具有抗炎活性的永瓣藤提取物、制备方法及其应用

摘要

本发明涉及中药技术领域，公开了一种具有抗炎活性的永瓣藤提取物，是由扁蒴藤素、雷公藤酚A、美登木酸、雷公藤红素、卫矛酮、木栓酮等三萜成分组成的有效部位。其特征是以植物永瓣藤(？Monimopetalum？Chinese？Rehd.？)茎叶为原料，甲醇、乙醇或含水醇类提取，过滤、浓缩至小体积，加少量水悬浮后用大孔树脂柱层析，收集80～100%醇洗脱部位即得总三萜部位。本发明工艺简单，操作合理，并且对炎症介质前列腺素E

说明书

技术领域

本发明涉及中药技术领域，特别涉及从天然植物永瓣藤中提取总三萜类化合物的制备方法和其在抗炎药物中的应用。

背景技术

永瓣藤(MonimopetalumChineseRehd.)系卫矛科(Celastraceae)永瓣藤属单型属植物，是中国特有植物，种群十分稀少,被列为国家首批二级保护植物。1925年，中国植物学家秦仁昌首次在安徽省祁门县棕里村潘坑采到果实标本，于1926年发表，当时拟名为祁藤。美国植物分类学家A.Rehder根据秦仁昌采集的3096号标本，视其果实外有大而宿存的花瓣，并永不凋落，在植物界中颇为罕见，故称永瓣藤。1959年才于江西省景德镇采到花期标本。1997年，江西省的专业采集人谭策铭在湖北省通山县太平山发现新分布。对永瓣藤研究和应用十分稀少。已报道从永瓣藤中分离获得4个五环三萜类化合物，分别为算盘子酮(glochidone)^[1，2]、木栓酮(friedelin)^[2]、表木栓醇(epifriedelinol)^[2]和表木栓醇二十八烷酸酯(epifriedelinoloctacosanate)^[3]。江西民间用永瓣藤治疗风湿性关节炎^[1，2]。但目前，尚未见有永瓣藤抗炎药理活性、抗炎活性成分的确定和总三萜提取物制备方法的研究报道。

风湿性关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种慢性的、有症状的、可导致不同的对病人严重的、全身影响的疾病。常用的治疗药物以非甾体类抗炎药、激素类药物、生物制剂等为主，但由于价格昂贵、长期服用毒副作用大，限制了其应用。中药治疗风湿性关节炎历史悠久，具有疗效好、毒副作用小的优势，因此，有广泛的应用前景。我国地域辽阔，中药材资源丰富，藤类中药在中医络病尤其是在风湿痹证的防治中占有重要地位，《本草纲目》和《本草纲目拾遗》中收载藤茎类中药200余种。因藤类植物活力顽强，攀树掾壁，盘根错节，以取类比象原理，取其入药，善走经络，祛风湿，解筋挛。正如《本草汇言》云：“凡藤蔓之属，可通经入络”。即：凡藤蔓之属，善于攀越缠绕，质地坚韧，不但具有祛风除湿、行气活血功效，更是通络引经之使药佳品。《本草纲目》云：“凡藤蔓之属，象人之筋，所以多治筋病。”（《本草纲目·卷十八》）筋与肌肉骨节相连属，其病常互相影响。故藤蔓之药不独治筋病，对肌肉骨节痹病亦有较好疗效。痹证的病因病机为气血不足，外邪乘虚侵袭肌表，流注经络、关节，致使气血不行，血脉淤滞，关节肿胀，故治疗痹病一定要从通经活络入手。根据藤类药物性味，用以治疗痹病所见的肌肉筋骨关节疼痛，具有通经活络、舒筋止痛的效果。如鸡血藤、雷公藤、络石藤、忍冬藤、海风藤等，多具有活血化瘀，祛风通络的作用，临床上多用于治疗风湿痹痛、关节不利、筋脉拘挛。卫矛属植物被我国中医、少数民族医用及民间药用的有61种，大多用于治疗跌打损伤、风湿痹痛、活血止血、杀虫解毒。永瓣藤作为民间偏方，应用极少，其活性成分和药效机理均不明确，加上作为珍稀植物较少为人了解，所以其开发利用还是空白。虽然林业农业学者已经找到其繁殖率低的原因，并拥有技术提高其繁殖率，但没有经济效益，农民不愿意种植，无法推广，使得永瓣藤的资源仍为稀少。只有开发其深入价值，才能吸引更多的关注，扩大种植面积和进行可持续发展的资源保护。

