一类氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料、其制法及应用

摘要

一类氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料、其制法及应用。所述氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料具有如下结构通式I。本发明所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料荧光性质具有明显溶剂化效应，在极性溶剂中荧光强，在非极性溶剂中荧光弱；其荧光强度和荧光量子产率与溶剂极性呈现良好的线性关系；选择性好，不受阴阳离子、活性氧、氨基酸、核酸、蛋白质、黏度和pH的干扰；可用于活细胞亚细胞器定位荧光染色。

说明书

技术领域

本发明涉及精细化工领域一类荧光染料、其制法和用途，尤其涉及一类氟化硼络 合二吡咯甲川荧光染料，制备方法及其在活细胞染色方面的应用。

背景技术

荧光探针作为功能性染料在科学技术的各个领域取得了广泛应用，尤其在生命 科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究成为热点。在众多荧光染料中，氟 化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)荧光染料具有摩尔消光系数较高、荧光量子产率 高、光谱性质稳定、光热及化学稳定性好、分子量小和细胞毒性较低等优点，作为生 物分子荧光探针和成像荧光试剂等已被广泛应用。

极性被认为是一个非常重要的环境参数，在生物体中，它可反映出很多生物过程 的活性，如蛋白质相互作用、信号的传导和细胞膜的通透性等。极性敏感型荧光染料 的出现为生物体系中极性的检测提供了一种新方法。通常，此类染料都包含一个基于 ICT机理的环境敏感型荧光团(如香豆素)。当周围极性增大时，染料的发射峰波长 发生红移或/和荧光强度降低(“on-off”)。然而，众所周知，细胞内大部分的物质都 是水，也就是说，细胞内的微环境是亲水性的。因此，能够在亲水环境中发出强荧光 的“off-on”型极性探针更具细胞成像的应用价值。在已报道工作中，虽然有少数几例 基于分子间氢键调控的极性探针具有此性质，但是它们的荧光性质与溶剂的氢键供给 能力相关而不是溶剂极性。此外，大部分的极性探针都没能被用于生物成像研究，具 有亚细胞器(包括线粒体、细胞膜、内质网、高尔基体)定位功能的极性探针更是少 数。

发明内容

本发明提供一类氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，其荧光具有明显的溶剂化效应， 在极性环境中荧光强，而在非极性环境中荧光弱，并且可用于活细胞亚细胞器定位成 像和微环境极性检测。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

一类氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)荧光染料，具有如下结构通式I：

通式I中：

R₁和R₃各自独立地选自H、C_1-8的烷基、取代或未取代苯基，

所述取代苯基由以下一种或多种基团任意取代：CN、COOH、NH₂、OH、SH、 C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、卤素或C_1-6卤代烷基；

R₂选自H、甲基、乙基、氰基、醛基、羰基、酯基、羧基或卤素；

R₄和R₅各自独立地选自C_1-8的烷基；

X是氯、溴或碘；

n选自1-8的整数。

本发明另一方面提供上述氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料的制备方法:

(1)当n＝1或4-8中任意整数时所述方法包括如下步骤：

①式II的化合物与式III的化合物在10-120℃条件下按照摩尔比0.1-1000:1反 应，产物与三氟化硼在-10℃-100℃及有机碱存在条件下反应制备式IV的化合物；

其中，所述的X’选自氯或溴；

②式IV的化合物与仲胺R₄-NH-R₄在20-150℃条件下按摩尔比1:0.1-1000反应 制备式V的化合物；

③式V的化合物与卤代烃R₅X在0-100℃条件下按照摩尔比1:0.1-1000反应制 备式I的化合物；

(2)当n＝2时，所述方法包括如下步骤：

①式VI的化合物与仲胺R₄-NH-R₄按照摩尔比1:0.1-1000溶于二卤代甲烷 CH₂X”₂，然后于10-100℃条件下反应制备式VII的化合物，

其中，所述的X”选自氟、氯、溴或碘；

②式VII的化合物与卤代烃R₅X在0-100℃条件下按照摩尔比1:0.1-1000反应制 备式I的化合物；

(2)当n＝3时，所述方法包括如下步骤：

①式II的化合物与4-溴丁酰氯在10-120℃条件下按摩尔比0.1-1000:1反应，所 得产物与三氟化硼在有机碱存在条件下，于-10℃-100℃反应制备式VIII的化合物；

