一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，是以藻蓝蛋白和聚乳酸共聚物为原料，利用羧基的加成反应和亲疏水自组装原理，形成藻蓝蛋白-聚乳酸空载胶束，该空载胶束通过自组装的机理将阿霉素包裹在空载胶束里面，自组装形成胶束制备得到。本发明的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束是一种新型纳米药物，能够穿过血脑屏障到达肿瘤处，对脑癌细胞具有抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，克服了血脑屏障对药物治疗效果的影响和限制；而且制备该胶束的材料均来源于天然或可降解成分，合成过程不涉及有机溶剂，具有良好的生物相容性、生物可降解性、低毒性、载药率高等优势，在治疗脑癌方面有很大的应用潜力。

说明书

技术领域

本发明属于医药材料技术领域。更具体地，涉及一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束及其制备方法和应用。

背景技术

脑肿瘤是指原发性和转移性肿瘤的异质群体,中枢神经系统是危及生命的疾病,其特点是存活率极低。据统计，脑癌的发病率为40/10万，就全身肿瘤的发病率而论，脑瘤居第五（6.31%），仅低于胃，子宫，乳腺，食道肿瘤。虽然该病的发病率不算最高，但是致死率非常高。

目前的研究显示，恶性脑肿瘤治疗方法包括手术切除、放疗、和化疗及复合疗法。这些方法可以极大的延长患者的生存时间，虽然大部分治疗手段可以患者缓解病情，延长生存期，但传统治疗的风险高、毒副作用大并存在并发症，癌症对药物的抵抗导致治疗效果差，而治疗后产生的癌症耐药、复发和转移则是患者死亡的主要原因。因此，尽管在脑肿瘤的诊断和治疗方法上已经付出了极大的努力，但是脑肿瘤的治愈仍然是神经肿瘤的一大挑战，其最主要原因之一就是血脑屏障（BloodBrainBarrier），血脑屏障为了维持脑部神经系统的稳定性，因此选择性允许某些物质通过，不允许另一些物质通过，从而阻止内生的有害物质和外来物质随血液流入，但同时这也成为脑肿瘤治疗的主要限制因素；同时，血脑屏障具有特殊的酶系统，这种酶系统不但可以使透过的药物迅速代谢失活，并且还具有高特异性的外排机制。由于血脑屏障的存在，一般的抗癌药物无法通过血液运输进入相应的肿瘤部位，即使有些药物可透过血脑屏障，但是会被特殊的酶系统外排到血液中，降低药效。所以普通的治疗药物难以对脑癌具体部位的细胞的杀伤起很大的作用，因此寻找能通过的血脑屏障并能靶向治疗的抗癌药物尤为重要。

另外，国内外有文献报道，藻蓝蛋白对肝癌细胞等具有直接的杀伤与抑制作用。同时，阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，该品抗瘤谱较广，目前已证实可适用于急性白血病（淋巴细胞性和粒细胞性）、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌（未分化小细胞性和非小细胞性）、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。但是这些药物均不能克服血脑屏障的问题而应用于脑癌的治疗领域。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有脑癌治疗技术和药物的不足，提供一种新型的脑癌治疗药物材料，本发明选取可降解聚乳酸共聚物修饰藻蓝蛋白，增加其亲水性自组装形成胶束作为运药载体，并包裹装载药物阿霉素，应用于抗肿瘤研究。

本发明的目的是提供一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束。

本发明另一目的是提供上述藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种抑制脑癌的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，是以藻蓝蛋白和聚乳酸共聚物为原料，利用羧基的加成反应和亲疏水自组装原理，形成藻蓝蛋白-聚乳酸空载胶束，该空载胶束通过自组装的机理将阿霉素包裹在空载胶束里面，自组装形成胶束制备得到。

其中，优选地，所述藻蓝蛋白：聚乳酸共聚物：阿霉素的质量比为900～1100：800～1000：1。

更优选地，所述藻蓝蛋白：聚乳酸共聚物：阿霉素的质量比为：950～1050：900～950：1。

最优选地，所述藻蓝蛋白：聚乳酸共聚物：阿霉素的质量比为1000：920：1。

另外，优选地，所述羧基的加成反应的条件为室温下搅拌8～15小时。

优选地，所述聚乳酸共聚物为可降解的聚乳酸共聚物pla3600-peg200-pla3600。

具体地，上述藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束的制备方法，包括如下步骤：

S1.按照藻蓝蛋白：盐酸阿霉素：聚乳酸共聚物=900～1100：800～1000：1的质量比，先向藻蓝蛋白溶液中加入盐酸阿霉素，搅拌均匀后，再加入聚乳酸共聚物溶液，室温下搅拌8～15小时；

