫传感器对AFP、CEA和PSA的检测线性范围均为 0.01-100ng/mL。其检出限分别为，0.01ng/mL、0.0086ng/mL和0.0075ng/mL。