用于控制多肽的α-酰胺化和/或C-末端氨基酸分裂的细胞培养基和方法

摘要

本发明涉及一种用于降低在细胞培养物中表达多肽的C-末端异质性的细胞培养基，其中所述培养基包含至少一种有效量必需的微量元素，还涉及一种用于降低蛋白质的C-末端异质性的细胞培养方法，所述方法中采用了必需的微量元素。

说明书

技术领域

本发明广泛地涉及细胞培养基组合物和细胞培养方法的技术领域。特别地，本发明是针对降低多肽，如糖蛋白的异质性。

背景技术

在哺乳动物细胞的重组蛋白的生产过程中，蛋白质的多个修饰是发生在表达后(即翻译后)，且因此导致重组蛋白产物的异质性。由于翻译后修饰并不是由蛋白质核苷酸序列编码进行编码，而是主要依赖于几个环境酶的作用，从而在生产过程中它们是难以控制并保持在严格(期望)的规格范围。因此特别是在重组治疗性蛋白的制造过程中，最大的挑战是保持蛋白质产物恒定的特性和质量。

在多肽的所有相关可能质量属性的综合列表内，C-末端α-酰胺化是归因于C-末端异质性的基团。重链上的C-末端赖氨酸(Lys)的处理是重组单克隆抗体(mAb)最常见的修饰之一。重链的C-末端Lys可以通过碱性羧肽酶(CP)的活性被完全地或部分地除去。通过128Da除去一个C-末端Lys残基降低了分子量，并通过1个单位增加了正电荷。部分地除去C-末端Lys残基导致(由于单克隆抗体(mAb)的四级结构)抗体的混合种群具有零个，一个或两个C-末端赖氨酸残基(Liu等人，2008)。在缺乏赖氨酸时，能够进一步去除第二氨基酸甘氨酸(Gly)，随后剩余的C-末端氨基酸脯氨酸(Pro)酶促地α-酰胺化。

C-末端α-酰胺化是公知的，并在多肽和蛋白质的生物活性中具有重大意义。许多神经肽需要C-末端α-酰胺化步骤以使其成熟为活性的受体结合分子。例如，神经毒素非酰胺化类似物较包括C-末端α-酰胺化脯氨酸(Pro)的神经毒素具有四倍较低活性。在人血浆中人免疫原性MART-1肽的稳定性因C-末端α-酰胺化显著增加。蛇毒C-末端α-酰胺化通过降低其蛋白质降解来增加其在溶液中的寿命，并导致与未修饰的肽相比，其具有更高的活性。四肽乙酰基-丝氨酸(Ser)-天冬氨酸(Asp)-赖氨酸(Lys)-脯氨酸(Pro)抑制人类和鼠原始造血细胞的增殖，且很容易通过血管紧张素I-转换酶(ACE)降解。其C-末端α-酰胺化类似物不能因ACE而降解，且其血浆水平比野生型肽高26倍。因此多肽的C-末端α-酰胺化增加了其固有的生物学和免疫学活性，以及稳定性。

C-末端α-酰胺化是专有的酶反应，由双功能肽酰甘氨酸α-酰胺化(PAM)酶催化。第一个步骤是：通过肽酰甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM，EC1.14.14.3)域进行C-末端甘氨酸残基的α-羟基化。第二个步骤是：通过肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化分裂酶(PAL，EC4.3.2.5)域(MethaNM，2009)使α-羟基甘氨酸延长肽进行脱烷基化形成α-酰胺化肽和乙醛酸盐。进一步地，参见国际申请PCT/EP2011/069756或PCT/EP2013/057866，可以获悉PAM的酶促反应，该申请的全部公开内容在此引入本文。

在此背景下，实施了纯化PAM酶的多项研究以增加体外和体内的C-末端α-酰胺化。在这些研究中，揭示了多种不同的活化剂，抑制剂和辅因子。

EP0409294A1描述了一种充当PAM酶的辅因子的物质，其在高于225nm时没有吸收光谱，且不是肽，也不是茚三酮阳性物质，其具有小于1,000Da的分子量，在电渗析迁移到正极并具有两亲性结构。前述的抑制剂被用于多肽或蛋白质的C-末端α-酰胺化的制备(GuntherK,1990)。

另一个用于C-末端α-酰胺化的辅因子在GB2233978A中有描述。PAM酶的辅因子是具有式R–(C＝O)_n–(CHOR1)_n–CH₂OR2的化合物，其中R代表氢原子或烷基，R1和R2分别表示PO₃H₂或SO₃H基团(Gozzini等人,1991)。

在Bradbury和其同事的论文中提出在体内使用PAM抑制剂4-苯基-3-丁烯酸。体内抑制剂的使用可以允许控制某些肽类激素的C-末端α-酰胺化，从而导致活性形式循环水平的降低。另外，在体内控制C-末端α-酰胺化的能力有利于促进细胞内的位置、α-酰胺化酶的运输和储存的研究(Bradbury等人,1989)。

从C-末端-酰胺化肽文献数据获悉该C-末端的异质性可以影响重组多肽的某些性质的提示。通过α-酰胺化肽的治疗潜力的识别引发了对C-末端-酰胺化过程的科学和商业关注，例如降钙素，催产素和加压素。最近几年，开发了一些高效α-酰胺化反应，优先通过α-酰胺化酶，使用激素原催化酰胺化反应(KimKH和SeongBL,2001)。在这种情况下，双功能肽酰甘氨酸α-酰胺化酶被成功地用于在体外反应以将C-末端延伸肽转换成显示有C-末端α-酰胺化残基的肽类激素(MerklerDJ，1994)。一种用于将C-末端甘氨酸延长肽转换成相应的脱-甘氨酸的肽酰胺的方法在GB2220938A中披露(Castiglioreet等，1990)。

然而，仍很少有人知道C-末端α-酰胺化在较大的多肽如抗体中的影响。甚至很少或没有知识涉及重组多肽，如糖蛋白的C-末端的异质性在毒理学方面和免疫原性的影响，但是从上述调查结果中可以实施一些外推法。如果修饰了抗体蛋白的表面或电荷，抗体固有的抗原性可以被改变。对于抗体靶肽，Maillèreand及其同事表明，目标肽的C-末端α-酰胺化在相应抗体特异性引发了惊人的影响。当多肽表现出C-末端α-酰胺化时，小鼠的抗体反应急剧增加。根据这些数据，本发明的发明人假定，具有C-末端α-酰胺化的治疗性多肽，特别是治疗性抗体，具有可以改变光敏处理(免疫原性)的潜力。根据这些C-末端α-酰胺化增加了多肽的寿命和T细胞应答的证据(Maillèreet等，1995)，该抗体的半衰期的延长也可能对所需的药理学功效和在单克隆抗体本身的潜在免疫应答产生相当大的影响。

因此，本领域技术人员需要理解，对于重组表达的治疗性多肽(如抗体)的制备，控制所产生的多肽在翻译后的C-末端修饰是特别重要，为提供ⅰ)恒定的产品质量和稳定的高产量，和/或ii)增加生产过程的效率，和/或iii)，增加和/或微调所产生的多肽的生理活性和衍生药物的安全性，和/或iv)将产生多肽的翻译后的功能与那些参考多肽匹配。

鉴于上述情况，有必要通过提供用于调节PAM和/或CP的酶活性的装置，实现在生产重组(glyco-)多肽期间控制或调节C-末端异质性的稳定可控的方法。此外，这队获得高质量非免疫原性重组多肽也是有必要的。

因此，本发明要解决的问题是提供用于控制C-末端异质性的量的装置和方法，特别是关于(治疗性)多肽的C-末端α-酰胺化。

通过在本发明的独立权利要求提供的实施方式解决所述技术问题。从属权利要求中提供有关优选实施方案。但是应该理解的是，由数值限定的范围应被理解为包括所述限定值。

发明内容

本发明提供了用于产生非免疫原性多肽的装置和方法，其中该装置和方法适合于大规模生物过程。

本发明通过用于调节(例如，减少)翻译后修饰的C-末端异质性的装置和方法解决上述问题，其基本上由表达多肽的氨基酸残基的α-酰胺化和/或C-末端分裂组成，采用了具有确定浓度的至少一种必需的微量元素或化合物，该化合物包括在细胞培养基中作为添加剂的元素。

本发明基于令人惊讶的发现，即必需的微量元素能够调节重组表达多肽的C-末端异质性。

换句话说，本发明涉及一种细胞培养基，用于控制在细胞培养物中的表达多肽的氨基酸残基的[α]-酰胺化和/或至少一种C-末端分裂，其中该培养基包括至少一种必需的微量元素或包含该元素的化合物，该元素作用于/调节肽酰甘氨酸[α]-酰胺化单加氧酶(PAM)和/或羧肽酶(CP)的活性。

在另一个方面，本发明提供了一种细胞培养方法，用于控制表达多肽的至少一种氨基酸残基的α-酰胺化和/或C-末端分裂，该方法包括至少以下步骤：i)加入至少一种必需的微量元素至细胞培养基，该细胞培养基包含表达多肽的宿主细胞；及ii)发酵并回收由宿主细胞产生的多肽。在本发明一个优选实施例中，所述必需的微量元素选自如下一组物质中的至少一种：锌(Zn)、硒(Se)和/或铜(Cu)。

根据本发明，减少在氨基酸C-末端发生α-酰胺化可以通过以下方式促进实现，既可以通过利用含有浓度为0.175μM～约2.98μM的硒(Se)的培养基来降低的C-末端α-酰胺化的形成，也可以通过包含浓度约为0.2μM～约20μM的锌(Zn)的培养基来增加一个或优选为所有表达多肽C-末端的C-末端赖氨酸残基的比例。在一个优选的实施方案中，使用包含浓度为1μM～2.4μM的硒(Se)以及3μM～15μM的锌(Zn)的培养基。

在本发明的优选实施方案中，表达为异源表达，并发生在真核细胞基表达系统中，其中该真核细胞基系统包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核细胞，该低等真核细胞包括真菌和酵母细胞。

