越南槐内生真菌GRPH-0在防治白色念珠菌中的应用

摘要

本发明公开了一种越南槐内生真菌GRPH-0，越南槐内生真菌GRPH-0的分类命名为漆斑菌（Myrothecium？sp.）GRPH-0，菌株的ITS序列如SEQ？ID？NO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年09月29日，保藏号：CGMCC？No.11391。本发明内生真菌(Myrothecium？sp.)GRPH-0对白色念珠菌具有非常显著的抑制作用；制备越南槐内生真菌(Myrothecium？sp.)GRPH-0代谢产物的方法简单易行，成本低。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种越南槐内生真菌GRPH-0在防治白色念珠菌中的应用。

背景技术

白色念珠菌是人体的一种常见的条件致病性真菌，在机体免疫力下降或免疫系统受到损害时，其大量繁殖而致病。近20年来由于临床上对肿瘤患者、器官移植患者大量使用抗肿瘤药物、抗菌剂和免疫抑制剂，以及慢性消耗性疾病、艾滋病的流行，使白色念珠菌感染的发生率在免疫受损的患者群体中急剧升高。白色念珠菌感染已日益成为一种常见病、多发病，死亡率逐年增高。目前临床上治疗白色念珠菌感染常用的药物主要有唑类如氟康唑、多烯类如两性霉素B和嘧啶类如5-氟胞嘧啶，但随着这些抗真菌药物的广泛应用，导致了大量耐药菌株的出现，因此，白色念珠菌感染已成为日益严重的问题，给临床治疗带来很大的困难和挑战，急需研制新型的抗真菌药物。

随着药用植物中分离出的新天然活性物质的减少，亟需新的研发策略发现新型天然药物。近10年来，人们把目光投向了药用植物内生真菌，内生真菌与宿主植物协同进化，多样性明显，这些特点决定了其次生代谢产物的独特性、丰富性，因此从药用植物内生真菌的次生代谢产物中容易发现结构新颖、活性多样的化合物。许多源于药用植物内生真菌的次生代谢产物被鉴定出具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、杀虫、抗HIV以及酶抑制剂等多种生物学活性。药用植物内生真菌所产生的结构新颖、活性多样的化合物为新型抗真菌药物的发现提供了重要的先导化合物和新的药物作用靶点，成为天然活性产物和新药开发的重要来源。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种越南槐内生真菌GRPH-0在防治白色念珠菌中的应用，该真菌对耐药性的白色念珠菌具有非常显著的抑制作用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种越南槐内生真菌GRPH-0，越南槐内生真菌GRPH-0的分类命名为漆斑菌（Myrotheciumsp.）GRPH-0，菌株的ITS序列如SEQIDNO.1所述，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年09月29日，保藏号：CGMCCNo.11391。

优选的是，所述越南槐内生真菌GRPH-0的代谢产物的制备方法为：

(1)将越南槐内生真菌GRPH-0接种PDA培养基中，置于温度为28℃下培养20天，所得培养材料切成块状并转移到无菌固体培养基，置于28℃发酵30天；

(2)发酵完成后，用发酵物2倍的甲醇浸泡发酵物并超声40min，然后过滤；

(3)重复步骤(2)两次，合并两次滤液进行减压浓缩成浸膏，得到越南槐内生真菌GRPH-0的甲醇粗提物，即为越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物。

优选的是，步骤(1)中所述的无菌固体培养基含400g马铃薯，20g的右旋糖和20g蔗糖。

优选的是，所述的PDA培养基组成为1000ml培养基含马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g和氯霉素0.1g；所述培养基pH6.0±0.2，采用121℃湿热灭菌25min。

如上述制备所得的越南槐内生真菌GRPH-0的代谢产物在防治白色念珠菌中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首次从药用植物越南槐的根中分离筛选到一株内生真菌(Myrotheciumsp.)GRPH-0，该菌的代谢产物具有抗真菌活性作用，对白色念珠菌具有非常显著的抑制作用；

