南五味子提取物在制备肝再生药物中的应用

摘要

本发明公开了南五味子提取物在制备肝再生药物中的应用。所述的南五味子提取物为南五味子的干燥果实的醇提取物浸膏，主要有效成分为五味子酯甲和五味子甲素。本发明利用小鼠部分肝切除模型，协同给予南五味子提取物，结果显示，南五味子提取物具有可显著提高肝/体重比快速恢复能力和提高肝细胞快速增殖能力的特性，机制涉及显著激活细胞周期相关蛋白表达，表现为显著上调细胞周期素Cylin？D1和PCNA蛋白，同时对肝组织炎症浸润和肝细胞水肿有明显改善。实验结果表明，南五味子提取物为肝切除术后的肝再生提供了新的方法和治疗手段。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及南五味子提取物在制备肝再生药物中的应用。

背景技术

肝切除和活体肝移植是目前世界范围内最有效的治疗肝癌和终末期肝病的方法。在临床应用中，肝切除和活体肝移植之所以可行的原因是肝细胞独特、强大的再生能力。然而，患者接受手术后，如果剩余肝脏缺乏再生能力、延缓再生能力或者再生能力弱，会引起多种不良的综合病症，如手术后急性肝衰竭、脓毒性感染，腹水，出血，肾衰竭或肝性脑病。其中，手术后出现的急性肝衰竭仍然是导致术后死亡率的主要原因，并直接关系到患者预后的好坏。

肝再生机制极其复杂，近几十年来，国内外对有关肝再生过程机制研究进展较快，但是在西医领域尚缺乏调控肝再生的有效手段。目前，仅局限于基础实验水平上的肝再生促进剂，例如转化生长因子-α、肝细胞生长因子、表皮生长因子等增殖因子，或者亮氨酸、谷氨酸、缬氨酸等氨基酸，干细胞、血小板、抗血管舒缓抗体、血栓形成素等。因此，如何选择性使剩余静息肝细胞有效地激发残余肝细胞的再生潜能而又同时抑制肝癌细胞增殖是术后病人得以存活的关键,也对肝脏疾病的治疗具有重要的理论意义和临床应用价值。

南五味子SchisandrasphenantheraRehd.etWils.为人们常用中药，性温、气味酸，具有敛肺滋肾、生津止汗、宁心安神的功效，主要用于治疗久咳虚喘、久泻不止、津少口干、盗汗、气短脉虚、健忘失眠等。随着药理学的深入发展，发现南五味子具有抗炎、提高免疫功能、扩张血管、抗衰老、镇静、抗癌等药理作用，以及护肝作用。但是目前未见南五味子提取物在肝切除术后促进肝再生方面的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有肝切除和活体肝移植后肝再生技术的不足，目的是提供南五味子提取物在制备肝再生药物中的应用。本发明人研究显示，南五味子提取物能够选择性对肝切除术后肝脏的再生能力具有显著的促进作用，为临床调控肝切除术或肝移植后的肝再生提供了新的方法和手段。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