根据本发明，该多肽的表达，即，本发明的方法发生在至少一种生物反应器(BR)或培养容器中，包括摇瓶(SF)、T-烧瓶、瓶、反应袋、BRs和/或转瓶。

在本发明的另一个方面，硒或其所对应的盐被当做用于肽酰甘氨酸[α]-酰胺化单加氧酶(PAM)的抑制剂。

定义

除非另有说明，如本文中所用术语所给出的定义是由牛津生物化学与分子生物学词典(Oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology)提供，牛津大学出版社，2006年，印刷ISBN-13：9780198529170当前在线版本：2008；eISBN：9780191727641。

为了进一步阐述在本发明中的一般技术，从业者可以参照细胞生物学和组织培养的标准教科书和评论来实践，参见实施例中列举的参考文献。分子和细胞生物化学的一般方法可以在这样的标准教科书(如分子克隆)中找到：LaboratoryManual，第3版(Sambrooket等，HarborLaboratory出版社2001年)；ShortProtocolsinMolecularBiology，第4版(Ausubel等编辑，JohnWiley&Sons出版社1999)；ProteinMethods(Bollaget等，JohnWiley&Sons出版社1996)；Non-viralVectorsforGeneTherapy(Wagner等编辑，Academic出版社1999)；ViralVectors(Kaplitt&Loewy编辑，Academic出版社1995)；ImmunologyMethodsManual(Lefkovits编辑，Academic出版社1997)；及细胞和组织培养：LaboratoryProceduresinBiotechnology(Doyle&Griffiths,JohnWiley&Sons1998)。在本申请公开中提到的遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商获得，如BioRad、Stratagene，Invitrogen、Sigma-Aldrich、和ClonTech公司。此外，在国际申请PCT申请/EP2011/069756和PCT/EP2013/057866公开的内容，特别是在各自的实验部分使用的方法，在此引入作为参考。

如本文所用的生物分子，如在细胞培养物中表达多肽的“控制α-酰胺化”意味着调节细胞培养物生长的条件，例如，包括但不限于，培养基、pH值、温度、和直到细胞收获的生长时间，使得从细胞培养物获得的C-末端非α-酰胺化或α-酰胺化多肽原的量包括该细胞培养物中产生的异源多肽全部量的所期望百分比。

如本文所使用的生物分子，例如在细胞培养物中表达多肽的“控制氨基酸残基的C-末端分裂”意味着调节细胞培养物生长的条件，例如，包括但不限于，培养基、pH值、温度、和直到细胞收获的生长时间，使得从细胞培养中得到的多肽的量在它们的C-末端包括所期望百分比的Lys(计算为在该细胞培养物中产生的异源多肽的全部量的分数)。

表述“作用于”或“调节肽酰甘氨酸[α]-酰胺化单加氧酶(PAM)和/或羧肽酶(CP)的活性”表示必需的微量元素或包含该元素的化合物对该酶表现出的作用是可测量的，如PAM和/或CP酶的活性或功能分别增加了和/或减少了。必需的微量元素或包括该元素的化合物通过降低PAM酶复合物的催化速率来影响C-末端α-酰胺化过程。由此，必需的微量元素影响或调节在PAM酶复合物本身，或影响肽酰甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)，这就是C-末端甘氨酸残基分裂的原因，或肽基氨基乙醇酸裂合酶(PAL)，这就是实际α-酰胺化反应的原因。核苷酸和氨基酸序列，例如，人类PAM是本领域已知的，并且可以由公共数据库中获得，例如，由美国国家生物技术信息中心托管的互联网网页(NCBI)，其中包括美国国立卫生研究院(NIH)的基因序列数据库，也引用了可通过PubMed中心获得相应的参考。例如，作为参考，PAM的人核苷酸序列和氨基酸序列在登录号基因ID：5066或加入：AAA36414.1GI：189595就可以获得。

此外，必需的微量元素可以通过影响或调节该酶的活性影响羧肽酶(CP)(EC3.4.17.2和EC3.4.17.3)的速率。CP催化上述肽或多肽终端或倒数第二个键的水解分裂，在发生了游离羧基的位置。人羧肽酶的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的，并且可以经由公共数据库中获得，例如，由美国国家生物技术信息中心(NCBI)主办的互联网网页，包括美国国立卫生研究院(NIH)的基因序列数据库基因库，也引用了可通过PubMed中心获得相应的参考。例如，作为参考，羧肽酶B(CP)的人类核苷酸和氨基酸序列可以在登录号为NM004460和AAB496652.1或加入：NP001862.2GI：4607080获得。

在类似的方式中，术语“降低C-末端的α-酰胺化脯氨酸(Pro)的形成”意味着相比参考样品α-酰胺化过程或反应将减少、抑制延迟、受控、限制或被调节，以此方式具有较少的α-酰胺化。α-Pro-酰胺化受PAM酶复合物的影响，其基本上依赖于Pro和翻译蛋白质的R之间的C-末端肽键的水解和氧化作用，其中R可以为一个或多个氨基酸残基，例如，甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)、或苯丙氨酸(Phe)、或甘氨酸(Gly)-赖氨酸(Lys)。该反应在大多数情况下是由PAM酶复合物催化(如上)。根据表达宿主和多肽表达的条件下，翻译蛋白质在≥0且≤100％的范围携带至少一个翻译后脯氨酸(Pro)-NH₂的份额。该α-酰胺化导致蛋白质pH值的升高，因此是一个基本的变体。

在(单克隆)抗体或其衍生物，脯氨酸(Pro)α-酰胺(PA)通常是通过C-末端的赖氨酸和甘氨酸的翻译后去除，和目前的Pro残基C-末端的酰胺化来创建，例如，在蛋白质的重链上。

可以使用各种分析方法对PA的量进行识别和定量，通过物理-化学差异将α-酰胺化变体与非α-酰胺化变体区别开，例如电荷、疏水性或质量。离子交换色谱分析法，作为CEX-CPB方法(通过羧肽酶B在消化后的阳离子交换色谱法)，由于Pro-α-酰胺化，其是一种合适用于电荷变更的方法。对于抗体，在色谱分离之前采用羧肽酶B消化来去除赖氨酸残基，用来避免具有赖氨酸变体的Pro-α酰胺变体的共洗脱。然而，具有其它基本变体的附加共洗脱可导致几个百分比(例如4％)的量化背景(background)。脯氨酸酰胺变体加上背景被称为“伪(Pseudo)1K”，用于在色谱位置洗脱具有一个C-末端赖氨酸残基的抗体变体。“伪2K”包括了鱼精蛋白变体加上在色谱位置洗脱具有两个C-末端赖氨酸残基的抗体变体的背景。与CEX方法(即，通过CPB消化去除的不具有赖氨酸的CEX)的区别表明具有赖氨酸残基的抗体的量，称为“实1K”和“实2K”。由CEX(-CPB)定量回收溶液中涉及所有抗体分子的Pro酰胺化的百分比。能够明确识别和量化α-酰胺化脯氨酸变体的分析测试方法为肽链内切酶(例如赖氨酸C，胰蛋白酶)消化蛋白质的RP-HPLC(反相高性能液体色谱)，所谓的肽图谱，采用UV(紫外线)或MS(质谱)检测。通过RP-HPLC肽绘图回收涉及所有重链的Proα-酰胺化的量。

“伪1K”是由CEX-CPB确定的变体，其中抗体(IgG)的一个或两个重链在其C-末端具有Pro酰胺。“伪2K”是由CEX-CPB确定的变体，其中单克隆抗体的两个重链在C-末端具有Proα-酰胺。本领域技术人员需要理解的是，使用肽作图也是优选用于实现本发明的目的。

如本文所用，术语“影响”是指降低(lower)、减少(reduce)、延缓、降低(decrease)、抑制或调节蛋白质、酶的活性或功能或化学或生理反应。

“抑制剂”是能延缓或防止化学或生理反应或响应的任何物质。

术语“诱导”、“抑制”、“增加”、“减少”、“降低”、“影响”、“调节”、“控制”或类似物，其表示两个状态之间的定量差异，是指至少涉及两种状态之间的统计学显著差别，这不一定意味着表达或活性的消除，例如细胞或多肽的α-酰胺化。这些术语在本文中应用，例如，表达的水平，量和活性的水平。

如本文所用，术语“异源(的)”是指(a)通过隔离或引入至另一个细胞或生物体从细胞或生物体获得，例如，通过遗传操作或核苷酸转移，和/或(b)通过不同于那些存在于自然界中的装置从细胞或生物体中获得，并引入到另一个细胞或生物体中，例如，通过细胞融合，诱发交配，或转基因操作。例如，异源材料可以从相同物种或种类，或不同物种或种类获得，而不是引入的生物体或细胞。

“细胞基表达系统”是指根据本发明的表达系统或其部分或多核苷酸(例如，转化，感染，或转染)引入至宿主细胞或宿主细胞裂解物，用于生产本发明的多核苷酸和/或多肽。

“宿主细胞”包括但不限于真核或原核细胞，如哺乳动物细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、细菌细胞或引入至分离的和/或异源多核苷酸序列的微生物细胞(例如，转化，感染或转染)或能够摄取外源核酸(例如，通过转化，感染或转染)的微生物细胞。任何能够表达整合的(在基因组中)或自由复制(如质粒)转基因或包括内源或异源的PAM和/或CP酶或其同源和/或直接同源物的细胞，具有基本上相同的功能，适用于本发明的含义；例如参见，美国专利申请2008/0305523中合适的真菌细胞；美国专利08/477559中合适的植物细胞；EP专利2560479中合适的藻类细胞；美国专利2011/0117643中合适的动物细胞；美国专利20130034897中合适的细菌细胞以及EP专利1050582中合适的微生物细胞。

术语“真核”细胞应指核细胞或生物体，包括但不限于昆虫、植物、藻类、真菌、哺乳动物和动物。

“细胞培养”或“培养”指将细胞维持在人工，体外环境。然而应该理解的是，术语“细胞培养”是一个通用术语，并且可以用于包括培养物而不仅是单个细胞，还可以是组织，器官，器官系统或整个生物体，其中术语“组织培养”，“器官培养”，“器官系统培养”或“器官型培养”可能偶尔会与术语“细胞培养”交替使用。本发明的培养基可被用于培养任何粘附细胞(即，附着在培养容器的细胞)和生长于悬浮培养的任何细胞。