②式VIII的化合物与三溴化磷在10-100℃条件下按摩尔比1:0.1-1000反应制备 式IX的化合物；

③式IX的化合物与仲胺R₄-NH-R₄中20-150℃条件下按照摩尔比1:0.1-1000反 应制备式X的化合物；

④式X的化合物与卤代烃R₅X在0-100℃条件下按照摩尔比1:0.1-1000反应制 备产物I。

本发明所述氟化硼络合二吡咯甲川荧光探针具有以下显著的特征：

①在非极性溶剂中荧光弱，在极性溶剂(包括水)中荧光强；

②荧光强度和荧光量子产率与溶剂极性呈现良好线性关系；

③选择性好，对其他生物相关物种和微环境参数，如阴阳离子、活性氧、氨基酸、 核酸、蛋白质、黏度和pH，均无响应；

④生物相容性好，可用于活细胞特异细胞器定位染色；

⑤合成简便，产品易得。

鉴于本发明荧光染料的上述特征，尤其对环境极性敏感的荧光性质，本发明进一 步提供其在制备活细胞荧光染料、尤其是活细胞亚细胞器定位染色染料中的应用。

附图说明

本发明附图9幅。

图1是实施例4中荧光染料化合物BP-2在各种不同极性的溶剂中的吸收光谱。 染料BP-2的浓度为5μM。

图2是实施例4中荧光染料化合物BP-2在各种不同极性的溶剂中的荧光光谱。 染料BP-2的浓度为5μM，激发波长是480nm。

图3是实施例4中染料化合物BP-2的荧光强度(图3a)和荧光量子产率(图3b) 随溶液极性的变化。染料BP-2的浓度为5μM，激发波长是480nm。

图4是实施例5中染料化合物BP-2在不同体积配比的乙醇和甘油的混合溶 液中的荧光光谱(图4a)和荧光强度(图4b)。染料BP-2的浓度为5μM，激发 波长是480nm。

图5是实施例6中染料化合物BP-2在pH值条件下的荧光光谱(图5a)和荧光强 度(图5b)。测试体系为PBS(20mM)缓冲液，染料BP-2的浓度为5μM，激发波 长是480nm。

图6是实施例7中染料化合物BP-2对各种生物相关物种的荧光响应图。测试体 系为PBS(20mM，pH7.4)缓冲液，染料BP-2浓度为5μM，Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺和Na⁺浓度为1mM，其他离子浓度为50μM，氨基酸浓度为100μM，活性氧浓度为10μM， 核酸浓度为20μg/mL，蛋白质浓度为100mg/L，激发波长为480nm。

图7是实施例8中染料化合物BP-2染色Raw264.7巨噬细胞的荧光图片。染料 BP-2的浓度为5μM，激发波长是488nm，荧光采集波段是490nm-550nm。

图8是实施例8中染料化合物BP-2在活细胞和PBS(20mM，pH7.4)缓冲液中 的荧光光谱。染料BP-2的浓度为5μM，激发波长分别为488nm(活细胞)和480nm (PBS缓冲液)。

图9是实施例9中染料化合物BP-2和商业化细胞器荧光染料在Raw264.7巨噬 细胞中叠加染色的荧光图片：a)内质网染色：ER-TrackerRed；b)线粒体染色： MitoTrackerDeepRed；c)溶酶体染色：LysoTrackerRed；d-f)BP-2染色；g-i)为a) 与d)、b)与e)、c)与f)的合并图。BP-2、ER-TrackerRed、MitoTrackerDeepRed 和LysoTrackerRed的浓度分别为5μM、1μM、500nM和100nM，激发波长分别为488 nm、559nm、635nm和559nm，荧光收集通道分别是490-550nm、570-650nm、655- 755nm和570-650nm。

具体实施方式

本发明提供一类具有结构通式I的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料。

通式I中：

R₁和R₃各自独立地选自H、C_1-8的烷基、取代或未取代苯基，

所述取代苯基由以下一种或多种基团任意取代：CN、COOH、NH₂、OH、SH、 C_1-6烷氧基、C_1-6烷基氨基、C_1-6酰胺基、卤素或C_1-6卤代烷基；

R₂选自H、甲基、乙基、氰基、醛基、羰基、酯基、羧基或卤素；

R₄和R₅各自独立地选自C_1-8的烷基；

X是氯、溴或碘；

n选自1-8的整数。

具体实施方式之一，所述的R₁选自H或C_1-8的烷基，优选C_1-8的烷基，更优选 C_1-4的烷基，最优选甲基或乙基；所述的R₃选自H或C_1-8的烷基，优选C_1-8的烷基， 更优选C_1-4的烷基，最优选甲基或乙基。