南五味子提取物在制备肝再生药物中的应用，所述南五味子提取物为南五味子的干燥果实的醇提取物浸膏。

作为一种可实施的优选方案，上所述南五味子提取物的制备方法如下：

S1.称取南五味子的干燥果实，加6～10倍量的水煎煮0.5～2h，过滤去除滤液，得药渣；

S2.药渣烘干后粉碎，用6～10倍量的70%乙醇回流提取2～3次，每次1～2h，过滤，合并滤液，浓缩，即得南五味子提取物浸膏。

优选地，步骤S1所述水的量为南五味子干燥果实的8倍。

优选地，步骤S1所述煎煮的时间为1h。

优选地，步骤S2所述70%乙醇的量为药渣的8倍。

优选地，步骤S2所述回流提取2次，每次1.5h。

进一步优选地，所述南五味子提取物中五味子酯甲和五味子甲素的质量分数均不低于2.5%。

另外，上述肝再生药物是指能够促进肝切除术或肝部分切除术后肝再生的药物。

更进一步地，上述肝再生药物是指能够提高肝/体重比恢复能力的药物。

具体优选地，所述肝再生药物是指能够提高肝切除术或肝部分切除术后肝/体重比恢复能力的药物。

更进一步地，所述肝再生药物是指能够提高肝细胞增殖能力的药物。

具体优选地，所述肝再生药物是指能够提高肝切除术或肝部分切除术后肝细胞增值能力的药物。

更具体地，上述肝再生药物能够选择性使剩余静息肝细胞有效地激发残余肝细胞的再生潜能而又同时抑制肝癌细胞增殖。

本发明上述肝再生药物能够用于治疗已经接受肝切除/或部分肝移植的患者。

上述肝再生药物的机制涉及快速上调细胞周期素cyclinD1和PCNA表达，从而促进肝细胞增殖。

一种肝再生药物，包括上述南五味子提取物和药物载体。

优选地，所述药物载体为填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、矫味剂、润滑剂或防腐剂中的一种或多种。

更优选地，所述的填充剂为淀粉、糊精、糖粉、乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙或糖醇类。

优选地，所述的粘合剂为淀粉浆、明胶、聚维酮或纤维素衍生物。

优选地，所述的湿润剂为水和乙醇。

优选地，所述的崩解剂为干淀粉、羧甲淀粉钠、羧甲纤维素钠、碳酸氢钠或聚维酮。

优选地，所述的矫味剂为甜菊苷、糖精钠、蛋白糖或甜蜜素。

优选地，所述的润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、滑石粉、聚乙二醇或十二烷基硫酸镁。

优选地，所述的防腐剂为苯甲酸、山梨酸或尼泊金。

另外，优选地，所述的肝再生药物的剂型包括片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂等。

优选地，所述药物的剂型还可以是缓释剂或控释剂。

在本发明研究结果之前的现有技术中，虽然有报道五味子提取物及其有效成分之一五味子醇乙能显著预防和治疗扑热息痛或石胆酸所致的肝毒性的部分机制是促进肝细胞增殖相关蛋白表达。但是，一方面扑热息痛或胆汁淤积引起的肝毒性症状与肝切除术引起的急性肝损伤存在本质区别，有研究表明，扑热息痛肝毒性是由其N-乙酰-对-苯醌亚胺启动的，其会使肝内源性谷胱甘肽耗竭，从而导致线粒体功能混乱和核内DNA损伤，最终引起肝细胞损害和肝坏死；石胆酸肝毒性是由于过量毒性胆汁酸潴留引起的，其会导致毒性物质蓄积如胆红素、胆固醇及胆汁酸从而伴随肝功能发生障碍、肝纤维化甚至肝硬化。而肝切除术是将肝中的病灶部分切除，剩余正常的肝组织会立即启动静息肝细胞增殖，会很快改善肝损伤情况，达到原有肝重则终止增殖行为。另一方面其报道的五味子提取物有效成分与本发明的南五味子干燥果实醇提取物的有效成分不同。

本发明所述的南五味子提取物（南五味子的干燥果实提取物，主要有效成分为五味子酯甲和五味子甲素）能够显著促进肝/体重比快速恢复以及促进肝细胞快速增殖，而且其在肝切除后促进肝再生的机制涉及快速上调细胞周期素CyclinD1和PCNA表达，从而促进肝细胞增殖。

本发明具有以下有益效果：

本发明实验利用经典的2/3肝切除模型，给予南五味子提取物后，能有效地加快肝重和功能的恢复，具体表现为在肝切除术后2天、3天和5天，小鼠的肝体重比显著升高；在肝切除术后1天、1.5天，小鼠处于增殖的肝细胞显著增多，随后逐渐减少；同时肝组织中的炎症浸润和细胞水肿情况明显改善。

