一种高抗霉活性抗菌脂肽V7-surfactin的制备方法

摘要

一种高抗霉活性抗菌脂肽V

说明书

技术领域

本发明涉及一种高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin的制备方法，尤其是涉及一种以纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto）为菌种，采用固态发酵法制备高抗霉活性V₇-surfactin（其结构简式为：Cyclo（C₁₄BOHFA-E₁-I/L₂-I/L₃-V₄-D₅-I/L₆-V₇），分子量为1008Da）的方法。

背景技术

目前，市场上常见的抗霉菌类药物多以化学药物为主。天然抗霉产物及生物制品往往存在抗霉活性低、药效不持久等问题，很难投入商业化应用。长期使用化学药物导致霉菌产生的耐药性问题及化学药物对机体和环境的毒副作用，使得寻求和开发高效、绿色的新型生物源抗霉活性物质成为必然。

抗菌脂肽Surfactin是由芽孢杆菌所产生的细菌源环脂肽，又称表面活性剂或表面活性肽。天然surfactin大多是由枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）产生的A、B、C、D四种亚型的混合物。他们通常是由含7个氨基酸的缩肽和碳原子数为13-16的β-羟基脂肪酸组成的环状结构[结构简式为：Cyclo(CnBOHFA-E₁-L₂-L₃-V₄-D₅-L₆-L₇),n取13-16，简称L₇-surfactin]。因具有抗菌防霉、消炎、抑制肿瘤细胞增殖等多种功能，surfactin在食品、医药、化妆品等多个领域中取得了广泛关注，具有重大的研究意义和应用价值。而多数文献资料中报道的surfactin为7位氨基酸是亮氨酸（L）的常见surfactin类型，而7位氨基酸为缬氨酸(V)的V₇-surfactin却罕见有相关报道。

纳豆芽孢杆菌（B.natto）又简称纳豆菌，由于来源于传统发酵食品纳豆，在安全性方面更加值得信赖。在分类上，纳豆菌被认为是枯草芽孢杆菌亚种（B.subtilissubsp.natto）,然而其所产抗菌脂肽在种类和数量上都与枯草芽孢杆菌存在明显差别。关于纳豆菌的研究，以往多集中在产生具有溶血栓功能的纳豆激酶上。迄今为止，未见有利用纳豆菌发酵制取高抗霉活性V₇-surfactin的相关文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin的制备方法，以纳豆芽孢杆菌为菌种，用固态发酵法制取高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin[结构简式为：Cyclo（C₁₄BOHFA-E₁-I/L₂-I/L₃-V₄-D₅-I/L₆-V₇）]。

所述纳豆芽孢杆菌（B.natto）分离自市售的纳豆或纳豆菌菌粉，分离方法为：无菌条件下取纳豆2-3粒或纳豆芽孢杆菌菌粉0.5-1g，放入10mL的试管无菌水中，充分震荡至水稍变浑浊。按微生物菌种划线分离的基础操作，用无菌接种环沾取变浊后的水一环，在牛肉膏蛋白胨平板上分区划线。然后将平板倒置于35-37℃恒温培养箱中培养48h，平板上长出白色，边缘不整齐，质粘，挑起时可形成细长拉丝的菌落，即为B.natto。镜检确保不含杂菌后，挑取单个B.natto菌落接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，35-37℃恒温培养60-72h，即得纳豆芽孢杆菌（B.natto）斜面菌种。

本发明之高抗霉活性抗菌脂肽V₇-surfactin的制备方法，包括以下步骤：

（1）纳豆芽孢杆菌（B.natto）种子液的制备（现有技术）：按照牛肉膏2-4g、蛋白胨8-12g、NaCl5-8g、水1L的配方来配制种子培养基，用质量浓度为5-10%的HCl或NaOH调节培养基的初始pH值为6.8-7.0，121℃灭菌20-30min，冷却；用接种环挑取活化后的纳豆芽孢杆菌斜面菌种，按2-3环菌种/50mL培养基的接种量接入灭菌冷却后的种子培养基中；32-35℃，150-180rpm震荡培养24-30h；得纳豆芽孢杆菌（B.natto）种子液；