另一具体实施方式，所述的R₂为H、甲基或乙基。R₂最优选H。

再一具体的实施方式，所述的R₄和R₅各自独立地选自C_1-4的烷基。更为优选地， 所述的R₄和R₅各自独立地优选甲基或乙基。

进一步优选的具体实施方式中，所述的X是碘。

再优选的事实方式中，所述的n选自1-3的整数，尤其优选n是2或3。

更为具体地，本发明所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料，选自如下结构的化 合物：

本发明进一步提供所述n为1或4-8的氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)荧光 染料的制备方法，包括以下步骤：卤代酰氯与吡咯衍生物反应得BODIPY染料中间体， 经仲胺取代和卤代烷烃季铵盐化后得到所述BODIPY染料。

更具体的实施方式如下：

①式II的化合物与式III的化合物(X’选自氯或溴)和三氟化硼反应制备中间体 式IV的化合物：式II的化合物与式III的化合物的投料摩尔比为0.1-1000：1，优选为 0.5-100：1，更优选0.5-10：1，再优选1-5：1，最佳为2：1，二者发生缩合反应，再 与三氟化硼化合物反应，加入有机碱，脱掉氟化氢后形成中间体式IV的化合物。化合 物II在溶剂中的摩尔浓度为0.012-0.4mol/L。加入的三氟化硼化合物可为气态三氟化 硼、三氟化硼的乙醚络合物或其他任何能够在常温的溶液下释放出三氟化硼的化合物。

化合物II与化合物III缩合反应的温度应控制10℃-120℃。由于吡咯分子在高温 时很容易发生自聚合，生成粘稠状褐色物质，从而影响主反应，大大降低收率。而当 反应温度太低时，则需要很长的时间来使反应充分。因此反应温度优选为20℃-100℃， 最优选为20℃-40℃。

加入三氟化硼化合物时需要加入有机碱来促进反应的进行，所述有机碱优选三乙 胺。反应温度为-10℃-100℃，优选0℃-10℃。

②式IV的化合物与仲胺(R₄-NH-R₄)反应制备式V的化合物：式IV的化合物 与仲胺(R₄-NH-R₄)的投料摩尔比为1：0.1-1000，优选为1：0.5-500，更优选1：1- 100，最佳为1：2，式IV的化合物在碱性条件下被仲胺(R₄-NH-R₄)亲核取代后生成 中间体式V的化合物。反应温度20-150℃，优选50-120℃，最优选为80-100℃。其中 所述的碱选自氢化纳、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、三乙胺、吡啶和哌啶。 优选碳酸钾。

③式V的化合物与卤代烃(R₅X)反应制备产物I(n＝1,4-8)：式V的化合物与 卤代烃(R₅X)的投料摩尔比为1：0.1-1000，优选为1：1-500，更优选1：2-100，最 佳为1：6，式V的化合物被卤代烃(R₅X)季铵化后形成产物I(n＝1,4-8)。反应温度 0-100℃，优选10-80℃，最优选为20-40℃。

本发明更进一步提供所述的n为2的氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)荧光染 料的制备方法，包括以下步骤：中位甲基BODIPY染料中间体与二卤代甲烷和仲胺发 生曼尼希反应，再经季铵盐化后得到所述BODIPY染料。

更具体的实施方式如下：

①式VI的化合物与二卤代甲烷(CH₂X”₂，X”选自氟、氯、溴或碘)及仲胺(R₄- NH-R₄)反应制备式VII的化合物：式VI的化合物与仲胺的投料摩尔比为1：0.1-1000， 优选为1：0.5-100，更优选1:1-50，最佳为1：20，二者溶于二卤代甲烷中发生曼尼希 反应形成中间体式VII的化合物。反应温度10-100℃，优选20-80℃，最优选为30- 60℃。二卤代甲烷优选二氯甲烷和二溴甲烷。

②式VII的化合物与卤代烃(R₅X)反应制备式I的化合物(n＝2)：式VII的化 合物与卤代烃的投料摩尔比为1：0.1-1000，优选为1：1-500，更优选1：2-100，最佳 为1：6，中间体VII被卤代烃季铵化后形成产物I(n＝2)。反应温度应控制在0-100℃， 优选10-80℃，最优选为20-40℃。