如本文所用，表述“细胞培养基”或“培养基”或“发酵培养基”或“细胞培养”是指用于生长的营养物溶液，和在上下文中使用的培养细胞的所有类型的培养基。典型地，细胞培养基包含氨基酸、至少一种作为能量来源的碳水化合物、微量元素、维生素、盐和其他可能成分(例如，用于影响细胞生长和/或生产率和/或产品质量)。众所周知的是，相对于无血清培养基生长的细胞的表达水平，重组多肽表达的改良水平可以从在无血清培养基中生长的细胞中获得。因此，本发明的培养基可以是无血清或补充有0.5、1、2、3、4、5、10、15或20％的血清。

如本文所用术语“补料(feed)”，“补料培养基”或“料液”是指一种细胞培养基或具有特定成分的溶液，其在本方法中通常作为补充物加入至细胞培养物，用于影响细胞生长和/或生产率和/或产品质量。

如本文所用术语“细胞培养液”指的是在其中培养细胞的实际液体。这意味着，相对于根据上述定义的细胞培养基或补料，该液体可以包含细胞、细胞碎片、细胞蛋白质(例如，酶或重组蛋白质)产生的代谢物。

如本文所用的表述“α-酰胺化氨基酸残基的量”是指在蛋白质的C-末端蛋白表达之后在该过程中形成的α-酰胺化氨基酸残基。具体地，这涉及α-酰胺化脯氨酸的量。在某些情况下，在多肽中的脯氨酸残基可以为翻译后的α-酰胺化，例如，导致Pro-α-酰胺(Pro-NH₂)的形成。在某些情况下这是不期望的，例如，当相比参考多肽，多肽中的产生的Pro-α-酰胺的量较高、或更低时。

如本文所用的术语“化合物包括必需的微量元素，或离子，或其所对应的盐”，必需的微量元素涉及任何有机或无机化合物，在生理环境(例如，细胞培养液)，其具有如下面所定义的必需的微量元素的同样的潜在影响。

(微量)元素被认为“必需的(essential)”，如果元素的缺食性营养不良会始终导致在宿主中次优的生物学功能，包括植物、动物和/或人通过摄取生理量的元素进行预防或逆转。磷(P)、钾(K)和硫(S)被视为在所有生物系统的大量营养元素。钙(Ca)和镁(Mg)是相对大量的必需物。以下元素是生物体仅需要微量或超微量，从而根据本发明也称为“必需的微量元素”：砷(As)、硼(B)、铬(Cr)、钴(Co)、铜(Cu)、铁(Fe)、氟(F)、锂(Li)、碘(I)、锰(Mn)、钼(Mo)、镍(Ni)、硒(Se)、锶(Sr)、硅(Si)、硫(S)、锡(Sn)、钒(V)、锌(Zn)、和任选的稀土元素。根据本发明，优选使用一定量的硒(Se)，锌(Zn)和/或铜(Cu)。此外，必需的微量元素的每个可能的氧化态，以及同位素或基团或模拟物，在C-末端的异质性显示与硒，锌或铜，或它们的任意组合相同的功能的物质都可以应用在本发明中。

在分子中的原子的“氧化状态”给出了它已获得或失去价电子的数目。必需的微量元素可以单独使用或以任何形式组合的加入，在生产培养基过程中或在使用培养基前的任意时间加入，同时在两个短期富集(3小时)的轮虫，或在分批培养物中使用有机结合的(例如，氨基酸，蛋白质或其他生物分子)或复合物或无机矿物来源。此外，必需的微量元素可以作为游离离子存在于培养物中，或者细胞内或细胞外，或可被络合。

在此背景下，“微量”是指如上所定义的元素仅以微量浓度存在。微量浓度或水平可以为<10^-5、<10^-6、<10^-7、<10^-8或<10^-9M。微量元素或任何其它成分或化合物是故意存在于培养基、组合物、或液体中，或者通过已知的加入或有意使用的非纯材料，用于增加微量的“杂质”。因此，培养基、组合物或液体将具有已知的或预定量的微量元素。

“有效量”是指(使用相应化合物，酶或离子的剂量或浓度或分子数)有效地介导的效果的量，特别是所希望的效果，无论是采取一次剂量或以任何剂量或途径，单独使用或与其他药剂组合服用。

如本文所用术语“药物制剂和/或组合物”表示适合用于或适于给药于哺乳动物的组合物，尤其是人。

术语“(glyco-)多肽”，“肽”，和“(glyco-)蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，任选具有的寡糖链(聚糖)的共价连接。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为(一个或多个)与天然存在的氨基酸的相对应的类似物，以及以天然存在的氨基酸聚合物。该术语还包括传统的连接有氨基酸的肽键的变体，从而构成该多肽。

如本文所用术语“抗体”是指单克隆抗体(mAbs)，多特异性抗体，人抗体，人源化抗体，合成抗体，嵌合抗体，多克隆抗体，焦糖抗体，单链Fvs(scFv)，单链抗体，免疫活性抗体片段(例如，能够结合表位的抗体，例如，Fab片段，的Fab'片段、F(ab')₂片段、Fv片段、含有VL或VH结构域或互补决定区片段(CDR)的片段，其免疫特异性结合抗原等)，双功能或多功能抗体，二硫键连接的双特异性的Fvs(sdFv)，胞内抗体，和双抗体，以及上述任何抗体的表位结合片段。特别是，术语“抗体”旨在包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原结合位点分子的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类(例如，IgG_bIgG₂,IgG₃,IgG₄,IgAi和IgA₂)或亚类。

术语“抗体衍生物或片段”指的是全长抗体、一般的靶结合区或可变区的一部分。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')₂和Fv片段。“Fv”片段是最小的抗体片段，其包含完整的目标识别和结合位点。此区域由一个重链和一个轻链可变域紧密排列的二聚体、非共价缔合(VH-VL二聚体)组成。在这种构造中，各可变域的三个CDRs相互作用以在VH-VL二聚体表面上限定靶标结合位点。总的来说，这六个CDRs共同赋予靶对抗体的结合特异性。然而，即使是单个可变域(或仅包括三个CDRs靶的特异的半个Fv)具有识别并结合靶的能力，虽然相比完整结合位点具有更低的亲和性。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽进一步包括在VH和VL结构域之间的多肽链，其使得scFv形成用于靶结合的所期望的结构。

术语“融合蛋白质”、肽、多肽以及蛋白质是指通过两个或更多个基因的接合形成的蛋白质，其最初编码为单独的蛋白质。此融合基因的翻译导致产生具有从各原蛋白的衍生的功能性质的单一多肽。这意味着该术语包括嵌合和人源化抗体，以及例如，由受体结构域和IgGFc片段组成的构建体。

如本文所用的表述“非抗体蛋白”是指生理活性的蛋白质而不是抗体。这样的定义，除其他外，还包括胰岛素、生长激素、红细胞生成素、干扰素或G-CSF，组织纤溶酶原激活剂(tPA)，因子VIII，和/或白细胞介素2，或其片段或其衍生物。

术语“变体”、“衍生物”和“类似物”，当指的是本发明的抗体或抗体多肽时，包括保留至少一些与天然结合分子、或多肽相应的抗原-结合特性的任何多肽，仍具有一些结构关系，且保留一些普通抗体概念的功能属性，例如scFv，以及二，三或更高的特异性抗体构建体，聚乙二醇化抗体构建体和类似物。

在本发明中，类似的概念适用于“蛋白质的片段或衍生物”的意义。

术语“试剂盒”是指材料的集合，优选为材料的包装集合(优选相关材料)，以执行特定功能(例如，运行检测、表达蛋白质、培养细胞、纯化多肽等等。)。试剂盒可任选地包括描述了本试剂盒中的材料用途的教材。

如本文所用给定离子或其所对应的盐的“浓度”术语，如“硒或其所对应的盐”，“锌或其所对应的盐”和/或“铜或其所对应的盐”表示硒和/或锌及/或铜离子在细胞培养基(例如细胞培养基，或者补料培养基，或补料溶液)或在细胞培养液中的最终浓度。

附图说明

图1：通过实验(DOE)的设计创建的滴定量排列图。单独的微量元素或组合对滴定量具有显著影响，其超过了邦费罗尼(Bonferroni)上限，对滴定量具有的可能影响甚至超过了t-值(t-Value)上限。对滴定量没有影响的微量元素排列在t-值上限的下方，从而不被选中。A：亚硒酸钠(Na₂SeO₃)，D：氯化锌(ZnCl₂)(μM)。

图2：通过DOE创建的轮廓图呈现了锌和硒对滴定量影响。等高线图上色彩明亮的区域代表浓度增加区域，深色区域表示浓度下降区域。在白盒中的数字表示测得的浓度(g/L)。

图3：通过DOE创建的C-末端α-酰胺化脯氨酸的量排列图。超过了邦费罗尼(Bonferroni)限制(E＝氯化铜(CuCL₂x2H₂O)和A＝亚硒酸钠(Na₂SeO₃))的影响是肯定显著的，且超过了t值上限的影响是比较显著的。低于t值上限的影响没有选入，因为他们并没有显著影响。

图4：通过DOE软件创建的等高线图，其中呈现了增加铜和硒浓度对C-末端α-酰胺化脯氨酸(C-末端酰胺化脯氨酸)的量的影响。培养基的铜浓度的增加导致PAM活性的增加和在C-末端产生的α-酰胺化脯氨酸的增加。硒浓度的增加导致PAM活性的降低和在C-末端产生的α-酰胺化脯氨酸的降低。

图5：通过DOE创建的排列图，呈现了锌作为主要因素对C-末端赖氨酸(C-term.Lys)的量的影响。锌作为高于邦费罗尼(Bonferroni)上限的t-值的唯一因素。