（2）按照以下配方制备发酵培养基：葡萄糖20-40g，酵母浸出粉1-5g，大豆蛋白胨4-6g，Na₂HPO₄1-2g，KH₂PO₄0.5-1.5g，丙氨酸（Ala）0.2-0.6g，谷氨酸(Glu)0.2-0.8g，天冬氨酸(Asp)0.2-0.8g，缬氨酸（Val）0.2-4.0g，琼脂粉15-20g，水1L；pH6.3-6.8，121℃灭菌20-30min，得发酵培养基；

（3）接种、发酵：将步骤（2）所得发酵培养基冷却至45-50℃，在无菌条件下将培养基倒入无菌的培养皿中，培养基厚度控制在2-3mm；静置5-10min，待培养基凝固后，按照0.02－0.08mL种子液/9cm直径培养皿的接种量接入步骤（1）所得纳豆芽孢杆菌种子液，并用无菌的涂布棒将种子液在培养基表面涂布均匀；再置于28-35℃，相对湿度70-85%条件下发酵培养48-96h；

所述0.02－0.08mL种子液/9cm直径培养皿的接种量，其含义为：当使用的培养皿直径为9cm时，种子液的接种量为0.02－0.08mL；当使用的培养皿直径不为9cm时，按照培养皿的面积，相应确定种子液的接种量；以下同；

步骤（4）和步骤（5）为V₇-surfactin的提纯步骤：

（4）V₇-surfactin的提取：发酵结束后，将体积浓度为90-100%的甲醇按照4-5mL甲醇/9cm直径培养皿的量喷入培养物表面，常温下浸提3-5min；重复浸提操作2-3次，合并各次浸提液；将浸提液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/10-1/5，得提取浓缩液；

（5）V₇-surfactin的制备：将步骤（4）所得提取浓缩液过0.22μm或0.45μm滤膜或经固相萃取预处理（固相萃取优选采用C18固相萃取柱），再用制备型HPLC分离。HPLC条件为：粒径2.7-5μm的C18或C8制备柱，紫外检测器，检测波长为210或215nm。流动相A为水，B为乙腈或甲醇或两者混合液，洗脱梯度为5-95%，洗脱时间20-60min。收集对应峰值的洗脱物，旋转蒸发去除有机溶剂，40-50℃条件下低温干燥至恒重，得到白色固体，即为V₇-surfactin。

采用本发明之制备方法，所得V₇-surfactin产品得率为800-1100mg/L培养基，纯度为85-99%。

采用本发明所得之V₇-surfactin对黑曲霉（A.niger）、黄曲霉（A.flavus）、烟曲霉（A.fumigatus）、根霉（Rhizopussp.）等多种霉菌进行抗霉活性测试。抗霉活性测试结果表明：V₇-surfactin对黑曲霉（A.niger）、黄曲霉（A.flavus）、烟曲霉（A.fumigatus）、根霉（Rhizopussp.）等多种霉菌均具有较强的抑制作用。

在采用HPLC进行样品的分离纯化研究过程中还发现，在以水作为流动相A、甲醇与乙腈混合液作为流动相B进行产物的梯度洗脱时，V₇-surfactin明显比其他surfactin同系物组分较早洗脱下来（见附图1），从而易于和其他surfactin同系物分开，便于制得纯度较高的V₇-surfactin单体。

采用本发明之固态发酵法生产V₇-surfactin，发酵结束后可直接在培养物表面喷淋甲醇浸提制得surfactin粗提物，工艺步骤简单，所得粗提物中色素等干扰性物质含量低，利于后期分离纯化。

本发明所用菌种B.natto为传统发酵豆制品纳豆的生产菌。作为一种发酵食品，含活菌的纳豆可不限量供人食用。因此，用纳豆菌发酵生产的surfactin具有更高的安全性，其应用范围更广。