本发明还进一步提供所述n为3的氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)荧光染料 的制备方法，包括以下步骤：4-溴丁酰氯与吡咯衍生物反应得BODIPY染料中间体， 经溴化、仲胺取代和卤代烷烃季铵盐化后得到所述BODIPY染料。

更具体的实施方式如下：

①式II的化合物与4-溴丁酰氯和三氟化硼反应制备中间体式VIII的化合物：式 II的化合物与4-溴丁酰氯的投料摩尔比为0.1-1000：1，优选为0.5-100：1，更优选0.5- 10：1，再优选1-5：1，最佳为2：1，二者发生缩合反应，再与三氟化硼化合物反应， 加入有机碱，脱掉氟化氢后形成中间体式VIII的化合物。化合物II在溶剂中的摩尔浓 度为0.012-0.4mol/L。加入的三氟化硼化合物可为气态三氟化硼、三氟化硼的乙醚络合 物或其他任何能够在常温的溶液下释放出三氟化硼的化合物。化合物II与4-溴丁酰氯 缩合反应的温度应控制10℃-120℃，优选为20℃-100℃，最优选为20℃-40℃。加入 三氟化硼化合物时需要加入有机碱来促进反应的进行，所述有机碱优选三乙胺。反应 温度为-10℃-100℃，优选0℃-10℃。

②式VIII的化合物与三溴化磷反应制备式IX的化合物：式VIII的化合物与三 溴化磷的投料摩尔比为1：0.1-1000，优选为1：5-500，更优选1：5-100，最佳为1： 50，式VIII的化合物被三溴化磷溴代后形成式IX的化合物。反应温度应10-100℃， 优选20-80℃，最优选为30-60℃。

③式IX的化合物与仲胺(R₄-NH-R₄)反应制备式X的化合物：式IX的化合物 与仲胺(R₄-NH-R₄)的投料摩尔比为1：0.1-1000，优选为1：0.5-500，更优选1：1- 100，最佳为1：2，式IX的化合物在碱性条件下被仲胺(R₄-NH-R₄)亲核取代后生成 中间体式X的化合物。反应温度20-150℃，优选50-120℃，最优选为80-100℃。其中 所述的碱选自氢化纳、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、三乙胺、吡啶和哌啶。 优选碳酸钾。

④式X的化合物与卤代烃(R₅X)反应制备产物I(n＝3)：式X的化合物与卤代 烃(R₅X)的投料摩尔比为1：0.1-1000，优选为1：1-500，更优选1：2-100，最佳为 1：6，式X的化合物被卤代烃(R₅X)季铵化后形成产物I(n＝3)。反应温度0-100℃， 优选10-80℃，最优选为20-40℃。

以上反应可在含水的有机溶剂或无水的有机溶剂中进行。优选为无水的有机溶剂。 有机溶剂包括但不仅限于二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、丙酮、四氢呋喃或乙腈等。

本发明的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料的提纯方法采用常规方法，没有特别限 制。通常，反应结束后，直接过滤或蒸去溶剂后利用色谱柱分离提纯产物。

所得荧光染料可通过本领域公知的分离和纯化技术回收，以达到需要的纯度。

本发明中使用的各种原料均可市售获得，或者可通过本领域技术人员公知的方法 或现有技术中公开的方法由本领域公知的原料简单地制备得到。

应认识到，本发明化合物中的各种环取代基有一些可在上述步骤进行之前或刚完 成后，通过标准的芳族取代反应来引入或通过常规的官能团修饰来产生，这包括在本 发明的方法步骤方面。这种反应和修饰包括例如取代基通过芳族取代反应的引入、取 代基的还原、取代基的烷基化和取代基的氧化。用于这些过程的试剂和反应条件是化 学领域公知的。芳族取代反应的具体实例包括用浓硝酸引入硝基，用例如酰卤和路易 斯酸(如三氯化铝)在FriedelCrafts条件下引入酰基，用烷基卤和路易斯酸(如三氯化 铝)在FriedelCrafts条件下引入烷基，和引入卤素基团。修饰的具体实例包括通过例如 用镍催化剂进行催化氢化或者用铁在盐酸存在下进行加热处理，将硝基还原成氨基； 将烷硫基氧化成烷基亚磺酰基或烷基磺酰基。

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”， 则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。例如，“C_1-4烷基”包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和叔丁基等。类似的规则也适用于 本说明书中使用的其它基团。