另外，本发明还观察了南五味子对正常肝生长的影响，结果发现南五味子对正常的肝脏生长没有影响。

综上所述结果表明，南五味子提取物能够选择性对肝切除术后肝脏的再生能力具有显著的促进作用，为临床调控肝切除术或肝移植后的肝再生提供了新的方法和手段。

附图说明

图1为南五味子提取物对部分肝切除的小鼠和正常小鼠肝/体重比的影响结果图。

图2为南五味子提取物对部分肝切除的小鼠肝细胞炎症浸润和水肿的影响结果图（H&E染色肝脏病理切片）。

图3为南五味子提取物对部分肝切除的小鼠肝细胞增殖的影响结果图（Ki67免疫组化的肝脏病理切片）。

图4为南五味子提取物对部分切除的小鼠肝脏CylinD1和PCNA的蛋白表达的影响结果图。

图1~4中，A为肝切除术组，B为肝切除术/南五味子提取物组，C为假手术组，D为假手术/南五味子提取物组。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1南五味子提取物的制备

取南五味子100g，加8倍量的水煎煮lh，过滤去除滤液，药渣烘干后粉碎，用8倍量的70%乙醇回流提取2次，每次1.5h，过滤，合并滤液，浓缩，即得南五味子提取物浸膏。

实施例2南五味子提取物的制备

取南五味子100g，加6倍量的水煎煮0.5h，过滤去除滤液，药渣烘干后粉碎，用6倍量的70%乙醇回流提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，浓缩，即得南五味子提取物浸膏。

实施例3南五味子提取物的制备

取南五味子100g，加10倍量的水煎煮2h，过滤去除滤液，药渣烘干后粉碎，用10倍量的70%乙醇回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，浓缩，即得南五味子提取物浸膏。

实施例4南五味子提取物对肝切除术后肝再生的作用研究

本实验以实施例1所制备的南五味子提取物为例，研究其对肝切除术后肝再生的作用。

1、实验处理

（1）动物模型：C57BL/6小鼠，雄性，8-10周龄，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证证号为SYXK(粤)2011-0112。

（2）饲养条件：在标准实验条件下饲养：温度（23±2℃），湿度（55±10%），12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。

（2）实验分组：小鼠随机分成4组：

A组：肝切除术组；

B组：肝切除术/南五味子提取物组（以五味子酯甲计，9.2mg/kg，p.o.）；

C组：假手术组；

D组：假手术/南五味子提取物组（以五味子酯甲计，9.2mg/kg，p.o.）。

并在术后苏醒后开始给予含9.2mg/kg的五味子酯甲的南五味子提取物。其中假手术组及假手术/南五味子提取物组，试验过程中打开小鼠腹腔后进行缝合，但不进行肝切除。

小鼠给予南五味子提取物1天、1.5天、2天、3天、5天、7天、10天后处死。采集的肝脏进行组织病理学检查及分子机制研究。

2、肝重恢复指标的测定

按照学术界公认的肝/体重比公式来衡量肝重恢复：

。

结果如图1所示，可以看出，肝切除后，小鼠的肝/体重比随着时间的延长而逐渐增加，南五味子提取物则能显著提前加快肝切除小鼠的肝/体重比的恢复，2天、3天、5天时分别提高了16%、21%、20%，10天时几乎达到正常的肝/体重比。但是，单独给予南五味子提取物对正常小鼠（假手术）的肝脏生长没有影响。

上述结果表明南五味子提取物能选择性地促进肝切除术后肝重的恢复。

3、肝脏组织学分析

（1）肝脏组织H&E染色观察肝受损情况

肝组织经过10%中性福尔马林固定、组织修切、蒸馏水冲洗、脱水、石蜡包埋、常规切片得到4μm切片。再将切片脱蜡、染色、脱水、透明、封片进行光学显微镜观察肝细胞炎症浸润和水肿情况。结果如图2所示。