附图说明

图1为本发明之B.natto固体发酵产物的HPLC图；

其中，42min对应峰值为V₇-surfactin，50-53.5min对应峰值分别为C原子数13-15的L₇-surfactin。

HPLC条件为：Shimadazu20AHPLC系统，2.7μmHalosC184.6mm*150mm色谱柱，流动相A为含0.04%TFA的超纯水，流动相B为含0.04%TFA的乙腈与甲醇体积比为5:1的混合液，流速为1mL/min，洗脱梯度为5%B-95%B(40min)。

图2为纳豆菌产V₇-surfactin的二级质谱和三级质谱图；

其中，1008^[M+H]为Cyclo(C₁₄BOHFA-E₁-I/L₂-I/L₃-V₄-D₅-I/L₆-V₇)，解析如下:

1008(b₈)-V₇-909(b₇)-I/L₆-796(b₆)-D₅-681(b₅)-V₄-582(b₄)-I/L₃-469(b₃)-I/L₂-356(b₂:HO-C₁₄BOHFA-E₁-CO⁺)

1008(y₈)-C₁₄BOHFA-782(y₇)-E₁-653(y₆)-I/L₂-540(y₅)-I/L₃-427(y₄)-V₄-328(y₃)-D₅-213(y₂:H₂N-I/L₆-V₇-CO⁺)

荷质比671为H₃N⁺-I/L₂-I/L₃-V₄-D₅-I/L₆-V₇-COOH片段：

671(b₆)-(H-V₇-OH)-554(b₅)-I/L₆-441(b₄)-D₅-326(b₃)-V₄-227(b₂:H₂N-I/L₂-I/L₃-CO⁺)

671(y₆)-I/L₂-558(y₅)-I/L₃-445(y₄)-V₄-346(y₃)-D₅-231(y₂:H₃N⁺-I/L₆-V₇-COOH)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

各实施例中，所述纳豆芽孢杆菌（B.natto）分离自市售的纳豆或纳豆菌菌粉，分离方法为：无菌条件下取纳豆2粒或纳豆芽孢杆菌菌粉0.5g，放入10mL的试管无菌水中，充分震荡至水稍变浑浊。按微生物菌种划线分离的基础操作，用无菌接种环沾取变浊后的水一环，在牛肉膏蛋白胨平板上分区划线。然后将平板倒置于35-37℃恒温培养箱中培养48h，平板上长出白色，边缘不整齐，质粘，挑起时可形成细长拉丝的菌落，即为B.natto。镜检确保不含杂菌后，挑取单个B.natto菌落接种于牛肉膏蛋白胨斜面上，35-37℃恒温培养72h，即得纳豆芽孢杆菌（B.natto）斜面菌种。

实施例1

本实施例包括以下步骤：

（1）B.natto种子液的制备：称取牛肉膏3g、蛋白胨8g、NaCl5g溶于1L水中，用质量浓度5%的HCl或NaOH调节培养基pH至6.8，按50mL/250mL三角瓶的分装量将种子培养基分装入250mL三角瓶中，封口膜封口，121℃灭菌20min，冷却；用接种环挑取活化后的纳豆芽孢杆菌斜面菌种，向每瓶灭菌后冷却的种子培养基中接入2环活化后的B.natto斜面菌种。32℃，150rpm震荡培养30h；得纳豆芽孢杆菌（B.natto）种子液；

（2）按照以下配方制备发酵培养基：葡萄糖20g，酵母浸出粉1g，大豆蛋白胨4g，Na₂HPO₄1g，KH₂PO₄0.5g，Ala0.6g，Glu0.2g，Asp0.2g，Val0.2g，琼脂粉20g，水1L，pH6.8，121℃灭菌20min，得发酵培养基；