本发明所述的氟化硼络合二吡咯甲川荧光染料的荧光性质对环境极性敏感，可用 于活细胞特异细胞器定位染色。

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。

实施例1

荧光染料化合物BP-1的合成

①中间体1的合成

2,4-二甲基吡咯(2.0mL，19mmol)和氯乙酰氯(0.7mL，8.8mmol)溶于20mL 除水二氯甲烷中。反应液在0℃下搅拌30min，再在25℃下搅拌30min。在冰浴下， 逐滴加入三乙胺(3.7mL，26mmol)，25℃搅拌10min。再逐滴加入三氟化硼乙醚 (5.5mL，44mmol)，25℃搅拌过夜。减压蒸除溶剂，柱色谱分离得中间体1(656 mg，25.2％)`。¹HNMR(400MHz,CDCl₃),δ:6.09(s,2H,吡咯-H),4.77(s,2H,CH₂), 2.53(s,12H,CH₃)。

②中间体2的合成

将化合物1(90.0mg，0.3mmol)，二甲胺(0.15mL，2M的THF溶液，0.3mmol)， 碘化钾(7.5mg，0.045mmol)和碳酸钾(63.0mg，0.45mmol)溶于10mL除水THF 中。反应液在氮气保护下回流5h，过滤，蒸除溶剂，柱色谱分离得2(46.0mg，50.0％)。 ¹HNMR(400MHz,CDCl₃),δ:6.96(s,1H,吡咯-H),6.21(s,1H,吡咯-H),4.35(s,2H, CH₂),2.74(s,6H,CH₃),2.66(s,3H,CH₃),2.54(s,3H,CH₃),2.47(s,6H,CH₃)；¹³CNMR (100MHz,CDCl₃),δ:157.6,144.2,143.3,139.7,133.5,131.6,129.5,122.9,121.3,54.5, 44.1,17.6,17.4,16.7,14.7；TOFMS(C₁₆H₂₃BF₂N₃⁺)理论值:306.1953,实验值:306.1951。

③化合物BP-1的合成

中间体2(55.0mg，0.18mmol)溶于3mL丙酮中，逐滴加入碘甲烷(0.056mL， 0.9mmol)。反应液在氮气保护下室温搅拌3h，过滤，丙酮洗涤滤饼得探针BP-1(33.5 mg，41.6％)。¹HNMR(400MHz,d⁶-DMSO),δ:6.62(s,1H,吡咯-H),6.46(s,1H,吡咯 -H),4.63(s,2H,CH₂),3.07(s,9H,CH₃),2.45(s,3H,CH₃),2.45(s,3H,CH₃),2.44(s,6H, CH₃)；¹³CNMR(100MHz,d⁶-DMSO),δ:155.2,144.2,143.7,137.9,134.1,131.4,130.1, 122.6,118.9,61.2,53.6,17.4,16.8,14.6；TOFMS(C₁₇H₂₅BF₂N₃⁺)理论值:320.2104,实 验值:320.2116。

实施例2

荧光染料化合物BP-2的合成：

①中间体4的合成

将化合物3(82.0mg，0.314mmol)溶于3mL除水二氯甲烷中，再加入二甲胺 (3.14mL，2M的THF溶液，6.28mmol)。反应液在氮气保护下回流搅拌三天，用 二氯甲烷稀释，再经饱和NH₄Cl水溶液和卤水洗涤得粗产品。柱色谱提纯得中间体4 (60.0mg，60.1％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃),δ:6.06(s,2H,吡咯-H),3.20(t,J＝8 Hz,2H,CH₂),2.56(t,J＝8Hz,2H,CH₂),2.51(s,6H,CH₃),2.47(s,6H,CH₃),2.35(s,6H, CH₃)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃),δ:154.2,140.4,137.4,131.7,121.8,60.6,45.4,27.1, 16.6,14.5；TOF(C₁₇H₂₅BF₂N₃⁺)理论值:320.2104,实验值:320.2115。