S2.取步骤S1处理后的溶液在超纯水中透析20～30小时，期间每隔5～7小时换一次水，以保证将反应的残物全部除去，透析结束后加入戊二醛进行交联，再用透析袋在超纯水中透析20～30小时，期间每隔5～7小时换一次水，透析结束后即得到藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，命名为PC-DOX-PLEL。

优选地，步骤S1所述室温为15～35℃。

优选地，所述藻蓝蛋白：聚乳酸共聚物：阿霉素的质量比为：950～1050：900～950：1。

更优选地，所述藻蓝蛋白：聚乳酸共聚物：阿霉素的质量比为1000：920：1。

优选地，步骤S1所述藻蓝蛋白溶液的溶剂为pH=7.4的PBS。

优选地，步骤S1所述藻蓝蛋白溶液的浓度为5mg/mL。

优选地，步骤S1所述盐酸阿霉素的浓度为1mg/ml。

优选地，步骤S1所述搅拌均匀所用的时间为30min。

优选地，步骤S1所述聚乳酸共聚物溶液的溶剂为DMSO。

优选地，步骤S1所述聚乳酸共聚物溶液的浓度为25mg/ml。

优选地，步骤S1所述聚乳酸共聚物为pla3600-peg2000-pla3600。

优选地，步骤S1室温下搅拌的时间为12小时。

优选地，步骤S2所述透析是用悬浮式透析袋在超纯水中透析。

优选地，步骤S2所述透析的时间均为24小时。

优选地，步骤S2所述透析期间，均为每隔6小时换一次水。

另外，根据上述述制备方法制备得到的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，也应在本发明的保护范围之内。

本发明首次利用藻蓝蛋白和聚乳酸制备出胶束载体，将阿霉素包裹其中形成藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，成功制得一种抗脑癌的新型药物，该药物粒径很小（30～40nm），符合穿过血脑屏障的要求，并对脑癌细胞具有一定的抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累，有很大的潜力应用于脑癌的治疗。

因此，上述藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束在制备抗脑癌药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明将藻蓝蛋白和阿霉素，用聚乳酸共聚物（pla3600-peg200-pla3600）混匀，自组装成胶束，用戊二醛交联，形成了目的PC-DOX-PLEL胶束；通过粒径分布、Zeta电位、红外光谱分析、SDS-PAGE电泳透射电镜以及体外释放动力学等方面表征胶束粒子粒径大小、形态容貌等；最后探究合成的胶束在细胞水平的抗脑癌作用，通过台盼蓝染色、细胞计数以及流式细胞仪检测细胞凋亡等实验，证明了PC-DOX-PLEL胶束对脑癌细胞具有杀伤作用。

本发明为了克服血脑屏障对药物治疗效果的影响和限制，选择了纳米颗粒材料作为载体材料，本发明选择高分子聚乳酸共聚物（pla3600-peg200-pla3600）来修饰藻蓝蛋白，由于聚乳酸共聚物自身良好的生物可降解性和生物兼容性，其作为药物载体可以有效地提高藻蓝蛋白的稳定性。而结合高分子的藻蓝蛋白不仅可以保持藻蓝蛋白蛋白原有的性质，而且增加了其两亲性使其可以具有自组装的特性。从而使得藻蓝蛋白克服了蛋白本身一些缺陷（藻蓝蛋白具有很好的生物相容性，但本身存在容易降解、结构容易被破坏等缺陷），更符合通过血脑屏障的药物载体的要求，并且降低了细胞毒性和其他对正常组织细胞的副作用，为靶向治疗脑癌提高更好的运载体，为无副作用治疗脑癌提供可能性。因此可降解高分子化合物修饰蛋白质是一种拓宽并提高蛋白质性能的有效性。

研究中藻蓝蛋白也具有很好的生物相容性和可降解性，使得其成为抗癌药物载体的合适选择；但本身存在的容易降解等缺陷。而两亲性嵌段共聚物可以改变藻蓝蛋白的亲水性和疏水性，使其在溶液中自组装形成胶束，从而改善藻蓝蛋白的稳定性。同时聚乳酸共聚物（pla3600-peg200-pla3600）修饰藻蓝蛋白，运用自组装的原理合成胶束，提供高效的药物运载体的基础上，也简化了药物载体合成的工艺流程，为临床药物试验提供良好的合成前提。