图6：通过DOE软件创建的等高线图，其中呈现了锌浓度增加对C-末端赖氨酸的量的影响。培养基的锌浓度增加导致CP活性的增加，从而导致C-末端赖氨酸的减少。

图7：通过DOE软件创建的等高线图，其中呈现了锌和硒对滴定量的影响。培养基的锌含量增加造成滴定量升高。硒浓度超过3μM被证明是有毒的，从而导致滴定量降低。

图8：通过DOE软件创建的等高线图，其中呈现了铜和硒对C-末端α-酰胺化脯氨酸量的影响。培养基硒浓度的增加和铜浓度的减少导致了C-末端α-酰胺化脯氨酸的减少，这表明硒对PAM酶的抑制作用。

图9：通过DOE软件创建的等高线图，其中呈现了锌对C-末端赖氨酸的量的影响。在发酵培养基中增加锌浓度导致C-末端的Lys的量的减少，这表明CP酶活性的增加。

图10:在SF系统中进行的确认实验。A)降低铜浓度和增加硒浓度对PAM的活性的影响(表示为C-末端α-酰胺化Pro的量)，及与含有2.04μM的铜(Cu)和0.173μM硒(Se)但未改变培养基本身的对比。B)降低锌浓度对CP活性的影响(表示为C-末端Lys的量)，及与含有22μM锌(Zn)但未改变培养基本身的对比。

图11：在BR系统中进行的确认实验。描述了硒浓度的增加对细胞生长(A)和生产率(B)的影响。

图12：硒浓度的增加对在体内的PAM酶的活性的影响。通过增加培养基中的硒浓度，降低了PAM活性，从而导致C-末端α-酰胺化Pro的量急剧下降。

图13：在BR系统中进行的确认实验。描述了降低的锌浓度对细胞生长(A)和生产率(B)的影响。

图14：锌浓度的降低对体内CP酶活性的影响。通过降低培养基中锌浓度(Zn浓度)，降低了CP活性，从而导致C-末端Lys的量急剧下降。

具体实施方式

在对本发明进行详细描述之前，应当理解的是，本发明并不限于所描述的装置的特定组成部件或所描述方法的工艺步骤，这样的装置和方法是可以变化的。还需要可以理解的是，本文所使用的术语是为了描述特定实施例的，并不意图起限制性作用。必须指出的是，除非上下文另有明确说明，在说明书和所附权利要求书中使用单数形式“一个(a)”，“一(an)”，和“该(the)”包括单数和/或复数个对象。还需要理解的是，在给出参数范围的情况下，其范围通过给出数值来确定界限，该范围被认为包括这些限定值。

本发明提供一种培养基以及生产多肽的方法，其中，该多肽的C-末端α-酰胺化Pro的量减少了和/或C-末端赖氨酸的量增加了。如果不抑制生长和生产率，规定的浓度硒(Se)和锌(Zn)可用于高品质，无免疫原性治疗用(glyco-)多肽的生产用途，例如，大规模的生物加工生产。

因此，本发明涉及一种细胞培养基，用于控制细胞培养物中的至少一种表达多肽的氨基酸残基的α-酰胺化或C-末端分裂，其中该培养基包含，或基本上由，或由至少一种必需的微量元素或包含该元素的化合物，该元素作用于肽酰甘氨酸[α]-酰胺化单加氧酶(PAM)或羧肽酶(CP)。

尽管基于关于多种活化剂和PAM酶抑制剂所有可用的数据，本发明的发明人惊奇地发现，硒对PAM活性有重大影响。通过在生产(发酵)培养基增加硒的浓度，超过迄今已知的包括在极少数的市售培养基中(IMDM0.067μM，高级DMEM0.03μM，高级RPMI0.03μM，高级MEM0.03μM)的最大浓度约0.1μM，如本发明的实施例中，为能够抑制PAM酶的活性，所得的重组多肽产物的C-末端α-酰胺化显著地减少。

另外，通过在生产(发酵)培养基中降低锌离子浓度，可以抑制CP的活性，从而导致C-末端赖氨酸的量增加，以及随后而至的甚至更低的C-末端α-酰胺化的量。因此，本发明提供了令人惊奇的发现，即通过修改在生产培养基中的两个必需的微量元素(添加剂)的浓度，可以生产具有可靠的C-末端异质性的产物。

根据本发明的第一个“单变量(univariate)”方法，对几种已知的PAM酶抑制剂进行了测试，但他们中的绝大多数会导致生产率降低或细胞培养性能变差。在第二个“多变量(multivariate)”方法中，生产培养基被分成几个组成部分，并采用实验(DOE)的设计方式进行测试。发明人惊奇地发现，硒对在体内C-末端α-酰胺化脯氨酸的形成具有重大的负面影响。通过在生产培养基中增加硒浓度至亚毒性水平，细胞培养物的性能和生产率仍保持在可接受的和-最重要的-PAM酶的活性可以被抑制。因此，所得到的多肽产物表现出C-末端α酰胺化脯氨酸的量的显著降低(见实施例11，以及图11和12)。

鉴于这些发现，本发明自然地延伸到细胞培养方法，用于控制细胞培养物中的至少一种表达多肽的氨基酸残基的α-酰胺化C-末端分裂，该方法包括或基本上由至少以下步骤构成：加入至少一种必需的微量元素至包含或基本上由宿主细胞产生多肽的培养基中，及发酵并回收该多肽。

换句话说，本发明涉及一种减少重组表达多肽的异质性的方法，包括从细胞培养物中获得的抗体，该方包括步骤：加入至少一种必需的微量元素至该细胞培养基中，该微量元素能够减少和/或抑制肽酰甘氨酸[α]-酰胺化单氧酶(PAM)或羧肽酶(CP)的活性，以获得具有减少了异质性的多肽。此外，还加入另一种能够减少和/或抑制CP酶的活性的必需的微量元素。

在一个优选的实施方案中，必需的微量元素，或其添加剂，降低了C-末端的C-末端[α]-酰胺化脯氨酸的量或增加了C-末端赖氨酸的量。

按照本发明，本领域技术人员将理解，该培养基可以补充必需的微量元素(多个)或具有仿制的必需微量元素(多个)，其表现出与必需的微量元素(多个)相同的效果。按照本发明，必需的微量元素是离子或其所对应的盐或包含该离子或其所对应的盐的化合物。在一个优选的实施方案中，必需的微量元素选自如下一组物质：硒(Se)，锌(Zn)和/或铜(Cu)。如上述所定义，硒，锌和/或铜的任何合适的盐都是可用的，或包含，包括或基本上由硒(Se)，锌(Zn)和/或铜(Cu)离子构成的的任何有机或无机化合物也是可用的，只要各化合物显示出对本发明的C-末端脯氨酸α-酰胺化或C-末端赖氨酸分裂的作用。

在这些DOE实验中，发现了第二个令人惊讶的观测。锌被发现是CP酶的主要体内活化剂，如实施例5和9以及图5，6和9所示。通过在生产培养基中减小锌的浓度，降低了CP酶的活性，且相应的重组产物表现出增加了C-末端赖氨酸的量(参见实施例11以及图14)。与具有预定C-末端异质性(依据α-酰胺化脯氨酸和/或赖氨酸)的参考产品相比，硒浓度的增加和锌浓度的减少导致在重组多肽产物的C-末端的异质性减少。通过调节生产培养基中的Se和Zn的浓度，产生的蛋白质的C-末端异质性(依据α-酰胺化脯氨酸和/或赖氨酸)可以调整到参考蛋白的各个C-末端的异质性。可以降低C-末端α-酰胺化脯氨酸的量且可以增加C-末端赖氨酸的量。

另外，本发明的发明人惊奇地发现，即使细胞培养基的锌具有较低浓度，宿主细胞的生长，以及各自的多肽表达也不会受损害。

因此，本发明涉及一种培养基或一种方法，其中必需的微量元素或其添加剂降低了C-末端α-酰胺化的形成或增加了C-末端赖氨酸的量。在一个优选实施方案中，有效量的硒加入至细胞培养基或在本发明方法中使用的培养基中，用于控制α-酰胺化。进一步地，在本发明的优选的实施方案中，有效量的锌加入至细胞培养基或在用于控制氨基酸残基的C-末端分裂和/或用于控制α-酰胺化方法使用的培养基中。

对本领域的技术人员是显而易见，如上所定义的至少一种必需的微量元素优选为硒，其可以在培养过程的一开始就添加到培养基中，或者加入至已经含有一定浓度的硒的培养基中，以将表达多肽的α-酰胺化保持在低水平，即减少或抑制C-末端α-酰胺化过程。从而本发明的方法可以用于调节、控制、减少或降低重组表达多肽的异质性，例如在其C-末端的αPro氨基残基表现的蛋白质或肽。与极少数市售的具有0.173μM硒，和/或2.04μM铜和/或22μM锌离子的培养基相比，减少培养基中的锌浓度，将附加地改善如上所述的C-末端α-酰胺化的减少。当在低铜离子浓度培养的细胞表达所需的多肽时，例如，在低于2.04μM浓度，可以实现进一步的改进。在期望具有α-酰胺化和非α-酰胺化/脱酰氨基的多肽的异质群体情况下，该硒添加物可以在培养过程中稍后的时间点添加到细胞培养基中。

因此，在一些实施方式中，本发明提供了细胞培养基或在细胞培养物中产生糖蛋白的方法，其通过加入有效量硒，和/或锌及/或铜至培养基中以调节糖蛋白的C-末端α-酰胺化和/或氨基酸残基的C-末端分裂。在一些实施方式中，有效量是指足以抑制或降低PAM的活性。在一些实施方式中，有效量是足以抑制、影响、减少或降低CP的活性。

在本发明的一个优选实施方式中，硒被用于控制α-酰胺化。

本发明中所用的硒化合物提供的硒离子可以是任何生理上可接受硒盐，包括水溶性的(包括微溶于水的)有机和无机硒盐或酯。其他优选的化合物为亚硒酸钠，硒酸盐，硒，二价硒或亚硒酸。其他硒化合物如硒蛋氨酸，硒半胱氨酸，硒富马酸盐，2-硒基-5-甲基氨基甲基-尿苷和硒代蛋白质都可以使用。按照本发明，硒离子，优选使用亚硒酸钠的形式。因为亚硒酸钠是具有很强的毒性硒化合物，亚硒酸钠可以被替换为不同的硒的形式，它具有与高剂量的亚硒酸钠相同的生物活性但具有较低的毒性。进一步地，合适的化合物或者含有硒化合物或模仿硒的控制α-酰胺化的功能，例如，硒的同位素或游离基，或在周期系统属于相同化学基团中的同位素或游离基元素，这是如上所定义的或本领域技术人公知的。