(2)所述的制备越南槐内生真菌(Myrotheciumsp.)GRPH-0代谢产物的方法简单易行，成本低。

附图说明

图1为本发明越南槐内生真菌GRPH-0抑菌圈，其中a为阳性对照，b为越南槐内生真菌GRPH-0菌株菌饼。

图2为本发明越南槐内生真菌GRPH-0菌株形态特征，其中a为菌落形态，b为孢子形态。

图3为本发明越南槐内生真菌GRPH-0菌株基于ITS序列的系统进化树。

图4为本发明越南槐内生真菌GRPH-0菌株的代谢产物对白色念珠菌的最小抑菌浓度，其中C₁为无菌对照，C₂为无药物的生长对照，C₃为阳性对照两性霉素B，T为菌株GRPH-0的代谢产物。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。甲醇为市购分析纯甲醇。2XTagMasterMix购自宝生物工程有限公司(Takara)，Primer-1、Primer-2由华大基因合成。

实施例1

菌株的分离、筛选及鉴定

一、菌株的分离

供试材料：采自广西大学药用植物标本园的栽培越南槐。

培养基：PDA培养基：1000ml培养基含马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g、氯霉素0.1g，培养基pH6.0±0.2，采用121℃湿热灭菌25min。

表面消毒:将长为6-8cm、宽为1-2cm新鲜健康的越南槐根用流水冲洗30min以冲干净泥沙，然后将洗净的越南槐根用无菌水漂洗2次，风干表面水分，移到超净工作台，在无菌条件下，将越南槐根用体积浓度为75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗2次，次氯酸钠(有效氯1％)浸泡2min，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干表面备用。

菌株的分离、纯化：表面消毒好的越南槐根，无菌条件下，用无菌木片刮去表皮，用无菌枝剪剪去越南槐根的两端，余下部分用无菌小刀和无菌镊子分开木质部和韧皮部，并用无菌枝剪剪成0.5cm长的组织块，无菌转接至制备好的PDA培养基(含氯霉素)，28℃培养。取最后一次漂洗液涂布在PDA平板上，作为阴性对照。每天观测，待组织周围长出菌丝，挑取单一菌丝，接于无抗生素的PDA培养基。长出的菌落，如果外部形态不一致，继续挑取单一菌丝转接PDA培养基，直至平板上新长出的菌落的外部形态一致。

二、筛选

供试菌株：购自美国菌种保存库(ATCC)的白色念珠菌模式菌株ATCC90028。

培养基

(1)沙保罗琼脂培养基(SDB)：麦芽糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH6.0±0.2。

(2)MH琼脂(MHA)：牛肉粉6g，可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，琼脂17g，蒸馏水1L，pH7.3±0.1。

(3)MHA+GMB：MH琼脂添加2％的葡萄糖(G)和0.5μg/mL的美兰(MB)。

将分离到的越南槐内生真菌接种于PDA平板内，28℃下培养10天后待用。将白色念珠菌接种于SDB平板内，37℃下培养24小时后待用。

采用改良的琼脂扩散法对供试越南槐内生真菌进行菌体抑菌活性的筛选。

首先，经SDB培养的白色念珠菌新鲜菌落，采用直接菌落悬液法，挑取4～5个菌落于5ml生理盐水中并调节菌液浊度为0.5麦氏浊度，调好浊度的菌悬液在15min内用无菌棉签均匀涂布于MHA+GMB平板上，平板涂好菌液后，放置3～5min风干。然后在无菌条件，用打孔器将待筛选的内生真菌制成6mm的菌饼，并接入到涂布有白色念珠菌的MHA+GMB平板，以接入含10μg氟康唑的6mm琼脂块为阳性对照，平板置于37℃培养。最后，平板培养24h后，观察越南槐内生真菌菌饼或阳性对照周围有无抑菌圈，并测量抑菌圈的直径，结合阳性对照抑菌圈直径来判定菌株的抑菌活性大小。

结果

表1为用改良的琼脂扩散法筛选越南槐内生真菌菌株GRPH-0对白色念珠菌的拮抗作用所得数据

表1

处理>病原菌>抑菌圈直径(mm)>氟康唑琼脂块>C.albicans>22>GRPH-0菌饼>C.albicans>25>

注：表中阳性对照氟康唑琼脂块含10μg氟康唑，抑菌圈直径包含6mm的琼脂块或菌饼直径。

越南槐内生真菌菌株GRPH-0对白色念珠菌的拮抗筛选结果表明，该菌株对白色念珠菌有非常强的拮抗作用，从表1可知，该菌株菌饼的抑菌圈为25mm，而10μg氟康唑阳性对照的抑菌圈仅为22mm，如图1所示。所以，该菌6mm菌饼的抑菌活性大于10μg氟康唑的抑菌活性，该菌株对白色念珠菌具有非常显著的抑制作用。

