一种团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质的制备方法

摘要

本发明公开了一种团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质的制备方法，其步骤：A、选取不含氯硝柳胺的团头鲂；B、将氯硝柳胺投放到水中；C、将团头鲂放入含有氯硝柳胺的水体中浸泡后，用蒸馏水冲洗团头鲂的体表；D、从新鲜团头鲂的尾静脉处取血液，收集血浆，冷冻保存；E、将采集完血液的团头鲂体表的鳞片去掉，分别取团头鲂的肝脏、肌肉组织，冷冻保存；F、团头鲂血浆样品的前处理；G、团头鲂肝脏样品的前处理；H、团头鲂肌肉样品的前处理；对团头鲂血浆、肝脏和肌肉组织中氯硝柳胺残留标准物质的浓度进行定值，并进行均匀性与稳定性检验，制备出团头鲂血浆、肝脏和肌肉组织中氯硝柳胺残留标准物质。

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，更具体涉及一种团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质的制备方法，适用于团头鲂血浆、肝脏、肾脏和肌肉组织中氯硝柳胺残留标准物质的制备。

背景技术

氯硝柳胺，又名杀螺胺，育末生，贝螺杀，灭绦灵，清塘净等，为一种高效的杀虫剂，亦是一种人工合成的高效灭螺药，一般用于杀灭寄生在动物体内的寄生虫和人体内的绦虫，主要用于防治血吸虫，在水产养殖业中氯硝柳胺被用作清塘剂。该药物不仅杀螺持效长、效率高，同时对血吸虫尾蚴、螺卵均有明显杀灭作用，世界卫生组织(WHO)将该药物作为首推化学灭螺药。研究发现氯硝柳胺对鱼类的毒性属剧毒，而且氯硝柳胺可引起TA1538株沙门氏菌鼠伤寒菌的染色体发生移码突变，小鼠骨髓染色体断裂，小鼠口服氯硝柳胺后小鼠尿液中的2种沙门氏菌均出现突变现象，一定剂量的氯硝柳胺可导致小鼠的精子异常率明显升高，氯硝柳胺可引起曲霉属小巢状曲菌的有丝分裂出现交叉互换和不分离现象，因此，氯硝柳胺是一种具有致突变和基因毒性的药物。为保障水产品质量安全，进而保护人类的健康，提供一种可靠的定性、定量方法是非常必要的，目前国外仅有两篇文献报道了水产品中氯硝柳胺的检测方法，一篇是采用高效液相色谱紫外法(HPLC-UV)检测虹鳟和斑点叉尾鮰鱼片中氯硝柳胺，由于其样品前处理过程中提取过程复杂，消耗大量有机溶剂，净化过程采用固相萃取小柱(SPE柱)，不仅增加了工作量，而且增加了检测的成本；在检测方法上该方法所用的流动相(液相)组分复杂，检测氯硝柳胺的灵敏度低等缺点不能满足日常检测的要求；另一篇是采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测水产品中氯硝柳胺，该研究表明，采用HPLC-MS/MS测定水产品中氯硝柳胺具有灵敏度高、可定性、样品处理简单等优点，但测定过程中水产品存在明显的基质效应，而基质效应会使氯硝柳胺的无法准确定量，目前解决HPLC-MS/MS测定过程中产生的基质效应的最好方法是采用氯硝柳胺的同位素标记标准品或采用相应的基质标准品来定量待测样品。而目前尚没有商品化的氯硝柳胺的同位素标记的标准品，为此我们研制了一种团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质，并提供了其制备方法。

目前，国内外未见有团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质的制备方法的报道或申请专利。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种团头鲂血浆、肝脏和肌肉组织中氯硝柳胺残留标准物质的制备方法，制备的氯硝柳胺残留标准物质是采用在水体中添加氯硝柳胺溶液，通过浸泡团头鲂的方式使氯硝柳胺富集到团头鲂的血浆、肝脏和肌肉组织中，使团头鲂血浆、肝脏、肾脏和肌肉组织组织中含有一定浓度的氯硝柳胺，在合适的浸泡时间后取团头鲂的血液、肝脏、肌肉组织，制备出团头鲂血浆、肝脏和肌肉组织中氯硝柳胺残留标准物质，对团头鲂血浆、肝脏和肌肉组织中氯硝柳胺残留标准物质的浓度进行定值，并进行均匀性与稳定性检验。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