（3）接种、发酵：将步骤（2）所得发酵培养基冷却至50℃时，在无菌条件下将培养基倒入无菌的培养皿中，培养基厚度控制在3mm；静置10min，待培养基凝固后，按照0.05mL种子液/9cm直径培养皿的接种量接入步骤（1）所得B.natto种子液，用无菌的涂布棒将种子液在培养基表面涂布均匀；再置于30℃，相对湿度70%条件下发酵培养72h。

步骤（4）和步骤（5）为V₇-surfactin的提纯步骤：

（4）V₇-surfactin的提取：发酵结束后，将体积浓度为100%的甲醇按照5mL甲醇/9cm直径培养皿的量喷入培养物表面，常温浸提5min；重复浸提操作3次，合并各次浸提液；将浸提液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/5，得提取浓缩液；

（5）V₇-surfactin的制备：将步骤（4）所得提取浓缩液过0.22μm滤膜，所得滤液经制备型HPLC分离制备。HPLC条件为：粒径3μm的C18制备柱，紫外检测器，检测波长为215nm。流动相A为水，B为乙腈：甲醇=5:1（体积比）的混合液，洗脱梯度为5-95%，洗脱时间40min。收集有机相浓度为70%-80%区间对应峰值的洗脱物，旋转蒸发去除有机溶剂，40℃条件下低温干燥至恒重，得到白色固体，即为V₇-surfactin。

本实施例中，所得V₇-surfactin产品得率为1100mg/L培养基，纯度为90%。

实施例2

本实施例包括以下步骤：

（1）B.natto种子液的制备：按照牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、水1L的配方来配制种子培养基，用质量浓度5%的HCl或NaOH调节培养基初始pH为6.9，按50mL/250mL三角瓶的分装量将种子培养基分装入250mL三角瓶中，封口膜封口，121℃灭菌20min。用接种环挑取活化后的B.natto斜面菌种，按3环菌种/50mL培养基的接种量接入灭菌冷却后的种子培养基中。33℃，160rpm震荡培养27h；得纳豆芽孢杆菌（B.natto）种子液；

（2）按照以下配方制备发酵培养基：葡萄糖30g，酵母浸出粉3g，大豆蛋白胨5g，Na₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄1.0g，Ala0.3g，Glu0.5g，Asp0.5g，Val1.0g，琼脂粉18g，水1L，pH6.4，121℃灭菌20min，得发酵培养基；

（3）接种、发酵：将步骤（2）所得发酵培养基冷却至50℃，在无菌条件下将培养基倒入无菌的培养皿中，培养基厚度2.5mm；静置5min，培养基凝固后，按照0.03mL种子液/9cm直径培养皿的接种量接入步骤（1）所得B.natto种子液，用无菌的涂布棒将种子液在培养基表面涂布均匀；再置于30℃，相对湿度80%条件下发酵培养60h。

步骤（4）和步骤（5）为V₇-surfactin的提纯步骤：

（4）V₇-surfactin的提取：发酵结束后，将体积浓度为95%的甲醇按照4mL甲醇/9cm直径培养皿的量喷入培养物表面，常温下浸提4min；重复浸提操作3次，合并各次浸提液；将浸提液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/5，得提取浓缩液；

（5）V₇-surfactin的制备：将步骤（4）所得提取浓缩液过0.45μm超滤膜，所得滤液经制备型HPLC分离。HPLC条件为：粒径5μm的C18制备柱，紫外检测器，检测波长为210nm。流动相为A为水，B为乙腈，洗脱梯度为5-95%，洗脱时间60min。收集有机相浓度为75%-80%区间对应峰值的洗脱物，旋转蒸发去除有机溶剂，50℃低温干燥样品至恒重，得到白色固体，即为V₇-surfactin。