三、鉴定

(一)菌株形态特征

菌落形态特征观察：将待鉴定的越南槐内生真菌菌株接种在PDA培养基上，置于28℃培养，分别在5、10及20天观察其培养特征和颜色变化。取稳定成熟的颜色特征作为其培养特征，作为鉴定的依据。观察记录气生菌丝的颜色，菌落的大小、颜色、组织形状、表面形状等作为参考特征。

孢子形态特征观察：将待鉴定的越南槐内生真菌菌株GRPH-0作插片培养，当在PDA培养基上不产孢子，将菌丝转接于含无菌越南槐根的低营养培养基(四分之一浓度PDA)上以诱导孢子，将所观察到的形态结果显微照相，结果如图2所示。

(二)菌株ITS序列及其系统发育学分析

DNA模板的制备

试剂：(1)裂解缓冲液：Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTA1mM，SDS1％(w/v)；

(2)5MNaCl溶液。

DNA提取：

加600μL提取液(Tris-Ac(pH7.8)40mM，NaAc20mM，EDTA1mM，SDS1％)到1.5ml离心管(EP管)，用棒刮取少量菌丝放入EP研磨，65℃水浴30min；12000r/min，转10min；

取上清400μL，加5MNaCL100μL，冰浴10min；

然后在温度为4℃12000r/min，转10min，取上清液，加上清液0.6倍异丙醇与上清液混匀(或2倍无水乙醇)冰浴1h，12000r/min，转10min，弃上清液后所得余下物质晾干，加20μL双蒸水(ddH₂O)，取1-2μL做DNA模板。

PCR扩增ITS序列：

(1)PCR仪：ABI3730-XLDNA测序仪(AppliedBiosystems，USA)；

(2)扩增引物：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)如SEQIDNO.2所示，和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)如SEQIDNO.3所示；；

(3)扩增体系：

表1ITS序列PCR扩增体系为：

反应物>加样量>2X TagMasterMix>25μL>Primer-1>1μL>Primer-2>1μL>Template DNA>2μL>ddH₂O>21μL>反应总体积>50μL>

注：表1中的TemplateDNA为上述制成DNA模板。

PCR反应条件如表2所示：

表2

注：表2中步骤2进行30个循环。

PCR扩增产物的电泳检测：

电泳条件为1％的琼脂糖凝胶(含Goldview5μl/100ml)，1×TBE电泳缓冲液，90V电压电泳1小时，PCR产物上样量为3μL，与1μLLoadingdye混匀后点样。

在254nm紫外下观察结果，以TaKaRa公司的DL1，000DNAMarker为核酸标准分子量参照物，确定扩增片段长度。扩增产物带应在标准物400-700bp位置上。

PCR产物纯化和测序：由深圳华大基因科技有限公司进行。

系统进化树的构建：

将所测的ITS序列与GenBank基因库中已测定的真菌的ITS序列进行比对，根据比对结果下载相关序列。通过MEGA6.0的邻接算法(Neighbor-joiningNJ)进行系统分析并构建系统进化树。

结果：

(一)菌株形态特征

菌落形态特征：在PDA培养基上，菌落圆形，轮状明显，菌丝白色，生长致密，地毯状，生长后期，菌落表面附着许多黑色的孢子团。

孢子形态特征：批针型孢子，大小为2.50μm×6.25μm。

(二)菌株ITS序列及其系统发育学分析

利用引物ITS1和ITS4，从菌株基因组DNA中扩增出一条400-500bp大小的片段，经测序并将测序结果通过GenBank中BLASTn比对。结果表明，菌株GRPH-0与Myrothecium属中的真菌有很高的碱基序列相似性，因此下载GenBank中Myrothecium属的参考菌株序列，用于系统发育分析，以Stachybotrys属中的Stachybotryseucylindrospora(JN938869)和Stachybotryskampalensis(DQ680061)作为外群。在构建的系统进化树中，越南槐内生真菌GRPH-0与Myrotheciumsp.(AY303603)聚在一起形成支持强度为99％的末端分支。碱基相似性比较结果表明，越南槐内生真菌GRPH-0与Myrotheciumsp.(AY303603)碱基序列有2个碱基的差异，序列相似性为99.6％。综合形态学和分子生物学特征，将菌株初步鉴定为Myrotheciumsp.。