本发明最终成功的合成了分散性好，尺寸很小的藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束；用该胶束作用脑癌体外细胞模型（C6细胞）后，对C6细胞具有抑制作用。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次利用藻蓝蛋白和聚乳酸制备出胶束载体，将阿霉素包裹其中形成藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束，成功制得一种抗脑癌的新型药物，该药物粒径很小（约为30～40nm）符合穿过血脑屏障的要求，对脑癌细胞具有一定抑制作用，而且药物能够缓慢释放，在血液中的留存作用时间较长，使其最终能在肿瘤组织处被动积累，克服了血脑屏障对药物治疗效果的影响和限制，有很大的潜力应用于脑癌的治疗。

本发明选取可降解聚乳酸共聚物修饰天然的藻蓝蛋白，增加其亲水性自组装形成胶束作为运药载体，并包裹装载药物阿霉素，低毒性，载药率高。将藻蓝蛋白应用成载药体，扩大了藻蓝蛋白的应用范围；同时提供一种新型可降解的纳米医药载体材料，为有效治疗脑癌提供了新的思路和方向。

本发明藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束是一种新型的纳米药物，可以通过血脑屏障，而且胶束内核强烈的限制了装载的药物的移动，药物分子与胶束核区疏水嵌段的疏水作用降低了载体膜的渗透系数和扩散系数，使药物得以缓慢释放，具有结构稳定、优良的组织渗透性、体内滞留时间长、能使药物有效地到达靶点等优势。

聚乳酸共聚物是一种双亲共聚物，是指在同一高分子中既有亲水部分，又有疏水部分的聚合物。聚乳酸共聚物修饰藻蓝蛋白的复合体由于双亲共聚物独特的链段组成和链段特性，使其在一定条件下依赖范德华力相互聚集，能够自发组装成有序的，具有特殊形态（亲油基向内，亲水向外，大小在胶体级别(1nm～100nm）的分子聚集体-胶束，分子的极性亲水头端则露于外部，与极性的水分子发生作用，并对胶束内部的憎水基团产生保护作用。用聚乳酸共聚物修饰藻蓝蛋白，可以很好地改善藻蓝蛋白的亲疏水性，两者结合自组装成胶束更加稳定。

附图说明

图1为藻蓝蛋白（PC）、聚乳酸共聚物（PLEL）和藻蓝蛋白与聚乳酸共聚物反应产物（PC-PLEL）的红外谱图。

图2为PC-DOX-PLEL胶束的合成示意图。

图3为SDS-PAGE电泳图。

图4是本发明制备胶束的zeta电位图

图5为本发明制备胶束的粒径分布图。

图6为本发明制备胶束的透射电镜形貌图。

图7是通过紫外分光光度计测得加药后不同时间点阿霉素释放百分比（%）。

图8是对加药后细胞的台盼蓝染色图。

图9为细胞计数结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用材料为：

试剂：藻蓝蛋白（Phycocyanin）（购买于浙江台州宾美生物科技有限公司）；聚乳酸共聚物（pla3600-peg2000-pla3600）（购买于济南岱罡生物工程有限公司）；阿霉素（购买于广州中山医院第三分院）。

细胞株：大鼠脑质瘤细胞C6细胞，由深圳先进科学研究院提供，转由华南师范大学关燕清教授实验室培养传代。

培养基：高糖DMEM培养基；胰酶均为GIBCO2BRI公司产品；戊二醛；二甲基亚砜。

仪器：电子透射显微镜JEM-210Nikon，显微镜，日本Olympus公司光学倒置显微镜；Sigma32184高速冷冻离心机；ThermoCO2培养箱；江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器；HV-85高压灭菌器；无菌操作台；广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。

实施例1藻蓝蛋白-聚乳酸胶束（PC-PLEL胶束）自组装合成

1、制备方法

（1）准确称量藻蓝蛋白粉末0.2g，用10mlPBS（pH=7.4）溶解成5mg/mL的藻蓝蛋白溶液，搅拌30min，加入用7.36mlDMSO溶解的0.184g聚乳酸共聚物（pla3600-peg2000-pla3600）成25mg/ml溶液，室温下搅拌12小时。

（2）取2ml溶液用悬浮式透析袋在超纯水中透析24小时，期间每隔6小时换一次水以保证将反应的残物全部除去，透析结束后加入10μl戊二醛，再用透析袋在超纯水中透析24小时，期间每隔6小时换一次水，透析结束后将溶液放置在冰箱中，备用，命名为PC-PLEL。

2、傅里叶红外光谱检测

（1）将PC-DOX-PLEL和PC-PLEL用冻干机冻干、干燥处理后的复合物分别放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，然后上机测定。