从图2可以看出，肝切除1天后，小鼠剩余肝叶中央静脉出现明显的炎症浸润和水肿。相比肝切除术组，南五味子提取物则显著改善肝切除术后小鼠的细胞炎症浸润和水肿情况。上述结果提示了南五味子提取物对肝切除后肝脏组织损伤具有一定的治疗作用。

（2）肝脏组织Ki67免疫组化染色观察肝细胞增殖情况

Ki-67是一种核蛋白质由MKI-67基因编码，又称之为MKI-67，在细胞增殖的各期（G1，S，G2和M）中均有表达，但在细胞静止期G0期不表达，用于提示细胞的增殖活跃程度。

将石蜡切片经过脱蜡水化、抗原修复、血清封闭、滴加Ki67一抗、PBS冲洗、滴加兔二抗、PBS冲洗、DAB显色、苏木素染色、脱水、封片得到Ki67病理免疫组化切。结果如图3所示。

从图3可以看出，肝切除后，小鼠肝细胞增殖随着时间增加，并在2天时达到增殖峰值，随后随着时间的延长逐渐减少。相比肝切除术组，南五味子提取物则显著提前提高肝切除术后肝细胞的增殖峰值，并根据生理需求提前终止肝细胞增殖。上述结果提示了南五味子提取物对肝切除后肝细胞再生具有显著促进作用。

4、CyclinD1和PCNA蛋白表达水平检测

采用总蛋白抽提试剂盒提取肝脏组织中的总蛋白，采用BCA法测定蛋白含量并进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜后，用5%脱脂奶粉室温封闭60分钟，CyclinD1兔单克隆抗体和PCNA兔单克隆抗体4℃孵育过夜；次日加兔二抗于室温孵育65分钟，电化学发光法显影、定影。用同样的方法进行内参GAPDH的蛋白表达分析。评价南五味子提取物是否促进CyclinD1和PCNA的表达，从而促进肝细胞增殖。结果如图4所示。

从图4可以看出，肝切除后，小鼠肝脏中CyclinD1和PCNA蛋白表达随着时间增加，并在2天时达到增殖峰值，随后随着时间的延长逐渐减少。相比肝切除术组，南五味子提取物则显著提前增加肝切除术后小鼠肝细胞的CyclinD1和PCNA蛋白表达。

上述结果提示了南五味子提取物对肝切除后肝细胞再生促进作用的机制涉及对细胞周期相关蛋白CyclinD1和PCNA表达的显著促进作用。

实施例5肝切除术后肝再生药物

1、经过实验证实，包括南五味子提取物的药物，具有很好的提高肝/体重比快速恢复能力和提高肝细胞快速增殖能力的特性，机制涉及显著激活细胞周期相关蛋白表达，表现为显著上调细胞周期素CylinD1和PCNA蛋白，同时对肝组织炎症浸润和肝细胞水肿有明显改善。因此该药物是一种新的肝切除术后的肝再生药物。

2、上述包括南五味子提取物的肝再生药物，还可以包含药物载体。

所述药物载体可以为填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、矫味剂、润滑剂或防腐剂中的一种或多种。

其中，所述的填充剂可以为淀粉、糊精、糖粉、乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙或糖醇类。

所述的粘合剂可以为淀粉浆、明胶、聚维酮或纤维素衍生物。

所述的湿润剂可以为水和乙醇。

所述的崩解剂可以为干淀粉、羧甲淀粉钠、羧甲纤维素钠、碳酸氢钠或聚维酮。

所述的矫味剂可以为甜菊苷、糖精钠、蛋白糖或甜蜜素。

所述的润滑剂可以为硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、滑石粉、聚乙二醇或十二烷基硫酸镁。

所述的防腐剂可以为苯甲酸、山梨酸或尼泊金。

另外，所述的肝再生药物的剂型可以为片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂等，还可以是缓释剂或控释剂。

上述各种类型的肝再生药物可根据本领域常规方法制备获得，且对肝切除术/部分切除术后的肝再生具有显著的促进作用，可以用于治疗已经接受肝切除/或部分肝移植的患者。