与本发明有关的现有技术有。

[1]陈玲,谢平,戚薇等。永瓣藤化学成分的研究。江西中医学院学报,1994,6（1）：30-32。

[2]谢平,朱盛华,冯育林等。永瓣藤化学成分的研究（I）。江西中医学院学报,2001,13（4）：159-160。

[3]谢平,朱盛华,冯育林等。永瓣藤化学成分的研究(II)。江西中医学院学报，2002，14（1）：39-40。

发明内容

本发明旨在提供一种永瓣藤提取物的制备方法，总三萜有效部位中抗炎活性成分的组成，以及在制备抗炎药物中的用途。

本发明公开了一种具有抗炎活性永瓣藤提取物，其特征在于：由扁蒴藤素（Pristimerin）、雷公藤酚A（WilforolA）、美登木酸（Polpunonicacid）、雷公藤红素（又名南蛇藤素，Celastrol）、卫矛酮（Tingenone）、木栓酮（Friedelin）等三萜成分组成的有效部位。结构式如下所示。

本发明是通过以下技术方案实现。

上述永瓣藤提取物的制备方法，其特征在于：以植物永瓣藤(MonimopetalumChineseRehd.)茎叶为原料，甲醇、乙醇或含水醇类提取，过滤、浓缩至小体积，加少量水悬浮后用大孔树脂柱层析，收集80～100%醇洗脱部位即得总三萜部位。

本发明所述永瓣藤提取物（总三萜部位）进行体外抗炎实验筛选，利用脂蛋白（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7建立体外抗炎模型，检测炎症因子前列腺素E₂（PGE₂）和一氧化氮（NO）的生成，炎症因子浓度越低，活性越高，实验结果显示本发明所述的天然抗炎药物对炎症因子前列腺素E₂和一氧化氮有明显的抑制作用。

本发明所述永瓣藤提取物（总三萜部位）进行体内动物抗炎实验，各剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀均有不同程度的抑制作用，对蛋清致大鼠足肿胀均有不同程度的抑制作用，能够明显降低足肿胀度，显示对急性炎症引起的肿胀、渗出有一定的抑制作用；对棉球植入法致大鼠肉芽增生均有不同程度的抑制作用，显示对慢性炎症的肉芽增生有一定的抑制作用。

本发明所述永瓣藤提取物（总三萜部位）用作药物时，可以直接使用，或者以药物制剂形式使用。

本发明所述永瓣藤提取物（总三萜部位）与医学上可接受载体或赋形剂制备成片剂、胶囊剂、注射剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、糊剂、贴剂、缓释或控释制剂。

本发明的有益效果如下。

1，药物制备工艺简单、操作合理。

2，通过体内体外抗炎药理实验，明确了永瓣藤抗炎活性的有效部位，集中在极性较小的80～100%醇洗脱部位，提高了药效，降低了杂质的组成和毒副作用，为永瓣藤在治疗风湿性关节炎的临床用药方面，提供了理论与实验基础。

3，通过超高压液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（UPLC-QTOFMS）分析，首次明确了抗炎活性的有效部位组成为三萜，包括卫矛酮（分子式C₂₈H₃₆O₃，分子量420.58，CASNo.50802-21-6）、木栓酮(分子式C₃₀H₅₀O，分子量426.72，CASNo.559-74-0)、雷公藤红素（分子式C₂₉H₃₈O₄，分子量450.61，CASNo.34157-83-0）、美登木酸（分子式C₃₀H₄₈O₃，分子量456.70，CASNo.33600-93-0）、扁蒴藤素（分子式C₃₀H₄₀O₄，分子量464.64，CASNo.1258-84-0）、雷公藤酚A（分子式C₂₉H₃₈O₅，分子量466.62，CASNo.167882-66-8）。除了木栓酮已有文献报道，其余活性成分均为首次从永瓣藤中发现。此外，还首次发现永瓣藤中20～60%乙醇部位含有儿茶素类抗氧化活性成分，60～80%乙醇部位含有杀虫抗菌活性的β-二氢沉香呋喃倍半萜（专利申请号：CN201510321499），但均无明显的抗炎活性。

4，目前，永瓣藤的经济、观赏价值研究尚属空白，开展药用成分研究，在利用的基础上实现有效保护，可以起到迁地保护及可持续发展作用。祁门县林业局对永瓣藤的育苗栽培已有丰富经验，一旦得到利用，可以规模化种植，其植物资源大大丰富，也可以增加农民的经济收益。永瓣藤的化学成分研究对卫矛科种群起源进化、相互关系，以及阐明华东植物区系的起源和外部的联系等方面均有重要科学意义。