其技术构思是：选取300g～400g的已确认不含氯硝柳胺的团头鲂在1m³水族箱内暂养一周，淡水养殖条件，水温为24℃～26℃，pH为7.9～8.1，连续充气，溶解氧值≥5.0mg/L。将9.0mg氯硝柳胺溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，再将其投放到320L水体中，水体中氯硝柳胺的浓度为0.028mg/L，将团头鲂放入含有氯硝柳胺的水体中浸泡120h后，取出团头鲂，取团头鲂的血液、肝脏和肌肉组织。团头鲂血液的采集用预先用1％肝素钠水溶液润洗过的5mL注射器，从团鲂的尾静脉处取血液，并将采集的血液放入事先用1％肝素钠水溶液润洗过的离心管中，4000r/min，离心5min，收集上层血浆，制备出血浆中氯硝柳胺残留标准物质于干净的10mL离心管中，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；将肝脏组织放于小塑料封口袋中，用手在袋外将袋内肝脏组织碾碎，混匀，制备出血浆中氯硝柳胺残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；将采集的团头鲂的背部肌肉，去皮后切成小块，用匀浆机将团头鲂肌肉匀质，制备出肌肉中氯硝柳胺残留标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月。

一种团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质的制备方法，其步骤是：

A、选取300g～400g已确认不含氯硝柳胺的团头鲂，在1m³水族箱内暂养一周，用于制备团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质。淡水养殖条件，水温为24℃～26℃，pH为7.9～8.1，连续充气，溶解氧值≥5.0mg/L；

B、将9.0mg氯硝柳胺溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，再将其投放到320L水中，水体中氯硝柳胺的浓度为0.028mg/L，将团头鲂放到水体中进行浸泡，浸泡过程中不饲喂任何饲料；

C、将团头鲂放入含有氯硝柳胺的水体中浸泡110－130h后(浸泡过程中不饲喂任何饲料)，取出5尾团头鲂，用蒸馏水冲洗团头鲂的体表2－4次；

D、用预先用1％(质量和体积比)肝素钠水溶液润洗过的5mL注射器，从新鲜团头鲂的尾静脉处取血液，并将采集的血液放入事先用1％肝素钠水溶液润洗过的10mL离心管中，4000r/min，离心5min，收集上层血浆，制备出血浆中氯硝柳胺标准物质，于干净的10mL离心管中，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；

E、将采集完血液的团头鲂体表的鳞片去掉，分别取新鲜团头鲂的肝脏、肌肉组织，将采集的团头鲂的背部肌肉，去皮后切成小块，用匀浆机将团头鲂肌肉匀质，制备出肌肉中氯硝柳胺标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；将采集的肝脏组织放于(8.5cm×6cm)塑料封口袋中，用手在袋外将袋内肝脏组织碾碎，混匀后制备出肝脏中氯硝柳胺标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；

F、团头鲂血浆样品前处理：取1mL血浆样品，加入4mL氨化乙腈(pH8～12)，涡旋振荡28－32s，超声提取9－11min，加入1.5g无水硫酸镁，涡旋振荡28－32s，7000r/min，离心4－6min，转移上层液体至10mL离心管中，向原试管中再加入4mL氨化乙腈重复提取一次，合并于10mL离心管中，置50℃氮吹仪上，氮吹至干，加入1mL70％(体积比)乙腈水溶液定容，再加入50mgC18ODS粉(十八烷基硅烷键合硅胶填料)，涡旋振荡28－32s，离心4－6min，过0.22μm有机系(尼龙)滤头，获得从血浆中提取、净化后含氯硝柳胺可供HPLC-MS/MS检测的液体。

G、团头鲂肝脏样品的前处理：取1g肝脏样品，加入4mL氨化乙腈，涡旋振荡28－32s，超声提取9－11min，加入1.5g无水硫酸镁，涡旋振荡28－32s，7000r/min，离心4－6min，转移上层液体至10mL离心管中，向原试管中再加入4mL氨化乙腈重复提取一次，合并于10mL离心管中，置50℃氮吹仪上，氮吹至干，加入1mL70％乙腈水溶液定容，再加入50mgC18ODS粉(十八烷基硅烷键合硅胶填料)，涡旋振荡28－32s，离心论坛4－6min，过0.22μm有机系(尼龙)滤头，获得从肝脏中提取、净化后含氯硝柳胺可供HPLC-MS/MS检测的液体。

H、团头鲂肌肉样品的前处理方法按照发明专利“一种检测水产品中氯硝柳胺的前处理试剂盒及方法”，专利号为ZL201310355849.6进行，获得从肌肉中提取、净化后含氯硝柳胺可供HPLC-MS/MS检测的液体。

I、团头鲂血浆、肝脏、肌肉样品中氯硝柳胺的定值方法，采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)进行测定，HPLC-MS/MS仪器条件按照发明专利“一种检测水产品中氯硝柳胺的前处理试剂盒及方法”，专利号为ZL201310355849.6中仪器条件进行设定，获得团头鲂血浆、肝脏、肌肉组织中氯硝柳胺的残留量。