在本发明的进一步优选的实施方式中，锌被用于控制的氨基酸残基的C-末端分裂和/或用于控制α-酰胺化。

本发明中所用的锌化合物提供的锌离子可以是任何生理上可接受的锌盐，包括水溶性(包括微溶于水的)有机和无机锌盐或酯。其他优选的化合物是微溶的锌盐，其中柠檬酸锌、氯化锌、或硝酸锌是最优选的。可以采用的合适的锌盐的例子包括：醋酸锌、氟化锌、硫酸锌铵、甲酸锌、溴化锌、碘化锌、氯化锌、硝酸锌、铬酸锌、锌、苯酚磺酸、柠檬酸锌、水杨酸锌、锌连二、硫酸锌、氟硅酸锌、葡萄糖酸锌、酒石酸锌、锌琥珀酸盐、甘油磷酸盐锌、以及它们的混合物。可使用的含Zn化合物包括但不限于：Zn(NO₃)₂、ZnBr和ZnSO₄.7H₂O。优选地，所用的锌化合物是锌氯化物(含有或不含2H₂O的ZnCl₂)或七水硫酸锌(ZnSO₄.7H₂O)。通常，根据本发明给出的锌浓度为1×培养基。根据本发明，优选使用锌离子的形式为氯化锌((ZnCl₂)。

根据本发明的另一优选的实施方式中，任何有机或无机化合物为适于将培养基的锌浓度减少至能降低或减少如上所定义的CP活性。

如实施例所示，本发明的添加很少量的铜离子至培养基中或在方法中使用的添加物导致组合或协同作用，其中产生的多肽的非α-酰胺化Pro残基会进一步增加。因此，根据本发明的细胞培养基或在本发明的方法中使用的培养基包含有效量的铜或其添加物。

本发明中使用的铜化合物提供的铜离子可以是任何生理上可接受的铜盐，包括水溶性(包括微溶于水)的有机和无机铜盐或酯。其他优选的铜盐或酯是公知的，如硫酸铜，水杨酸铜C₇H₄O₃Cu-H₂O，氢氧化铜或氯氧化铜。按照本发明，铜离子优选使用的形式为氯化铜。

包含主链嵌段共聚物、有机聚合物的聚合硒，锌或铜，其中释放约束的硒，锌或铜离子至有机化合物中是公知的现有技术。

因此，鉴于本发明所实施的实验和示出的实施例，本发明的目的是提供一种方法或培养基，其中该培养基包括如下至少一种必需的微量元素或其组合物：硒(Se)的浓度范围为大于0.175μM至约2.98μM，优选为1μM至2.4μM，和/或锌(Zn)的浓度范围约为0.2μM至约20μM，优选为大于3μM至15μM，和/或铜(Cu)的浓度范围约为0.18μM至约0.8μM。

在一些实施方案中，锌(Zn)，硒(Se)和/或铜(Cu)的浓度可以是，例如，大于下列一种或多种值：0.005μM、0.006μM、0.007μM、0.008μM、0.009μM、0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.10μM、0.11μM、0.12μM、0.13μM、0.14μM、0.15μM、0.16μM、0.17μM、0.18μM、0.19μM、0.20μM、0.21μM、0.22μM、0.23μM、0.24μM、0.25μM、0.30μM、0.35μM、0.40μM、0.5μM、1.0μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2.0μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、3.0μM、5.0μM、10.0μM、11.0μM、12.0μM、13.0μM、14.0μM、15.0μM、16.0μM、17.0μM、18.0μM、19.0μM、20.0μM、21.0μM、22.0μM、23.0μM、24.0μM、25.0μM、26.0μM、27.0μM、28.0μM、29.0μM或30.0μM。

应当指出的是，在补料溶液中，硒、锌和/或铜的浓度可以比在细胞培养基或细胞培养液的浓度明显更高，例如高至3μM。

上述定义的必需的微量元素作为可以在细胞培养过程的开始添加到培养基中。或者，必需的微量元素可以在细胞培养过程，例如作为补料成分加入至培养基中。在一个优选的实施方案中，离子被单独或组合分批加入到补料分批培养系统中，其含有或不含有本文描述的或为哺乳动物细胞培养领域技术人员已知的其他适当的营养物质。

因此，在一实施方式中，在本发明的培养基或过程中，相比使用含有2.04μM的铜和0.173μM硒的标准培养基，表达多肽的C-末端的α-酰胺化Pro的量减少了，在本发明的一个优选实施方式中，培养基中含有2.3μM±0.6μM的硒，优选地，其中该培养基还包含0.4μM±0.5μM的铜。

根据上述描述，本领域技术人员需要理解的是，该培养基还包括有效量的锌和/或铜以使能够进一步降低、抑制或降低C-末端氨基酸α-酰胺化的速率、数量或比例。

在本发明的上下文中，术语减少锌浓度至“最低水平”应被理解为其中细胞仍可以生长，并且能够产生足够量的多肽(如糖蛋白)的水平。本文中细胞生长和生产率的足够量被理解为在培养14天后产生至少1克/升，且在培养14天后至少生长出2×10⁶个细胞/mL。

其结果是，相比使用使用了22μM的锌离子的标准培养基，产生的糖蛋白增加了，即可以表现出具有增加量的C-末端赖氨酸。因此，在PAM酶不能使得C-末端Pro残基α-酰胺化，这是由于赖氨酸氨基酸的存在，从而导致非α-酰胺化糖蛋白的生产/量增加了。

因此，本发明的培养基或方法涉及采用锌用于控制氨基酸残基的C-末端分裂和/或用于控制α--酰胺化。此外，在根据本发明的一实施例，相比使用含有22μM的锌离子的标准培养基，表达多肽的C-末端赖氨酸的量增加了，优选其中培养基中含有2.3μM至11μM±0.5μM的锌。在一个优选的实施方案中，锌的浓度超过3μM，其中，“超过”表示锌离子浓度高于3.00μM、例如3.05μM、3.1μM，3.2μM、3.3μM、3.4μM、3.5μM。术语“超过”等效地定义为硒和铜的浓度。在本发明的进一步的实施方案中，相比使用含有22μM的锌的标准培养基，C-末端的赖氨酸的量提高到10％，15％，优选为16％±0.79％。

从本发明的方法获得的多肽可以用于药物制剂和/或组合物的制备，或者作为诊断或治疗的组合物。因此，所获得的多肽可以与其它生物活性成分一起给药，如药学上可接受的表面活性剂，受体，载体，稀释剂和媒介物和/或进一步的诊断或治疗性化合物，例如标记物或附接或连接至多肽的药物。任选地，与如下所述硒，锌和/或铜或的化合物组合物的量一起使用。

本发明的培养基或方法可以在任何培养方法中使用，但对于真核细胞，尤其是生物分子产生细胞是特别优选的。生物制品可以包括疫苗产品，蛋白质产品，糖蛋白产品，抗体或抗原产品，核酸产品，细胞器产品，脂质产品，碳水化合物产品等。按照本发明优选的为多肽产品。

多肽由表达系统产生，也称为细胞基表达系统，其中在本发明的培养基培养的宿主细胞表达该多肽。在一个优选的实施方案中，通过诱导编码基因的异源表达以在宿主细胞提供相应的多肽。在本发明的另一优选实施方案中，该异源表达发生细胞基表达系统中。这样的细胞基表达系统作为宿主细胞在本发明的方法中使用，以使在本发明的培养基中表达该多肽。

如上述所定义的宿主细胞包括核酸，例如相应多肽的活性基因编码，且该核酸在培养基中培养细胞期间转录并翻译。该基因可被引入至宿主细胞作为外源基因，优选具有调节(调控)元素(参见，例如，EP-B0148605)，或者已经存在于该宿主细胞作为有效的内源性基因或能被激活为内源性非活性基因。内源性基因的激活可以通过同源重组特别引入调节(调控)元素至基因组来实现，参见其他阅读材料国际申请WO91/09955和WO93/09222。在本发明的优选实施例中，该表达为异源蛋白表达。

不受理论的束缚，本发明使用的培养基或在方法中所使用的培养基是适合培养上述定义的任何表达宿主，其能够表达带有至少一种翻译后Pro-NH₂的多肽。本领域技术人员应该了解合适的宿主细胞特有的培养基成分和培养方法。

在进一步优选的实施方案中，本发明的真核细胞基表达系统包括真核宿主细胞，其中该真核细胞是选自或基本上选自如下一组物质：昆虫细胞，植物细胞，藻类细胞，真菌细胞，哺乳动物细胞，动物细胞和/或低等真核生物如丝状真菌或酵母细胞。在一个优选的实施方案中，真核细胞基表达系统是哺乳动物系统。

根据本发明，昆虫，植物，藻类，真菌，哺乳动物，动物/或低等真核生物物种可被用作细胞基表达系统，其可以是任何可被遗传操纵以携带的转基因的物种，这在本领域中是公知的。

在另一个优选的实施方案中，该真核细胞基表达系统基本上由或包括或选自如下一组物质：

幼仓鼠肾细胞系(例如，BHK21)

中国仓鼠卵巢细胞系(例如，CHO-K1，CHO-DG44，CHO-DXB，或CHO-的dhfr^-)

鼠骨髓瘤细胞系(例如，SP2/0)

小鼠骨髓瘤细胞系(例如，NS0)

人胚肾细胞系(例如，HEK-293)

