一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcAls1及其应用

摘要

一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcAls1及其应用属微生物基因工程技术领域，本发明提供的来自灰霉病菌的控制致病性的基因BcAls1，其DNA序列如SEQ？ID？No:1所示，由1918个核苷酸组成；提供的BcAls1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ？ID？No:2所示，由616个氨基酸组成；BcAls1基因可在植物抗灰霉病基因工程领域中应用；通过对灰霉病菌控制致病性的蛋白质BcAls1进行缺失、突变或修饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。

说明书

技术领域

本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌致病性的 基因及其编码蛋白质的应用。

背景技术

灰霉病菌(Botrytiscinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门(Ascomycota) 真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、 挂果期到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表 现为“V”形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和 蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20℃-23℃，相对湿度90％以上时发生严重。因 此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病 导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分 子研究技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。

灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包 括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等， 这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然 条件下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、 分生孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染 来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的 分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子 萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要 从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。

当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形 成的附着胞侵入；伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓 1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将 会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防 御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望 成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因 子(如毒素)来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子 机制仍所知甚少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子， 不仅有助于揭示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可 以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理 论和技术基础。

Als1是一种氨基酮戊酸合成酶，参与催化血红素合成途径的第一步反应。该蛋白 广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等生物，由于血红素可以作为众多蛋白的辅基参与多种 生命过程，因此，作为催化血红素合成酶类之一的Als1蛋白质具有重要的功能。Als1蛋白质 在灰霉病菌中同样存在，而且功能尚未获得鉴定，通过分析灰霉病菌Als1编码基因的致病 功能，评价该基因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛 选新型杀真菌药剂。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种控制致病性的基因及其编码的蛋白质。

本发明所提供的控制致病性基因来源于灰霉病菌，名称为BcAls1，其DNA序列如 SEQIDNo:1所示。该DNA序列为BcAls1基因开放阅读框，由1918个核苷酸组成，其中包含2 个外显子，分别位于SEQIDNo:1的5’端第1位至337位核苷酸之间和第405位至1918位核苷 酸之间，组成的编码区长度合计为1851个核苷酸。

本发明提供了BcAls1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，该 序列由616个氨基酸组成。

来自灰霉病菌的控制致病性基因BcAls1可应用于植物抗灰霉病基因工程领域。

对来自灰霉病菌的控制致病性基因BcAls1所编码的蛋白质进行缺失、突变或修 饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。

本发明证明了BcAls1基因的缺失或突变，导致灰霉病菌致病力显著降低，说明 BcAls1基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达 与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新 型杀菌剂，即本发明所提供的BcAls1基因的一个重要用途是：该基因的表达与其编码的蛋 白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗真菌药剂(特别是抗灰 霉病菌药剂)的设计和筛选。

附图说明

图1为BcAls1蛋白质的结构域分析示意图

其中：5-aminolevulinatesynthase为氨基酮戊酸合成酶结构域；

图2为灰霉病菌BcAls1基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图

其中：WT为野生型菌株B05.10，pAls1-ko为敲除载体，BcAls1-KO为BcAls1基因缺 失突变体；

图3为BcAls1基因缺失突变体及遗传互补菌株的PCR验证电泳图

其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2；M1为BcAls1基因缺失突变体；M1/Als1 为在突变体M1基础上转入完整BcAls1基因的互补菌株；

图4为BcAls1基因的突变体与野生型菌株的致病力比较照片

其中：所选择寄主为番茄，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后进行评价； M1、M2为两株独立获得的BcAls1基因缺失突变体；

图5为BcAls1基因的突变体与对照菌株侵染寄主所产生病斑大小的定量分析示意 图

其中：接种方法同上，接种3天后对叶片病斑面积进行测量计算，换算成相对大 小。**表示在p<0.01水平上差异显著。

具体实施方式

为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例 中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1BcAls1基因的相关性分析

灰霉病菌BcAls1基因的开放阅读框由1918个核苷酸组成，包含2个外显子，编码区 cDNA全长为1851个核苷酸，编码的蛋白质产物由616个氨基酸组成。取BcAls1蛋白质序列进 行比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现Als1广泛存在于动物、植 物、真菌和细菌等细胞生物中。结构域分析发现，BcAls1蛋白质包含一个保守的氨基酮戊酸 合成酶结构域(见图1)。

实施例2BcAls1基因的敲除

1)敲除载体的构建

采用引物Als1-UP-F(5'-GAATTCATGGTGCTCGTATCGTTTGA-3')与Als1-UP-R(5'- GGTACCGCGGGATGATGGATTATTATGT-3')，以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增 BcAls1基因上游603bp片段，采用Als1-DN-F(5'-GGATCCTCCTCGGACCCAATACCAC-3')与Als1- DN-R(5'-AAGCTTCTTTAAGCGAGGTCACGGA-3')扩增灰霉病菌BcAls1基因下游911bp片段，反应 体系为：10mmol/LdNTPMixture，0.5μL；10×PCRbuffer，2.5μL；上下游引物各1μL(10μ mol/mL)；模板DNA，1μL；Ex-Taq，0.2μL(5U)；ddH₂O，18.8μL；扩增程序为：94℃预变性3分钟， 然后(1)94℃，变性50秒；(2)58℃，退火50秒；(3)72℃，延伸60秒；(4)循环30次；(5)72℃延 伸10分钟。将上述两段DNA扩增产物先后克隆至pXEH载体的EcoRI、KpnI位点与BamHI、 HindIII位点，构建成敲除载体pAls1-ko(见图2)，并进行测序验证。