②化合物BP-2的合成

中间体4(60mg，0.19mmol)溶于2mL丙酮中，逐滴加入碘甲烷(0.06mL， 0.94mmol)。反应液在氮气保护下室温搅拌2h，过滤，丙酮洗涤滤饼得探针BP-2(54 mg，62.3％)。¹HNMR(400MHz,d⁶-DMSO),δ:6.33(s,2H,吡咯-H),3.56(t,J＝8Hz, 2H,CH₂),3.44(t,J＝8Hz,2H,CH₂),3.23(s,9H,CH₃),2.53(s,6H,CH₃),2.43(s,6H,CH₃)； ¹³CNMR(100MHz,d⁶-DMSO),δ:154.7,141.4,138.4,131.1,122.4,63.8,52.3,22.0,16.4, 14.2；TOFMS(C₁₈H₂₇BF₂N₃⁺)理论值:334.2261,实验值:334.2283。

实施例3

荧光染料化合物BP-4的合成

③中间体5的合成

2,4-二甲基吡咯(2.0mL，19mmol)和4-溴丁酰氯(1.0mL，8.8mmol)溶于20 mL除水二氯甲烷中。反应液在0℃下搅拌30min，再在25℃下搅拌30min。在冰 浴下，逐滴加入三乙胺(3.7mL，26mmol)，25℃搅拌10min。再逐滴加入三氟化 硼乙醚(5.5mL，44mmol)，25℃搅拌过夜。减压蒸除溶剂，柱色谱分离得中间体 5(546mg，20.2％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃),δ:6.05(s,2H,吡咯-H),3.80(t,J＝4 Hz,2H,CH₂),3.06(t,J＝4Hz,2H,CH₂),2.52(s,6H,CH₃),2.43(s,6H,CH₃),1.86(m,2H, CH₂)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃),δ:154.0,146.0,140.4,131.5,121.7,62.5,34.4,25.0, 16.5,14.4；TOFMS(C₁₆H₂₂BF₂N₂O⁺)理论值:307.1788,实验值:307.1790。

④中间体6的合成

将中间体5(61.2mg，0.2mmol)溶于1,2-二氯乙烷(10mL)中。在冰浴条件下， 逐滴加入1.0mL三溴化磷。反应液在45℃下搅拌4h后，倒入NaHCO₃水溶液中。 有机相经无水MgSO₄干燥，减压旋蒸得粗产品。柱色谱提纯得中间体6(63.5mg， 86.3％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃),δ:6.06(s,2H,吡咯-H),3.56(t,J＝4Hz,2H,CH₂), 3.13(t,J＝4Hz,2H,CH₂),2.52(s,6H,CH₃),2.45(s,6H,CH₃),2.17(m,2H,CH₂)；¹³CNMR (100MHz,CDCl₃),δ:154.4,144.2,140.3,131.5,121.9,34.0,32.8,27.2,16.7,14.5；TOF MS(C₁₆H₂₀BBrF₂N₂⁺)理论值:368.0871,实验值:368.0878。

⑤中间体7的合成

将中间体6(37.0mg，0.1mmol)，二甲胺(0.10mL，2M的THF溶液，0.2mmol) 和碳酸钾(28.0mg，0.2mmol)溶于5mL乙腈中。反应液在氮气保护下回流3h，过 滤，减压旋蒸得粗产品。柱色谱提纯得中间体7(18.0mg，54.0％)。¹HNMR(400 MHz,CDCl₃),δ:6.07(s,2H,吡咯-H),3.03(t,J＝4Hz,2H,CH₂),2.84(t,J＝4Hz,2H,CH₂), 2.63(s,6H,CH₃),2.51(s,6H,CH₃),2.42(s,6H,CH₃),2.04(m,2H,CH₂)；¹³CNMR(100 MHz,CDCl₃),δ:154.3,144.7,140.2,131.3,121.9,57.5,43.7,31.0,25.0,16.4,14.4；TOF MS(C₁₈H₂₇BF₂N₃⁺)理论值:334.2261,实验值:334.2259。

⑥化合物BP-4的合成

中间体7(50mg，0.15mmol)溶于3mL丙酮中，逐滴加入碘甲烷(0.056mL， 0.9mmol)。反应液在氮气保护下室温搅拌4h，过滤，丙酮洗涤滤饼得探针BP-4(32 mg，44.9％)。¹HNMR(400MHz,d⁶-DMSO),δ:6.26(s,2H,吡咯-H),3.45(t,J＝4Hz, 2H,CH₂),3.30(t,J＝4Hz,2H,CH₂),3.07(s,9H,CH₃),2.45(s,6H,CH₃),2.41(s,6H,CH₃), 1.94(m,2H,CH₂)；¹³CNMR(100MHz,d⁶-DMSO),δ:153.4,145.6,140.9,130.7,121.8, 63.8,52.2,30.1,24.5,15.9,14.1；TOFMS(C₁₉H₂₉BF₂N₃⁺)理论值:348.2417,实验值: 348.2424。