人类视网膜来源的细胞系(例如，PER-C6)，和/或

羊水细胞系(例如，CAP)。

优选地，采用仓鼠细胞系的表达系统。BHK21(“幼仓鼠肾”)细胞属于叙利亚仓鼠细胞的准二倍体系，来自新生鼠肾组织的不同寻常的快速增长原始培养的克隆。非限制性实施例为BHK-21细胞系，这是可商购的，并且可以在本发明的上下文中使用的是BHK-21(C13)、BHK21-pcDNA3.1-HC、BHK570、Flp-In-BHK细胞系、和/或BHK21(克隆13)仓鼠细胞系。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是来源于中国仓鼠卵巢的细胞系。它们经常被用于生物和医学研究和商业化生产治疗性蛋白，其在上世纪60年代引进，并最初成长为单层培养。如今，CHO细胞是工业生产的重组蛋白治疗剂的最常用的哺乳动物宿主，其通常生长在悬浮培养物中。

CHO细胞系的非限制性实施例是可商购的，并且可以在本发明的上下文中使用的是FreeStyleCHO-S细胞、ER-CHO细胞系、CHO1-15500CHINESEHAM、CHO-DXB、CHO-dhfr-、CHODP-12clone#1934、CHO-CD36、CHO-ICAM-1、CHO-K1、卵巢、HuZP3-CHOLec3.2.8.1、xrs5、CHO-K1/BB2细胞、CHO-K1/BB3细胞、CHO-K1/EDG8/Galpha15细胞、CHO-K1/M5细胞、CHO-K1/NK1细胞、CHO-K1/NK3细胞、CHO-K1/NMUR1细胞、CHO-K1/NTSR1细胞、CHO-K1/OX1细胞、CHO-K1/PAC1/Gα15细胞、CHO-K1/PTAFR细胞、CHO-K1/TRH1细胞、CHO-K1/V1B细胞、5HT1AGalpha-15-NFAT-BLACHO-K1细胞系、AVPR2CRE-BLACHO-K1细胞系、CHO-S细胞SFMAdapted、DG44细胞、Flp-In-CHO细胞系、GeneSwitch-CHO细胞系、NFAT-blaCHO-K1细胞系、T-REx-CHO细胞系、GenoStatCHOK-1稳定细胞系、GenoStatCHOK-1稳定细胞系盒、CHO-K1细胞系仓鼠、CHO-PEPT1细胞系。在一个特别优选的实施方案中，仓鼠细胞系表达系统是CHO-dhfr-细胞系。

在本发明的另一优选实施方案中，该异源表达发生在真核细胞基表达系统中。优选地，所表达的蛋白质是选自如下一组物质中的至少一种蛋白质：

抗体，或其片段或衍生物，

融合蛋白，和/或

非抗体蛋白。

优选地，根据本发明的方法和培养基都适合蛋白质的(重组)生产，其包含与以下蛋白的全部或部分或之一具有相同或基本相似的氨基酸序列：Flt3配体，CD40配体，红细胞生成(erythropoies)是刺激如红细胞生成素(EPO)的蛋白质，达贝泊汀(darbepoetin)包括α达贝泊汀，和血小板生成素，降钙素，瘦蛋白，Fas配体，NF-kappaB(RANKL)受体激活剂的配体，肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)，胸腺基质衍生淋巴细胞生成素，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，生长因子，包括肥大细胞生长因子，干细胞生长因子，表皮生长因子，角质细胞生长因子，巨核细胞生长发育因子，RANTES，生长激素，胰岛素，促胰岛素，类胰岛素生长因子，甲状旁腺激素，干扰素，包括α-干扰素，β-干扰素和γ-干扰素，神经生长因子，脑源性神经营养因子，突触结合蛋白样蛋白(SLP1-5)，神经营养蛋白-3"胰高血糖素，白细胞介素包括IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，和IL-18，集落刺激因子，淋巴毒素磷，肿瘤坏死因子(TNF)，白血病抑制因子，制瘤素-M和各种细胞表面分子ELK和HeK配体(如eph-相关激酶或LERKS配体)。

本发明的方法和培养基可以进一步用来生产蛋白质，包括全部或部分可用于任何上述蛋白质的受体的氨基酸序列的蛋白质，上述任何蛋白质的受体的拮抗剂，和基本上类似于这样的受体或拮抗剂的蛋白质。

另外，本发明的方法和培养基可以进一步用来生产蛋白质，包括所有或部分分化抗原(称为CD蛋白质)的氨基酸序列或基本上类似于上述任意蛋白质的配体或蛋白质。这种抗原的实施例为分化抗原，包括CD20，CD22，CD27，CD30，CD39，CD40，和其配体。

酶促活性的蛋白质或它们的配体也可以使用本发明的方法和培养基来生产。具体地实施例包含以下全部或部分或其中之一的蛋白质，或它们的配体，或基本上类似于这些中全部或部分或其中之一的蛋白质：金属蛋白酶解整合素家族成员，激酶，葡糖脑苷脂酶，超氧化物歧化酶，组织纤溶酶原激活物，因子VIII，因子IX，载脂蛋白E，载脂蛋白A-1，球蛋白，和IL-2拮抗剂，α-1抗胰蛋白酶，肿瘤坏死因子-α转化酶，上述任何酶的配体，以及众多的其它酶和它们的配体。

本发明的方法和培养基也可用于在体外生产嵌合蛋白，该嵌合蛋白结合至特定的目标蛋白质且修饰其活性，以及其抗体或嵌合抗体，即具有耦合到一个或多个鼠抗体免疫球蛋白变量域，或其片段或基本类似的蛋白质的人恒定抗体免疫球蛋白结构域的抗体。本发明的方法也可用于生产偶联物，其包含抗体和细胞毒性或发光物质。抗体的例子，在体外选择的嵌合蛋白，或者说，可使用本发明的方法和培养基来制备包括抗体和细胞毒性或发光物质的偶联物。抗体，体外选择的嵌合蛋白，或抗体/毒素或抗体/发光体偶联的实施例能够识别任何一种或蛋白质的组合，包括但不限于任何上述的蛋白质和/或以下的抗原：CD2，CD3，CD4，CD8，CD11a，CD14，CD18，CD20，CD22，CD23，CD25，CD33，CD40，CD44，CD52，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD147，IL-La，IL-1，IL-2，IL-3，IL-7，IL-4，IL-5，IL-8，IL-10，IL-2受体，IL-4受体，IL-6受体，IL-13受体，IL-18受体亚基，PDGF-β，和它们的类似物，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子(TGF)，TGF-β2，TGF-p1，EGF受体，VEGF受体，肝细胞生长因子，骨配体，干扰素γ，B淋巴细胞刺激，补体C5，IgE，肿瘤抗原CA125，肿瘤抗原MUC1，PEM抗原，ErbB2的/HER-2，存在在患者的血清中的水平升高的肿瘤相关表位，癌症相关的抗原表位或在乳腺，结肠，鳞状细胞，前列腺，胰腺，肺，和/或肾细胞表达的蛋白质，和/或在黑色素瘤，神经胶质瘤，神经母细胞瘤或细胞，肿瘤坏死核心，整联蛋白α4的β7中，整合VLA-4，B2整合素，TRAIL受体1,2,3，和4，RANK，RANK配体，TNF-α，粘附分子的VAP-1，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，细胞间粘附分子3(ICAM-3)，白色整合素粘附(leukointegrinadhesin)，血小板糖蛋白的gpIIb/IIIa受体，心脏肌球蛋白重链，甲状旁腺激素，MHCI，癌胚抗原(CEA)，甲胎蛋白(AFP)，肿瘤坏死因子(TNF)，Fc-γ-1受体，HLA-DR10β，HLA-DR抗原，L-选择素，和IFN-γ。

当然，在进一步的方面，本发明可以扩展成通过本发明的方法获得多肽。在一个优选的实施方案中，优选地，相比于在如上概述或在实施例参考培养基中表达的相同的多肽，多肽包含少于30％，25％，20％，18％，17％，16％，15％，14％，13％，12％，11％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2.5％和/或2％C-末端α酰胺化脯氨酸。在特别优选的实施方案中，多肽包含小于5％的C-末端α酰胺化脯氨酸。

本发明的方法和培养基也可用于生产重组融合蛋白，其包含任何上述的生物分子，如蛋白质或基本相似的蛋白质。例如，重组融合蛋白包含一种上述蛋白质加上多聚化结构域，如亮氨酸拉链，卷曲螺旋，抗体的Fc部分，或基本上类似的蛋白质，可以使用本方法和培养基来制备。明确包括在这类重组融合蛋白是至少部分的TNFR或RANK被融合到抗体的Fc部分的蛋白质。

在另一个优选的实施方案中，该方法发生方法发生在至少一种选自如下一组生物反应器或培养容器中：

摇瓶

T-瓶

反应袋

滚瓶

生物反应器，和/或

旋转瓶。

优选地，该生物反应器或培养容器可以有50ml至4000L的体积。标准的生物反应器或培养容器大小示例为：50ml(如摇瓶或T-瓶)，500ml，2L，5L，15L，100L和300L(如生物反应器或反应袋)，和1000L，2000L，5000L，10000L，25,000L和40000L(大生物反应器)。

在另一个优选的实施方案中，细胞的培养是贴壁培养，例如在单层培养。根据另一个优选的实施方案中，细胞的培养也可发生在悬浮培养中。

本发明可以采用连续和非连续细胞培养。其他已知的反应器技术，例如灌注技术或类似物也可以采用。分批法和补料-分批法是特别优选的实施方案。

按照上述情况，本发明第一次提供了硒离子能够调节或延缓PAM酶的作用或活性的知识。因此，本发明自然延伸在另一个实施方案，使用硒或其盐作为PAM酶的抑制剂。此外，本发明的另一个目的是提供一种使用锌或的其盐作为羧肽酶(CP)的活化剂。