所述的1％肝素钠水溶液的配制方法：称取1g肝素钠用蒸馏水溶解并定容至100mL，摇匀后使用，现配现用或4℃冰箱保存，有效期为7d。

所述的氨化乙腈(pH值为8～12)的配制方法：取稀氨水适量(50μL～200μL)加入500mL乙腈中配制成pH值为8～12的氨化乙腈；所述的稀氨水配制方法：取浓氨水(25％～28％)用等体积蒸馏水稀释配制成稀氨水。

所述的70％乙腈水溶液的配制方法：乙腈和双蒸水按体积比70:30混匀配制而成。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

(1)本发明通过将氯硝柳胺投放到水体中，并将团头鲂放于该水族箱中，通过团头鲂对氯硝柳胺真实的吸收途径，氯硝柳胺残留在团头鲂各组织中，制备氯硝柳胺血浆、肝脏、肌肉基质标准物质，更接近氯硝柳胺在团头鲂各组织中的实际存在状态，与实际检测样品一致。

(2)以此方法制备的氯硝柳胺基质标准物质可以避免由血浆、肝脏、肌肉组织对氯硝柳胺产生的基质效应(抑制作用)见表1，有利于准确地对团头鲂血浆、肝脏、肌肉中的氯硝柳胺进行定量。

表1血浆、肝脏、肌肉组织对氯硝柳胺的基质作用

基质作用的计算公式：

附图说明

图1为一种氯硝柳胺标准溶液色谱图；

1-氯硝柳胺母离子(质荷比(m/z)324.9)总离子流图，2-氯硝柳胺定量子离子(m/z289.0)离子流图，3-氯硝柳胺定性子离子(m/z171.1)离子流图

图2为一种实施例1中团头鲂血浆中氯硝柳胺的HPLC-MS/MS色谱图；

1-氯硝柳胺母离子(质荷比(m/z)324.9)总离子流图，2-氯硝柳胺定量子离子(m/z289.0)离子流图，3-氯硝柳胺定性子离子(m/z171.1)离子流图

图3为一种实施例1中团头鲂肝脏中氯硝柳胺的HPLC-MS/MS色谱图；

1-氯硝柳胺母离子(质荷比(m/z)324.9)总离子流图，2-氯硝柳胺定量子离子(m/z289.0)离子流图，3-氯硝柳胺定性子离子(m/z171.1)离子流图

图4为一种实施例1中团头鲂肌肉中氯硝柳胺的HPLC-MS/MS色谱图；

1-氯硝柳胺母离子(质荷比(m/z)324.9)总离子流图，2-氯硝柳胺定量子离子(m/z289.0)离子流图，3-氯硝柳胺定性子离子(m/z171.1)离子流图

具体实施方式

实施例1：

一种团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质的制备方法，其步骤是：

A、选取300g或350或400g已确认不含氯硝柳胺的团头鲂，在1m³水族箱内暂养一周，用于制备团头鲂组织中氯硝柳胺残留标准物质。淡水养殖条件，水温为24或25或26℃，pH为7.9或8或8.1，连续充气，溶解氧值≥5.0mg/L；

B、将9.0mg氯硝柳胺溶解在5mL的二甲基甲酰胺中，再将其投放到320L水中，水体中氯硝柳胺的浓度为0.028mg/L，将团头鲂放到水体中进行浸泡，浸泡过程中不饲喂任何饲料；

C、将团头鲂放入含有氯硝柳胺的水体中浸泡110或115或120或125或130h后(浸泡过程中不饲喂任何饲料)，取出5尾团头鲂，用蒸馏水冲洗团头鲂的体表2或3或4次；

D、用预先用1％肝素钠水溶液润洗过的5mL注射器，从新鲜团头鲂的尾静脉处取血液，并将采集的血液放入事先用1％肝素钠水溶液润洗过的10mL离心管中，4000r/min，离心4或5或6min，收集上层血浆，制备出血浆中氯硝柳胺标准物质，于干净的10mL离心管中，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；

E、将采集完血液的团头鲂体表的鳞片去掉，分别取新鲜团头鲂的肝脏、肌肉组织，将采集的团头鲂的背部肌肉，去皮后切成小块，用匀浆机将团头鲂肌肉匀质，制备出肌肉中氯硝柳胺标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；将采集的肝脏组织放于(8.5cm×6cm)塑料封口袋中，用手在袋外将袋内肝脏组织碾碎，混匀后制备出肝脏中氯硝柳胺标准物质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；