（2）图1是利用傅立叶转换红外光谱仪对相应反应物和产物表征的红外谱图。谱图a为藻蓝蛋白（PC）的红外谱图；谱图b为聚乳酸共聚物（PLEL）的红外谱图；谱图c为藻蓝蛋白和聚乳酸共聚物反应产物（PC-PLEL）。

谱图a中，藻蓝蛋白在1657cm^-1有一强的吸收峰，为C=O基团的吸收峰；在1546cm^-1有一强吸收峰，为酰胺亚基N-H的吸收峰。谱图b中，聚乳酸共聚物在1758cm^-1有吸收峰，为C=O基团的吸收峰。对比谱图a和谱图b，谱图c分别在1546cm^-1、1657cm^-1和1758处有N-H、C=O和C=O的吸收峰，因为合成的藻蓝蛋白-聚乳酸胶束同时包含藻蓝蛋白和聚乳酸共聚物的基团。初步说明了我们的胶束合成反应成功。

实施例2制备藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束（PC-DOX-PLEL胶束）

本发明提供的PC-DOX-PLEL胶束合成示意图如附图2所示，具体如下：

1、制备PC-DOX-PLEL胶束

准确称量藻蓝蛋白粉末0.2g，用10mlPBS（pH=7.4）溶解成5mg/mL的藻蓝蛋白溶液，搅拌均匀后，再加入盐酸阿霉素（1mg/ml）200μl，搅拌30min后，再加入用7.36mlDMSO溶解0.184g聚乳酸共聚物（pla3600-peg2000-pla3600）成25mg/ml溶液，室温下搅拌12小时。

取2ml溶液用悬浮式透析袋在超纯水中透析24小时，期间每隔6小时换一次水以保证将反应的残物全部除去，透析结束后加入10μl戊二醛，再用透析袋在超纯水中透析24小时，期间每隔6小时换一次水，透析结束后将溶液放置在冰箱中，备用，命名为PC-DOX-PLEL。

2、为了进一步说明藻蓝蛋白和聚乳酸接枝成功，我们进行SDS-PAGE电泳表征。

（1）SDS-PAGE凝胶电泳简称SDS-PAGE。安装长短玻璃板，检查不渗漏后，按表配制20mL8%的聚丙烯酰胺（PAA）溶液，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板之间的缝隙内，取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入，以进行水封。20min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分；按表配制10mL5%的PAA，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，然后轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，放置40-50min，使凝胶“老化；小心拔去样品槽模板，将pH值为8.3的Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下储槽中，应没过短玻璃板0.5cm以上；将样品加入样品槽中；接通电源，先将电压调至50V，待样品进入分离胶，将电压调至220V，当样品前沿距硅胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源；将凝胶板剥下用染色液染色4h，最后用脱色液洗脱至胶板显示为无色即可拍照分析。

（2）图3为SDS-PAGE电泳图，条带从左到右分别为蛋白Marker（M）、藻蓝蛋白（PC）、聚乳酸共聚物（PLEL）、阿霉素（DOX）、藻蓝蛋白/聚乳酸合成物（PC-PLEL）以及藻蓝蛋白/聚乳酸/阿霉素胶束（PC-DOX-PLEL）。

通过SDS-PAGE蛋白染色我们可以看到在分子量35-130范围内，聚乳酸共聚物（PLEL）和阿霉素（DOX）均没有出现明显的条带，而藻蓝蛋白（PC）、藻蓝蛋白/聚乳酸合成物（PC-PLEL）和藻蓝蛋白/聚乳酸/阿霉素胶束（PC-DOX-PLEL）3者在分子量35-50存在明显的条带或者弥散现象，初步表明该胶束由藻蓝蛋白自组装合成成功。

3、Zeta电位测定

（1）ζ-电位是指剪切面(ShearPlane)的电位，反映物质表面净电荷，表征胶体分散系稳定性。本文采取Nano-ZS动态光散射仪测定，所需报告直接给出，无需计算。为了使得胶束分散均匀，实验前超声10分钟，对藻蓝蛋白和胶束结构无影响。

取PC-DOX-PLEL和PC-PLEL两个样品量2mL，用超纯水稀释成100倍，超声10分钟，使其分布均匀，用NanoZS型激光纳米粒度仪测定电位。

（2）图4是藻蓝蛋白-聚乳酸胶束的zeta电位图，由图可以看到我们合成的胶束的电位大概为-20mv，表明合成的胶束分散稳定性较强。

4、动态光散射粒径检测

（1）为了初步该胶束粒径检测，我们进行了动态光散射粒径检测。

取PC-DOX-PLEL和PC-PLEL两个样品量2mL，用超纯水稀释成100倍，超声10分钟，使其分布均匀。将测试杯分别用酒精和超纯水清洗干净，NanoZS型激光纳米粒度仪测定粒径。