本发明还提供试剂盒在培养细胞的培养中的用途。根据本发明，试剂盒包含一个或多个容器，其中至少一种第一容器包含本发明的培养基，或至少包含硒，锌和/或铜。此外，本发明的其它试剂盒包括一个或多个容器，其中第一容器包含基础培养基，且第二容器包含一种或多种如上所定义必需的微量元素，优选地增加其浓度，即浓缩形式。优选地，溶液包含成分的浓度较在1x培养基制剂含有相同的成分的浓度更高。该成分可以是10倍浓缩(10x制剂)，25倍浓缩(25x制剂)，50倍浓缩(50x制剂)，或100倍浓缩(100x制剂)。一些或所有以上所列的成分，当在溶液中混合在一起时，可形成一个“基础培养基”。这些试剂盒还可以包括一个或多个额外的容器，该容器中含有一种或多种补充剂，如细胞因子，氨基酸，维生素，无机盐，糖，缓冲剂盐，脂质，胰岛素(或胰岛素替代物)和/或转铁蛋白(或转代用品，和/或动物肽，和/或酵母肽和植物肽)，或它们的任意组合。该试剂盒可以包含液体或固体粉末形式的培养基或两者的组合。此外，该试剂盒还可以包括分批培养细胞。

按照本发明，该培养基或任何上述组合物和/或溶液可以为液体或固体粉末，或两者的组合，一种液体溶液包含浓缩的成分，或准备使用的培养基或组合物。该粉末可以通过蒸发1x，2x，3x，4x，5x，10x，20x，40x的水含量而产生50x或100x浓缩或x-倍的浓缩的细胞培养基溶液或组合物。可替代地，培养基成分以干燥形式加入至合适的浓度，即以如上述定义的x倍浓缩的形式加入至容器。

进一步地，本发明提供了用于细胞生长的组合物，该组合物包含如上定义的至少有效量的硒。在一个优选的实施方案中，组合物进一步包含如上定义的至少有效量的锌。任选地，该组合物可以进一步包含如上所述的一种或多种细胞。在本发明的进一步优选的实施方案中，该组合物包括如上定义的基本上由培养基组成的组合物。

声明

提供了全面的公开内容而不过度在说明书中进行延伸，申请人通过引用并入以上的每个引用专利和专利申请。

在上面详细的实施例的元件和特征的特定组合仅是示范性的，在不脱离本申请的教导和通过引用并入的专利或其他教导的互换和取代也是可以预期的。正如本领域的技术人员将认识到，在不脱离本发明的范围和权利的精神，本领域的普通技术人员可以做出改变，修改，和其它在此所描述的实施方式。因此，前面的描述仅是通过实施例方式，并不旨在限制性的。本发明范围由以下权利要求及其等同物限定。

实施例

本发明的其他细节，特征，特性和目的优点在从属权利中以及相应的附图和实施例公开，以下采用示范性的方式进行描述，其中，仅仅用于展示本发明优选的实施方案。然而，这些附图和实施例不应理解为限制本发明的范围。

常规方法的详细描述，例如那些本文所用的，可以在所引用的文献中找到，参见第十七版“诊断与治疗的默克诊疗手册(TheMerckManualofDiagnosisandTherapy)”，由Beers和Berkow编辑(Merck&Co.,Inc.2003)。

除非另有说明，本发明的实践将采用通常的细胞生物学，细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，重组DNA和免疫学的技术，这些都在本领域的技术范围内。为了进一步在本发明中阐述一般技术，实践者可以参照细胞生物学和组织培养的标准教科书和评论；也可参见实施例中列举的参考文献。分子和细胞生物化学一般方法可以在如分子克隆的这样标准教科书中找到：LaboratoryManual,3^rdEd.(Sambrook等.,HarborLaboratory出版社2001)；ShortProtocolsinMolecularBiology,4^thEd.(Ausubel等编辑,JohnWiley&Sons1999)；DNACloning,卷I和II(Glover编辑,1985)；OligonucleotideSynthesis(Gait编辑,1984)；NucleicAcidHybridization(Hames和Higgins编辑.1984)；TranscriptionAndTranslation(Hames和Higgins编辑.1984)；CultureOfAnimalCells(Freshney和Alan,Liss,Inc.,1987)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(Miller和Calos,编辑)；CurrentProtocolsinMolecularBiologyandShortProtocolsinMolecularBiology,3^rdEdition(Ausubel等,编辑)；及RecombinantDNAMethodology(Wu,等,学术出版社).GeneTransferVectorsForMammalianCells(Miller和Calos,编辑,1987,ColdSpringHarborLaboratory)；MethodsInEnzymology,卷154和155(Wuetal.,eds.)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRL出版社,1986)；Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；thetreatise,MethodsInEnzymology(学术出版社,Inc.,N.Y.)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker,编辑,学术出版社,London,1987)；HandbookOfExperimentalImmunology,卷I-IV(Weir和Blackwell,编辑,1986).ProteinMethods(Bollag等,JohnWiley&Sons1996)；Non-viralVectorsforGeneTherapy(Wagner等编辑,学术出版社1999)；ViralVectors(Kaplitt&Loewy编辑,学术出版社1995)；ImmunologyMethodsManual(Lefkovits等,学术出版社1997)；及CellandTissueCulture:LaboratoryProceduresinBiotechnology(Doyle&Griffiths,JohnWiley&Sons1998).在本公开中提到试剂，克隆载体和试剂盒的的遗传操作可从商业供应商获得，如BioRad,Stratagene,Invitrogen,Sigma-Aldrich,和ClonTech.此外，国际申请PCT/EP2011/069756或PCT/EP2013/057866的公开内容，特别是在各自的实验部分使用的方法，在此通过引用并入本文。

实施例1：PAM抑制剂对氨基酸酰胺化/脯氨酸酰胺形成的影响

实验(使用不同说明性的糖蛋白)在摇瓶(SF)系统中实施，其中，所采用的500L的SFs的终体积为125ml。所有的实验以解冻研究工作细胞库(rWCB)作为开始，如CHO细胞系DP-12(CHODP-12clone#1934[CHODP-12，clone#1934aIL8.92NB28605/14](CRL-12445TM)产生的重组人抗IL-8或CHO-SSF细胞表达的单克隆抗体以指向肿瘤坏死因子，TNF(参见PCT/EP2011/074181获得进一步的细节)，随后按照制造说明在标准条件下准备几个移种，直到对于所有的实验有足够的细胞用于接种，在14天内采用补料进行一般的分批发酵，一般的饲养方式包括供给葡萄糖，谷氨酰胺和氨基酸。所有SFs在摇床培养箱(Kuhner，Switzerland)中进行培养，培养条件如下：温度为36.5℃，CO₂＝10％和振荡速度为200rpm。所有实验中采用相同的内部生长和生产培养基，其表现出相似的成分且与WO2011/134920国际申请中描述的例子发酵培养基相似的成分。

为了评估微量元素的影响，选择的微量元素的浓度根据所建议值进行了系统的变化。所有的结果最终在生物反应器(BR)系统中确定，其中采用5L玻璃生物反应器。

在SF和BR这两种系统中，采用Vi-CellXR分析仪(BeckmanCoulter)测定细胞生长和细胞活性，使用锥虫蓝排除法测定细胞活性并自动化细胞计数测定细胞浓度。单克隆抗体含量通过亲和液相色谱(ALC)来确定。校正曲线是由稀释通用参考来制定的。针对两种单克隆抗体的摩尔消光系数差异，采用适当的响应因子对所获得的结果进行校正。结果以每升(L)产物的蛋白质克(g)表示。

在BR和SF生物过程14天结束时(即第14天)，收获取样至50ml离心管中。将培养物离心分离(3220g，15分钟)，无菌过滤(MilliporeSteriflip，SCGP00525)，以及使用MabSelectSuRe亲和柱进行单一纯化步骤对收获的样品进行纯化。使用AKTA色谱系统与1ml的HiTrap柱(GEHealthcare，目录号11-0034-93)或具有200μl的Robo柱的TECAN自由EVO移液站(Atoll，目录号01050408R)完成纯化步骤。

为了测量C-末端α-酰胺化Pro的量和C-末端赖氨酸的量，根据实验室程序进行阳离子交换层析(CEX)。主要负责变体被指定为0K，伪1K(1+)和伪2K(2+)。正电荷涉及重链的C-末端的Lys或α-酰胺化Pro。带电变体(Lys，α-酰胺化Pro)的差别在于C-末端赖氨酸的CP分裂，随后用相同的CEX分析鉴别。在三种变体之前的结构洗脱被指定为AP(酸性峰)和那些在他们之后洗脱称为BP(基本峰)。

实施例2：单个微量元素的浓度评价

对单个微量元素在C-末端α-酰胺化的不同浓度进行了研究实验。为检测对PAM活性产生重大影响的微量元素，首先使用MINResIV法筛选设计(设计专家软件)对包括在高浓缩平台培养基的6组微量元素进行了测试。以下仅对C-末端α-酰胺化表现出显著影响的这些微量元素进一步讨论，并在下面进行详细描述。因此，对于所测试的元素，即，硒，锌和铜的浓度如下面的表1中所述。

表1微量元素的MINResIV设计的设置

该实验在500ml的SF中进行，其终体积为125ml。在采用分批补料生物方法培养14天后，收集产品，离心，通过PES膜进行无菌过滤，并立即进行单步亲和层析(AC)的纯化和通过排阻色谱(SEC)对C-末端α-酰胺化进行后续分析。采用设计专家版本7.1.3(Stat-Ease，Inc.,明尼阿波利斯，美国)构建响应面设计并对实验结果进行统计分析。采用MINResIV设计来确定测试的微量元素对所研究单克隆抗体的细胞的生产率，C-末端α-酰胺化和C-末端羧基肽(carboxypeptidation)的影响。分析设计专家(Stat-Ease，Inc.,明尼阿波利斯，美国)响应包括补料浓度的终点，C-末端α-酰胺化Pro的量和C-末端赖氨酸的量。

实施例3：硒和锌的浓度的增加会增加每升(L)产物的蛋白质克(g)

测试的微量元素对滴定量(克每升)的标准化影响首次生动地显示在排列图上，其中(被测元素)的主要影响通过点击明显大于其他的影响而选中。上述影响超过了Bonferroni上限是非常显著的，且该影响超过了t值上限也是非常显著的。低于t值上限的影响没有被选中的，因为影响并不显著。在选择了这些显著影响后，采用ANOVA统计程序来确认包括在模型中的统计学显著影响。培养基添加剂的主要影响在某些响应显示P值低于0.1。