F、血浆样品前处理：取1mL血浆样品，加入4mL氨化乙腈(pH8或9或10或11或12)，涡旋振荡28或29或30或31或32s，超声提取9或10或11min，加入1.5g无水硫酸镁，涡旋振荡28或29或30或31或32s，7000r/min，离心4或5或6min，转移上层液体至10mL离心管中，向原试管中再加入4mL氨化乙腈重复提取一次，合并于10mL离心管中，置50℃氮吹仪上，氮吹至干，加入1mL70％乙腈水溶液定容，再加入50mgC18ODS粉(十八烷基硅烷键合硅胶填料)，涡旋振荡28或29或30或31或32s，离心4或5或6min，过0.22μm有机系(尼龙)滤头，获得从血浆中提取、净化后含氯硝柳胺可供HPLC-MS/MS检测的液体。

G、肝脏样品的前处理：取1g肝脏样品，加入4mL氨化乙腈，涡旋振荡28或29或30或31或32s，超声提取10min，加入1.5g无水硫酸镁，涡旋振荡28或29或30或31或32s，7000r/min，离心4或5或6min，转移上层液体至10mL离心管中，向原试管中再加入4mL氨化乙腈重复提取一次，合并于10mL离心管中，置50℃氮吹仪上，氮吹至干，加入1mL70％乙腈水溶液定容，再加入50mgC18ODS粉(十八烷基硅烷键合硅胶填料)，涡旋振荡28或29或30或31或32s，离心4或5或6min，过0.22μm有机系(尼龙)滤头，获得从肝脏中提取、净化后含氯硝柳胺可供HPLC-MS/MS检测的液体。

H、肌肉样品的前处理按照发明专利“一种检测水产品中氯硝柳胺的前处理试剂盒及方法”，专利号为ZL201310355849.6进行，获得从肌肉中提取、净化后含氯硝柳胺可供HPLC-MS/MS检测的液体。

I、血浆、肝脏、肌肉样品中氯硝柳胺的定值方法，采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)进行测定，HPLC-MS/MS仪器条件按照发明专利“一种检测水产品中氯硝柳胺的前处理试剂盒及方法”，专利号为ZL201310355849.6中仪器条件进行设定，获得团头鲂血浆、肝脏、肌肉组织中氯硝柳胺的残留量。

实施例2：

使用实施例1中方法浸泡团头鲂，氯硝柳胺浸泡后3h、5h、8h、18h、24h、72h、120h、168h、216h所采集的团头鲂血浆、肝脏、肌肉中氯硝柳胺残留浓度如表2所示。

表2不同时间团头鲂血浆、肝脏、肌肉中氯硝柳胺的浓度

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例3：

制备的团头鲂血浆、肝脏、肌肉基质标准物质均匀性检验

使用实施例1中的方法浸泡团头鲂，氯硝柳胺浸泡团头鲂后第120h采集5尾团头鲂的血液、肝脏、背部肌肉，每尾团头鲂采集血液5mL，共取25mL，并将采集的血液放入事先用1％肝素钠水溶液润洗过的离心管中，4000r/min，离心5min，收集上层血浆于2支干净的10mL离心管中，共得到10mL血浆；每尾团头鲂采集肝脏2g，共取10g，共取10g，放于小塑料封口袋中，用手在袋外将袋内肝脏组织碾碎，混匀后-20℃冷冻保存，有效期为3个月；每尾团头鲂采集背部肌肉100g，共取500g，去皮后切成小块，用匀浆机将团头鲂肌肉匀质，-20℃冷冻保存，有效期为3个月；血浆、肝脏和肌肉样品前处理和样品中氯硝柳胺的检测按照实施例1的方法进行，检测结果见表3。

表3团头鲂血浆、肝脏、肌肉组织中氯硝柳胺基质标准物质均匀性检测结果

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例4：

将采集的团头鲂血浆、肝脏、肌肉样品在-20℃条件下储存10d、30d、60d、90d后，血浆、肝脏、肌肉中的氯硝柳胺的检测按照实施例1的方法进行，检测结果见表4和表5。

表4团头鲂血浆、肝脏、肌肉组织中氯硝柳胺基质标准物质稳定性检测结果

表5团头鲂血浆、肝脏、肌肉-20℃保存90d后氯硝柳胺的检测值与进行均匀性检测获得的氯硝柳胺平均初始值的变化率

样品名称-20℃保存90d组织中氯硝柳胺变化率血浆(22.51-22.49)÷22.51＝0.09％肝脏(229.47-229.38)÷229.47＝0.04％肌肉(2.52-2.51)÷2.52＝0.40％

其它实施步骤与实施例1相同。