2)灰霉病菌的转化

a.农杆菌的培养

挑取含有双元载体pAls1-ko的根癌农杆菌菌株Agl-1单菌落，接种至含50μg/ml卡 那霉素、10μg/ml利福平的MM液体培养基(磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠 0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％， 葡萄糖0.2％)中，250rpm、28℃振荡培养48h；4000rpm，离心5分钟，弃上清，IM液体培养基 (磷酸氢二钾0.205％，磷酸二氢钾0.145％，氯化钠0.015％，七水硫酸镁0.05％，六水氯化 钙0.01％，七水硫酸亚铁0.00025％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.2％，200μMAS，MES0.854％， 甘油0.5％)重悬，4000rpm离心5分钟，弃上清；IM培养基重悬，28℃，250rpm振荡培养6h，进 行预诱导。

b.灰霉病菌的产孢培养

选用B05.10菌株，取少量孢子涂布于PDA培养基(马铃薯20％煮烂过滤，葡萄糖 2％，琼脂1.5％)，置28℃培养8h令孢子快速萌发，然后转移至20℃培养3-5天，待菌体表面 被灰色孢子覆盖之后，用IM液体培养基刮取、收集孢子，显微镜观察，利用血球计数器调节 孢子浓度为1×10⁶/mL。

c.根癌农杆菌与灰霉病菌分生孢子共培养及转化子筛选

将在IM液体培养基中预先诱导6h的农杆菌菌液和灰霉病菌孢子液等体积混合，加 入AS，使终浓度达到500μM，混匀，然后按250～350μL/皿，均匀涂抹至铺有玻璃纸的IM培养 基上，22℃黑暗培养48h；共培养完毕后，将玻璃纸转移至含有100μg/mL潮霉素的PDA培养基 上，相同条件下继续培养。4～7天后挑取扩展的菌落到含有同样抗生素的筛选培养基上。

3)缺失突变体的验证

选用两对引物通过PCR扩增对转化子进行筛选。扩增结果符合如下结果的，确定为 BcAls1基因缺失突变体：上游同源臂之外基因组上的引物a(5'-TGATGGGAAACCCTGGATG-3') 与潮霉素抗性基因的引物b(5'-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCA-3')配对可以扩增到预期大小 (1.3kb)的重组片段；而编码区引物c(5'-TATGGCCGACAAGAATGAG-3')与d(5'- GAACGGGAATGATGTGAGA-3')无扩增条带(野生型菌株可扩增到0.9kb片段)。结果，从转化子 中筛选到2株BcAls1基因缺失突变体：M1与M2菌株，用于后续功能分析(见图3)。

实施例3BcAls1基因缺失突变体的遗传互补

采用引物C-F(5'-GTCGACTGATGGGAAACCCTGGATG-3')与C-R(5'- GTCGACCTTTAAGCGAGGTCACGGA-3')，扩增灰霉病菌BcAls1基因全长3875bp(包含启动子、开 放阅读框与终止子)，先克隆至pMD18-t载体上，然后再亚克隆至pSULF载体(含有氯嘧磺隆 抗性基因)的SalI位点，构建成遗传互补载体pAls1-ko-c。载体经测序验证，确认没有氨基 酸突变。采用如前所述的农杆菌介导的转化方法，使用100μg/mL氯嘧磺隆进行筛选，将该互 补片段转入BcAls1基因缺失突变体M1基因组中，获得遗传互补菌株M1/Als1。选用突变体验 证时曾使用的引物a与b、c与d进行PCR扩增，结果符合预期(见图3)：与突变体M1相同，互补 菌株M1/Als1中原有的BcAls1基因被替换为潮霉素抗性基因HPH(引物a与b扩增结果为阳 性)，但额外拥有一个后续转入的BcAls1基因(编码区引物c与d扩增结果同样为阳性)。

实施例4BcAls1基因在灰霉病菌致病性方面的作用

采用离体叶片接种法，评价BcAls1突变体的致病力变化情况。从温室培养的番茄 植株上采集成熟叶片，水平放置容器中，使用打孔器打取待测菌株菌饼，正面朝下反扣至叶 片上，20℃保湿黑暗培养，3天后评价待测菌株的致病力。实验结果显示，BcAls1突变体基本 丧失了致病能力，只能在接种点附近发现微小病斑，且不扩展。与此形成鲜明对照的是，野 生型可成功侵染番茄叶片，并迅速蔓延至大半个叶面(见图4)。遗传互补菌株M1/Als1的致 病力正常，可恢复到野生型水平。对叶片病斑面积进行测量计算，发现BcAls1突变体侵染引 起的病斑面积只有野生型引起的20％左右(见图5)。将上述发病叶片表面进行消毒，研磨后 涂布至PDA平板上，培养2天后计数灰霉病菌菌落个数。研究发现，BcAls1突变体侵染的叶片 在接种三天后几乎没有活的菌体，而野生型侵染的叶片研磨后可以获得近百个菌落。该研 究结果表明，BcAls1是一个关键的致病基因，是灰霉病菌侵染寄主所必需的，如果该基因或 其编码的蛋白质丧失活性，灰霉病菌将失去侵染寄主引发病害的能力。