本实施例中V₇-surfactin产品得率为1000mg/L培养基，纯度为85%。

实施例3

本实施例包括以下步骤：

（1）B.natto种子液的制备：按照牛肉膏3g、蛋白胨12g、NaCl5g、水1L配方来制备种子培养基，用质量浓度为10%的HCl或NaOH调节培养基的初始pH为7.0。按50mL/250mL三角瓶的分装量将种子培养基分装入250mL三角瓶，封口膜封口，121℃灭菌20min，冷却；用接种环挑取活化后的B.natto斜面菌种3环接入每瓶灭菌冷却后的种子培养基中；35℃，180rpm震荡培养30h；得纳豆芽孢杆菌（B.natto）种子液；

（2）按照以下配方制备发酵培养基：葡萄糖40g，酵母浸出粉5g，大豆蛋白胨6g，Na₂HPO₄2g，KH₂PO₄1.5g，Ala0.2g，Glu0.8g，Asp0.8g，Val4.0g，琼脂粉20g，水1L，pH6.3-6.8，121℃灭菌20min，得发酵培养基；

（3）接种、发酵：将步骤（2）所得发酵培养基冷却至50℃，在无菌条件下将培养基倒入无菌的培养皿中，培养基厚度控制在2mm；静置10min，待培养基凝固后，按照0.02mL种子液/9cm直径培养皿的接种量接入步骤（1）所得B.natto种子液，并用无菌的涂布棒将种子液在培养基表面涂布均匀；再置于32℃，相对湿度85%条件下发酵培养66h；

步骤（4）和步骤（5）为V₇-surfactin的提纯步骤：

（4）V₇-surfactin的提取：发酵结束后，将体积浓度为100%的甲醇按照5mL甲醇/9cm直径培养皿的量喷入培养物表面，常温浸提3min；重复浸提操作2次，合并浸提液；将浸提液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/5，得浸提浓缩液；

（5）V₇-surfactin的制备：加水调整步骤（4）所得浓缩液中甲醇含量为10%，经WatersC18固相萃取柱萃取，100%甲醇洗脱吸附物，所得洗脱液经制备型HPLC分离。HPLC条件为：粒径3μm的C18制备柱，紫外检测器，检测波长为215nm。流动相为A为水，B为乙腈：甲醇=5:1（体积比）的混合液，洗脱梯度为5-95%，时间40min。收集有机相浓度为70%-75%区间对应峰值的洗脱物，旋转蒸发去除有机溶剂，45℃低温干燥样品至恒重，得到白色固体，即为V₇-surfactin。

本实施例所得V₇-surfactin产品得率为1100mg/L培养基，纯度为99%。

实施例4

应用实施例

采用本发明实施例所得之V₇-surfactin对黑曲霉（A.niger）、黄曲霉（A.flavus）、烟曲霉（A.fumigatus）、根霉（Rhizopussp.）等多种霉菌进行抗霉活性测试。抗霉活性测试结果表明：V₇-surfactin对黑曲霉（A.niger）、黄曲霉（A.flavus）、烟曲霉（A.fumigatus）、根霉（Rhizopussp.）等多种霉菌均具有较强的抑制作用。V₇-surfactin和L₇-surfactin对几种霉菌的最小抑菌浓度（MIC）见表1。MIC测定方法参考DanielMania,KaiHilpert,SergeRuden等人的方法。（DanielMania,KaiHilpert,SergeRuden,etal.ScreeningforAntifungalPeptidesandTheirModesofActioninAspergillusnidulans.AppliedandEnvironmentalMicroiology,2010,11:7102-7108.）

由表1可见，V₇-surfactin对几种受试霉菌的MIC值比L₇-surfactin的对应值均有不同程度的降低，下降倍数在0.9-2.5之间。

（注：所用V₇-surfactin采用本申请方法制得，纯度为95wt%；L₇-surfactin为相同纯度市售标准品；MIC值是三次实验测得的平均值±标准差。）

在采用HPLC进行样品的分离纯化研究过程中还发现，在以水作为流动相A、甲醇与乙腈混合液作为流动相B进行产物的梯度洗脱时，V₇-surfactin明显比其他surfactin同系物组分较早洗脱下来（见附图1），从而易于和其他surfactin同系物分开，便于制得纯度较高的V₇-surfactin单体。