实施例4

荧光染料化合物BP-2在各种不同极性的溶剂中的光谱测试

将5μM的染料化合物BP-2加入到各种不同极性的溶剂中，包括甲苯、乙酸乙酯、 四氢呋喃、二氯甲烷、正己醇、甲基异丙基酮、乙醇、乙腈、甲醇和水，记录其相应 吸收和荧光光谱，激发波长为480nm，测试结果显示于图1和图2中。从图中可以看 出，荧光染料BP-2的荧光性质对环境极性敏感，在非极性溶剂中荧光弱，而在极性溶 剂中荧光强。而且，BP-2的荧光强度和荧光量子产率与溶剂极性呈现良好线性关系， 如图3所示。

实施例5

荧光染料化合物BP-2对溶液黏度的敏感性测试

将5μM的染料化合物BP-2加入到不同体积配比的乙醇和甘油的混合溶液中，搅 拌混合均匀，超声5min除去溶液中的气泡，待其在常温下稳定1h后进行荧光光谱测 试，结果显示于图4中。从图中可看出，随溶液黏度的增大，化合物BP-2的荧光只有 非常微小的增强。

实施例6

荧光染料化合物BP-2的pH滴定实验

使用上述合成的化合物BP-2评价对pH的响应，对于化合物BP-2(5μM)在PBS (20mM，pH7.4)缓冲液中调节pH值为4.0左右，激发波长为480nm，逐渐加入碱 液，使pH值缓慢增大至10.0左右，记录相应荧光光谱，测试结果显示于图5中。从 图中可以看出荧光染料化合物BP-2在pH＝4.0-10.0的范围内，pH变化对染料的荧光 发射基本没有影响。

实施例7

荧光染料化合物BP-2的对生物相关物种的荧光响应测试

在溶有染料化合物BP-2(5μM)的PBS(20mM，pH7.4)缓冲液中分别加入各 种阴阳离子、氨基酸、活性氧、核酸和蛋白质，记录相应荧光光谱，激发波长为480 nm，测试结果显示于图6中。从图中可以看出化合物BP-2对所测生物相关物种基本 无响应。

实施例8

染料化合物BP-2对活细胞的荧光染色实验

Raw264.7细胞在DEME(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚 焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入 5μM的染料化合物BP-2，保持在37℃及5％CO₂条件下，孵育20分钟，然后用磷酸 缓冲溶液冲洗3遍，进行共聚焦成像。

细胞的培养密度为2×10⁵cells/mL。成像所用仪器为OlympusFV1000-IX81倒置显 微镜，100倍油镜。激发光为488nm激发，收集490-550nm波段。

图7显示的是BP-2染色的活细胞荧光图片。从图中可以看出，BP-2在活细胞内 呈点状分布，主要集中在近核区域。而且，如图8所示，BP-2在活细胞内的发射光谱 与在PBS缓冲溶液中测得的基本一致。

实施例9

荧光染料化合物BP-2对活细胞特定细胞器定位染色实验

Raw264.7细胞在DEME(invitrogen)中用10％的FCS(invitrogen)培养。共聚 焦荧光成像实验前一天，细胞种在专用的细胞共聚焦培养皿中。第二天，向其中加入 5μM的染料化合物BP-2和商业化细胞器定位染料(ER-TrackerRed，1μM；MitoTracker DeepRed，500nM；LysoTrackerRed，100nM)，保持在37℃及5％CO₂条件下，孵育 20分钟，然后用磷酸缓冲溶液冲洗3遍，进行共聚焦成像。

细胞的培养密度为2×10⁵cells/mL。成像所用仪器为OlympusFV1000-IX81倒置显 微镜，100倍油镜。BP-2、ER-TrackerRed、MitoTrackerDeepRed和LysoTrackerRed 的激发波长分别为488nm、559nm、635nm和559nm，荧光通道分别是490-550nm、 570-650nm、655-755nm和570-650nm。

图9显示的是染料化合物BP-2与商业化细胞器染料叠加染色的荧光图片。从图 中可以看出，BP-2与LysoTrackerRed在MCF-7细胞中荧光基本完全重叠，而与其他 细胞器染料则重叠很少，表明探针BP-2可特异性定位于活细胞的溶酶体中。