附图说明

以下图可作为附件材料上报。

图1、本发明实施例1所得的永瓣藤提取物活性成分的结构式。

图2、本发明实施例1所得的永瓣藤提取物UPLC-QTOFMS正离子色谱图。

图3、本发明实施例1所得的扁蒴藤素高分辨质谱（HR-ESIMS）谱图。

图4、本发明实施例1所得的雷公藤酚A高分辨质谱（HR-ESIMS）谱图。

图5、本发明实施例1所得的美登木酸高分辨质谱（HR-ESIMS）谱图。

图6、本发明实施例1所得的雷公藤红素高分辨质谱（HR-ESIMS）谱图。

图7、本发明实施例1所得的卫矛酮高分辨质谱（HR-ESIMS）谱图。

图8、本发明实施例1所得的木栓酮高分辨质谱（HR-ESIMS）谱图。

具体实施方式

结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述，但本发明的内容并不仅仅限于所列举的实施方式。

实施例1.永瓣藤提取物（总三萜部位）的制备。

实验方法：永瓣藤茎叶5kg，用8倍量80%乙醇80℃加热回流提取3次，过滤、浓缩至小体积，加少量水悬浮后经D101大孔树脂柱层析，水洗脱杂质（Fr.1），20%乙醇洗脱部位（Fr.2）、40%乙醇洗脱部位（Fr.3）和60%乙醇洗脱部位（Fr.4）分开收集不用，80%乙醇和100%乙醇洗脱部位合并（Fr.5和Fr.6）收集浓缩干燥后可得总三萜部位。

总三萜部位的成分分析。

分析方法：美国Agilent公司1260UPLC-6530QTOF型液质联用仪；色谱柱：安捷伦ZorbaxSB-C₁₈600bar，1.8μm，4.6×100mm；流动相A相：0.1%甲酸-水，B相：乙腈，洗脱梯度0min40%B，60min100%B，70min100%B；流速0.3mL/min；进样量5μL；柱温35℃；DAD检测波长240nm，270nm；质谱检测器ESI离子源，正离子模式（100-1700m/z），雾化器压力（Nebulizerpressure）50psi，干燥气流速（DryingGasFlow）10mL/min，干燥气温度（DryingGasTemp）350℃，毛细管电压（CapillaryVoltage）4000V，Fragmentor电压175V，碰撞能量（CouisionEnerg）20V。

实验结果：扁蒴藤素（Pristimerin）保留时间为48.464min，相对含量为5.47%；雷公藤酚A（WilforolA）保留时间为54.373min，相对含量为14.07%；美登木酸（Polpunonicacid）保留时间为55.073min，相对含量为11.56%；雷公藤红素（Celastrol）保留时间为56.055min，相对含量为6.37%；卫矛酮（Tingenone）保留时间为59.209min，相对含量为15.16%；木栓酮（Friedelin）保留时间为62.591min，相对含量为6.87%。

实施例2.永瓣藤各部位提取物细胞毒性实验（MTT法）。

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540～720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。而巨噬细胞是重要的炎症因子分泌细胞，其细胞功能与炎症密切相关。

实验样品为：实施例1获得的水洗脱部位（Fr.1）、20%乙醇洗脱部位（Fr.2）、40%乙醇洗脱部位（Fr.3）、60%乙醇洗脱部位（Fr.4）、80%乙醇洗脱部位（Fr.5）、100%乙醇洗脱部位（Fr.6），阳性对照药为吲哚美辛（IM）。

实验方法：取处于指数生长期状态良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板上，加入受试药物，分别培养48h。将5mg/mLMTT加入96孔板中，10μL/孔，培养箱中反应4h。吸去上清液，加入DMSO，100μL/孔，振摇5min，用酶标仪测定每孔吸光值，测量波长570nm，参考波长690nm，计算细胞抑制率。抑制率(%)=(A_570加药组-A_690加药组)/(A_570对照组-A_690对照组)×100%。

实验结果：由表1可知，永瓣藤80%乙醇洗脱部位（Fr.5）、100%乙醇洗脱部位（Fr.6）在100μg/mL以下对细胞毒性较小。

实施例3.永瓣藤各部位提取物对炎症因子前列腺素E₂（PGE₂）的抑制作用。

PGE₂是一种极其重要的脂质代谢产物，在受到生理或病理的各种刺激，尤其是有害刺激时被释放，在发热、炎症和血压调节中均发挥着重要作用。利用脂蛋白（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7建立体外抗炎模型，酶联免疫法（ELISA）法检测PGE₂的含量，炎症因子浓度越低，抑制率越高，抗炎活性越好。阳性对照药为吲哚美辛（IM）。