实施例2

菌株的代谢产物对白色念珠菌的抑制作用

一、菌株的发酵培养和代谢产物的提取

(1)将越南槐内生真菌GRPH-0接种于PDA培养基，置于温度为28℃下培养20天，所得培养材料切成小块并转移到含无菌固体培养基(400g马铃薯、20g右旋糖和20g蔗糖)的2升的锥形瓶中，置于28℃发酵30天；

(2)发酵完成后，用发酵物2倍的甲醇浸泡发酵物并超声波40min，然后纱布过滤；

(3)重复步骤(2)两次，合并两次滤液进行减压浓缩成浸膏，得到越南槐内生真菌GRPH-0的甲醇粗提物，即为越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物。

二、越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物对白色念珠菌的最小抑菌浓度

RPMI-1640肉汤培养基：含谷氨酰胺和酸碱指示剂的RPMI-1640溶液，2％葡萄糖，0.165mol/L的3-(N-吗啉)丙磺酸，pH7.0。

将白色念珠菌接种于SDB平板内，37℃下培养24小时后待用。

用改良的肉汤稀释法测定越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物对白色念珠菌的最小抑菌浓度。首先，经SDB培养的白色念珠菌新鲜菌落，采用直接菌落悬液法，挑取4～5个菌落于5ml生理盐水中并调节菌液浊度为0.5麦氏浊度，将0.5麦氏浊度的菌悬液用RPMI-1640肉汤培养基进行1:1000倍稀释备用。将无菌的U型底的96孔培养板写上标记，并每孔加入0.1mL的RPMI-1640肉汤培养基，将越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物用1％DMSO溶解成1024μg/mL的代谢产物处理浓度，0.1mL1024μg/ml的代谢产物溶液被加入培养板的第一排并进行两倍系列稀释，为菌株GRPH-0的代谢产物实验组(T)。接下来，将0.1mL的菌液加入每孔，从而获得最终的代谢产物处理浓度范围为0.25～512μg/mL，白色念珠菌终浓度为5×10²to2.5×10³CFU/mL.0.1ml的RPMI-1640肉汤培养基代替0.1mL的菌液执行上述处理过程而作为无菌对照(C₁)，0.1ml的1％DMSO和0.1ml的128μg/ml两性霉素B分别代替粗提物执行上述处理过程而作为生长对照(C₂)和阳性对照(C₃)，所有处理和对照重复三次。最后，培养板置于37℃培养45小时后，10μl1mg/mL的刃天青溶液加入每孔，37℃继续培养3小时后观察颜色的变化，紫色为生长抑制，粉红色为生长，越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物的MIC值为完全抑制真菌病原可见生长的最小代谢产物浓度。

结果

越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物对白色念珠菌生长的最小抑菌浓度

表2

处理>病原菌>MIC(μg/ml)>两性霉素B>C.albicans>0.25>GRPH-0粗提物>C.albicans>4>

注：表中阳性对照两性霉素B的纯度为99.9％。两性霉素B的浓度范围为0.0313to64μg/mL，越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物的浓度范围为0.25to512μg/mL。

越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物对白色念珠菌生长的最小抑菌浓度测试结果表明，越南槐内生真菌GRPH-0代谢产物对白色念珠菌具有很强的抑制作用，从表2可以看出GRPH-0的代谢产物对白色念珠菌的最小抑菌浓度为4μg/ml，仅为纯化合物两性霉素B的16倍。

从表1和表2可知，菌株GRPH-0对白色念珠菌有非常强的拮抗作用，该菌株可产生具有抗真菌活性的物质，该物质对白色念珠菌具有非常显著的抑制作用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。