（2）图5为藻蓝蛋白-聚乳酸胶束的粒径分布图，由图显示，该胶束粒径大致分布在80nm左右，由于动态光散射粒径检测仪检测的到的为水合粒径，其测量值会比真实值偏大30nm-40nm，所以估算其真实值为40nm左右。因此符合通过血脑屏障的要求。

5、TEM透射电镜检测

（1）在初步粒径检测后，为了更加直观观察胶束的粒径和形貌，我们进一步对合成的藻蓝蛋白-聚乳酸胶束进行透射电镜形态学观察。

取PC-PLEL-GA与为PC-DOX-PLEL-GA两种样品各1ml，用超声波处理器处理5min，充分超声震荡，使其分布均匀，再稀释100倍后，然后用移液枪将胶束滴加在铜网上，置于红外灯下烘干，将制得的TEM铜片样品置于JEM-2100型透射电子显微镜进行胶束形貌观察。

（2）图6为本发明制备胶束的透射电镜形貌图。由图可以看出，我们可以清楚的看到有胶束状存在，同时合成的胶束粒径在40nm左右和形状规则为接近球状。这与粒径动态光散射仪检测结果相吻合。

6、体外阿霉素的释放周期试验

（1）体外释放性能是评价胶束应用潜力的一项很重要的质量指标。因此我们检测藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束在pH7，37℃下的释放速率。

取PC-DOX-PLEL-GA样品1ml，用分子量5000的透析袋在500ml超纯水中搅拌释放，按照0h，4h，8h，12h，24h，48h，36h，48h，72h总共9个样品各4ml，然后在486nm吸收峰进行分光光度法测定，画出体外释放实验。

（2）图7是通过紫外分光光度计测得加药后不同时间点在吸收峰480nm的吸收值，由标准阿霉素曲线方程，计算出阿霉素释放量，折算出阿霉素累计释放百分比（%）。以透析时间为横坐标，相应时间点累积释放百分比（%）为纵坐标作图，绘制pH=7.0下的释放动力学曲线。

由图中得知，阿霉素释放分为快速释放期和缓慢释放期。快速释放期出现在透析的前20个小时，后期藻蓝蛋白缓慢降解，使阿霉素缓慢释放，在释放120小时后几乎完全释放。

实施例3PC-DOX-PLEL胶束的的抗癌应用

1、C6细胞培养

C6细胞系由中国科学院深圳先进技术研究所提供。细胞在培养瓶中增殖培养至80%后，以16000/孔的密度接种至24孔板上，培养1～2天，以进行后续实验。其细胞培养条件为：含10%新生牛血清的高糖DMEM培养基，37℃，5.0%CO₂。

2、台盼蓝染色与细胞计数

我们选择台盼蓝染色与细胞计数的方法来初步统计加入药物后细胞死亡率，从而初步检验藻蓝蛋白-聚乳酸胶束对C6脑癌细胞杀伤作用。

（1）用24孔板培养C6细胞至正常状态，使细胞充分贴壁生长。实验分为四组，分别加入等量的：a空白组：藻蓝蛋白-聚乳酸复合胶束（不载阿霉素），b组：藻蓝蛋白，c组：阿霉素，d组：藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素复合胶束，培养12h；用台盼蓝染液进行染色。

分别加入等量相同浓度的血清、藻蓝蛋白、阿霉素以及藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束药物，培养12h后，弃去培养基，进行台盼蓝染色。

首先，称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时，用PBS稀释至0.4%。为了能清楚的拍下细胞，我们先加台盼蓝染液，台盼蓝溶液与PBS以9:1混合混匀染色5min。然后用荧光显微镜拍下细胞染色形态。

图8是对加药后细胞的台盼蓝染色图，由图可以看出，d组为藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束组，细胞染色最多，即细胞死亡率最高。

（2）为了进一步定量分析每组细胞存活率的大小，我们进行了细胞计数检测效果。

为进行细胞计数，我们用胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。在镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。统计细胞活力：活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

图9为细胞计数结果。进过细胞计数同样证明d组的细胞存活率最低，其细胞存活率为61.5%。由此证明藻蓝蛋白-聚乳酸-阿霉素胶束相对其他组对C6细胞有更好的杀伤作用。