实验结果：由表2可知，永瓣藤80%乙醇洗脱部位（Fr.5）、100%乙醇洗脱部位（Fr.6）均可抑制LPS诱导的PGE₂产生。

实施例4.永瓣藤总三萜提取物对炎症因子一氧化氮（NO）的抑制作用。

在炎症和免疫应答中起着关键的调节作用。NO能够影响炎症反应的进程，如影响cGMP，NF-κB依赖的信号转导通路，调节核转录因子抑制剂NF-κB的活性，影响多种炎症因子的表达等。利用脂蛋白（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7建立体外抗炎模型，硝酸还原酶法检测NO的含量，炎症因子浓度越低，抑制率越高，抗炎活性越好。阳性对照药为吲哚美辛（IM）。

实验结果：由表3可知，除Fr.1外，永瓣藤其余部位均可抑制LPS诱导的NO产生。综上所述，永瓣藤80～100%乙醇洗脱部位（Fr.5和Fr.6）具有一定的体外抗炎活性，结合液质联用法进行成分分析，三萜是80～100%乙醇洗脱部位（Fr.5和Fr.6）的主要成分，也是主要抗炎活性成分。

实施例5.永瓣藤提取物（总三萜部位，YBT）对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用。

实验方法：取70只小鼠，随机均分为7组：正常对照组（等容量）、模型对照组（等容量）、雷公藤多苷片对照组（50mg/kg）、吲哚美辛对照组（10mg/kg）、YBT小剂量组（25mg/kg）、YBT中剂量组（50mg/kg）、YBT大剂量组（100mg/kg），各组小鼠分别按剂量连续灌胃3天，于末次药后40min，每鼠左耳涂0.05mL二甲苯致炎，右耳涂等容量蒸馏水做空白对照，1h后将小鼠处死，剪下两耳片，在相同部位用直径0.9cm打孔器打下耳片，电子天平称重。计算耳片的肿胀度、肿胀率和肿胀抵制率。结果：造模后，模型组左耳重及肿胀度增加，与正常组比较有非常显著性差异（P<0.01），说明造模成功；YBT各剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀均有不同程度的抑制作用，左耳重及肿胀度较模型对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；在等效剂量下，YBT中剂量组与雷公藤多苷片对照组、吲哚美辛对照组比较均未见显著性差异（P>0.05）。结论：YBT对急性炎症引起的肿胀、渗出有一定的抑制作用。

实施例6.永瓣藤提取物（总三萜部位，YBT）对蛋清致大鼠足肿胀的抑制作用。

实验方法：取70只大鼠，随机均分为7组：正常对照组（等容量）、模型对照组（等容量）、雷公藤多苷片组（38mg/kg）、吲哚美辛对照组（7.5mg/kg）、YBT小剂量组（19mg/kg）、YBT中剂量组（38mg/kg）、YBT大剂量组（76mg/kg），各组大鼠分别按剂量连续灌胃3天，在右足踝关节处标记，用容量法测大鼠正常足容积，于末次药后40min每鼠右足趾腱膜下注入蛋清0.1mL，分别于注射后0.5、1、1.5、2、3h测足趾肿胀体积，计算肿胀度和肿胀抑制率。结果：模型组大鼠在各个时间点的肿胀度与正常组大鼠相比较，有显著性差异（P<0.01），说明造模成功；YBT各剂量组对蛋清致大鼠足肿胀均有不同程度的抑制作用，能够明显降低足肿胀度，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；在等效剂量下，YBT中剂量组与雷公藤多苷片对照组、吲哚美辛对照组比较均未见显著性差异（P>0.05）。结论：YBT对急性炎症引起的肿胀、渗出有一定的抑制作用。

实施例7.永瓣藤提取物（总三萜部位，YBT）对棉球植入法致大鼠肉芽增生的抑制作用。

实验方法：取60只大鼠，随机均分为6组：模型对照组（等容量）、雷公藤多苷片组（38mg/kg）、吲哚美辛对照组（7.5mg/kg）、YBT小剂量组（19mg/kg）、YBT中剂量组（38mg/kg）、YBT大剂量组（76mg/kg），于大鼠一侧腹股沟皮下植入已消毒、干燥、称重的棉球。动物清醒后，按相应剂量灌胃给药，连续7d，末次药后40min，剥离并取出肉芽组织称湿重，干燥后称肉芽棉球干重，计算肉芽增生抑制率；结果：YBT各剂量组对肉芽增生均有不同程度的抑制作用，肉芽湿重、干重，与模型对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；在等效剂量下，YBT中剂量组与雷公藤多苷片对照组、吲哚美辛对照组比较均未见显著性差异（P>0.05）。结论：YBT对慢性炎症的肉芽增生有一定的抑制作用。