在对滴定量具有重大积极影响的因素(即被测微量元素)中，锌和硒被计算为具有显著的影响，这两个微量元素都在排列图上都超过Bonferroni上限。上面提及的两个微量元素的结合对滴定量具有重大影响，这是由于两者之间的相互作用在排列图上会超过t值上限(图1)，通过在生产培养基把锌的浓度从2.201μM增加至22.012μM，并将硒的浓度从0.017μM增加至0.173μM，滴定量分别从0.4g/L增加至0.6g/L或0.5mg/L。通过增加锌和硒的浓度，滴定量从0.4g/L增加到0.65g/L以上(图2)。

实施例4：硒(Se)和铜(Cu)对C-末端α-酰胺化Pro的影响

当分析被测的微量元素对C-末端α-酰胺化的影响时，可以预期锌和铜起着重大影响，并且这两个因素在排列图中远远超过Bonferroni上限。正如预期的那样，铜的浓度降低显示出C-末端α-酰胺化的减少。令人惊讶地，硒浓度的增加对C-末端α-酰胺化(图3)降低显示出主要影响。生产培养基中硒的浓度增加10倍导致C-末端α-酰胺化Pro的量从6.5％减少到4.5％，且铜浓度增加10倍导致C-末端α-酰胺化的量增加了2.5％(图4)。

根据获得的结果可以假设PAM活性可以通过改变生产培养基中的铜和硒的浓度来进行有效地调节。为降低C-末端α-酰胺化，硒浓度必须为最大值(0.173μM)且铜的最小范围内的浓度为(0.2μM)。

实施例5：锌(Zn)显示出对C-末端赖氨酸的存在具有重大影响

因为锌被排除为PAM调节的显著微量元素，测定了锌对C-末端赖氨酸的百分比(量)的作用。赖氨酸通常是C-末端的氨基酸，且是对酶CP作用的基质。如果重组产物具有Pro-Gly-Lys的C-末端序列，则Lys残基必须首先通过CP作用分裂。剩余的末端甘氨酸随后暴露在PAM酶的作用下，其在两个连续的反应(见上述)中产生C-末端酰胺Pro。因此，C-末端α-酰胺化的量间接地取决于CP的作用。

当分析被测的微量元素对C-末端赖氨酸的量的影响时，只有锌被选为对CP酶(图5)具有重大影响的微量元素。将锌浓度的增加10倍，则C-末端赖氨酸的量从22％降低到8.5％(图6)，这意味着锌充当CP的活化剂。

实施例6：微量元素硒，锌和铜的有效浓度评价

在对6组微量元素进行了筛选实验(即实验1)后，可以确定锌、硒、铜对培养性能(滴定量)具有重要影响，C-末端α-酰胺化和C-末端羧基肽。在后续的实验(即实验2)，研究了内部培养基中的这三种微量元素的浓度范围在响应面中心组合设计的影响。

每个选定的微量元素的变化超过5级：加和减α(轴向点)，加和减1(阶乘点)和中央点。因此，建立响应面中心组合设计，其中锌、铜和硒浓度在0.15μM至15μM之间，0.01μM至0.2μM之间，和0.1μM至6μM之间变化。选定的测试浓度列于表2中。

该实验在500ml的SF中进行，其具有125ml的终体积。在采用分批补料生物方法培养14天后，收集产品，离心，通过PES膜进行无菌过滤，并立即进行单步亲和层析(AC)的纯化和通过排阻色谱(SEC)对C-末端α-酰胺化进行后续分析。

表2实验2的控制设置点

在进行上述分析步骤后，将测定值插入DOE程序并进行分析。统计显着性的α值设定为0.100，这意味着P-值大于0.100的因素被排除在统计模式之外，因为它们是非显著的。

实施例7：铁和锌的浓度增加会导致增加每升(L)产物的蛋白质克(g)

对于滴定量，显著二次模型采用p<0.0001值来计算。只有两个被测微量元素计算为对滴定量有显著影响：具有P-值为0.0029的锌和具有p<0.0001的硒。计算了拟合测试的不显著缺乏测试(P-值为0.1506)和“预测R-平方”(0.8251)均与“AdjR-平方”(0.9283)合理地符合。计算了18.856高的“AdeqPrecisior”，这意味着较高的信噪比。该模型也适合横穿设计空间。该模型建议可以通过将锌浓度从7μM增加至12μM从而使滴定量从0.4g/L增加0.6/L(图7)。对于硒，它可以在实施例1～5的实验1中显示，可以通过将硒浓度增加10倍以增加滴定量(图2)。已知的是在发酵培养基中，通常的硒浓度是在约0.01～0.06μM。在实施例6中的实验2中对更高的硒浓度进行了测试。当浓度为3μM，硒对细胞培养是有毒的，其活力下降至低于80％(未显示数据)。因此，高于3μM的硒浓度的负面影响导致滴定量降低(图7)。因此，硒的浓度必须保持在亚毒性浓度。

实施例8：减少Cu浓度结合增加Si浓度会显著降低C-末端α-酰胺化Pro

对于C-末端α-酰胺化，显著二次模型采用p<0.0001值来计算。对所有三个测试因子(锌，铜，硒)进行了计算，其对C-末端α-酰胺化Pro的量具有显著影响，其中锌的P-值为0.0177，铜的p<0.0001和硒的P-值为0.0002。计算了拟合测试的不显著缺乏测试(P-值为0.3239)，这表明该模型可以用来作为预测工具。计算了20.363高的“AdeqPrecisior”，这意味着较高的信噪比。该模型也适合横穿设计空间。该模型建议可以通过降低铜浓度来显著降低C-末端α-酰胺化。通过将铜浓度从0.18μM降低至0.06μM从而将C-末端α-酰胺化Pro的量从2.2％略降低至2.1％。

令人惊奇的是，硒对PAM的酶的活性也有显著负面影响。通过将硒浓度从0.17μM增加至3.00μM，C-末端α-酰胺化Pro的量从2.2％降低至1.26％(图8)。

总之，可以表明，为了将C-末端α-酰胺化Pro的量减少为低于1％，需要降低铜的浓度并增加硒的浓度。

实施例9：增加锌的浓度会降低C-末端赖氨酸的量

在实施例6～8中的实验2中，在分析被测微量元素对C-末端赖氨酸的量的影响时，检测了锌作为辅助因子对调节CP活性的显著重要性。对于CP活性，采用显著二次模型P<0.0001值来计算。锌(P-值<0.0001)计算为影响C-末端赖氨酸的量的主要因素。铜(P-值为0.0080)和硒(P-值为0.0014)对CP的活性的影响也计算了。计算了拟合测试的不显著缺乏测试(P-值为0.2830)和“预测R-平方”(0.9663)均与“AdjR-平方”(0.9977)合理地符合。这表明该模型可以用来作为预测工具。计算了100.942高的“AdeqPrecisior”，这意味着较高的信噪比。该模型也适合横穿设计空间。该模型建议通过将锌的浓度从0.15μM增加至5.00μM，使C-末端赖氨酸的量从15％下降到5％(图9)，这意味着锌可充当CP的主要活化剂。

实施例10：C-末端酰胺化Pro的最小量和C-末端赖氨酸的最大量

在分析实施例2～9的实验2后，使用DOE软件进行数字和图形优化。

首先，对C-末端酰胺化Pro的量的最小化的模型进行了研究。该程序通过使用0.4μM的铜和2.3μM的硒计算了高可取度(desirability)(0.882)，在0.78％和1.52％的预测时间间隔内有95％的C-末端酰胺化Pro的量。

在第二优化步骤中，对C-末端赖氨酸的量最大化的模型进行了研究。该程序通过使用3.67μM的锌，2.3μM硒和0.18μM的铜计算了高可取度(0.920)，在12.27％和13.02％的预测时间间隔内有95％的C-末端赖氨酸的量。

因此，产生了两个新培养基方法。根据铜浓度(0.4μM)和硒浓度(2.3μM)来进行计算，对具有降低铜浓度和增加硒浓度(与定制的内部培养基相比)的发酵培养基采用SF系统进行了三个平行试验。在所有的SF方法中，采用了与前面实验中相同的操作参数。在降低铜浓度和增大硒浓度的培养基中测得C-末端α-酰胺化Pro的量为2.33％±0.09％，因此稍高于预测的时间间隔。将这些结果与内部培养基(2.04μM的铜和0.173μM硒)产生的相应蛋白质测定结果相比，C-末端α-酰胺化Pro的量显著减少了(图10A)。

为了优化(即减少)CP活性，与未改变的内部培养基相比，设计了具有减少锌浓度的培养基，并进行了三组平行测试。通过使用包括2.34μM锌的培养基，降低了CP的活性，因此，C-末端赖氨酸的量从1.99％±0.08％增加至15.97％±0.79％(图10B)。

实施例11：体内数据表明硒为新型的PAM抑制剂

从上述DOE实验中可以得出结论，在发酵过程中，可以通过存在于培养基中某些微量元素调节C-末端α-酰胺化的过程。在以氨基酸序列Pro-Gly-Lys结束的多肽的情况下，需要两种酶作用，即PAM和CP。先前的实验可以表明PAM酶的活性不仅是由公知的锌和铜辅因子来调节的。令人惊奇的是，还发现在培养基中的存在的硒显著降低了PAM酶的活性。这表明了锌对CP酶的活性的重要性。

最后将得到的SF结果在生物反应器(BR)的环境进行测试。所有实验均在5L的BRs中进行。

为了测试硒对PAM活性的影响，对两种培养基组合物进行了测试，即含有0.17μM的硒和2.31μM的培养基。在两种培养基中的细胞培养生长是差不多的，且检测到生存能力无显著减少，这表明增加硒浓度对细胞是没有毒性(图11A)。随着硒浓度的增加，滴定量降低了1g/L(图11B)，这意味着该被测硒浓度的降低了，但仍然具有可以接受的生产率。硒浓度的增加对C-末端α-酰胺化Pro的量有重大影响。当在含有0.17μM的硒的培养基生产重组蛋白质时，所得的肽含有9.3％C-末端α-酰胺化Pro，而在含有2.31μM的硒的培养基情况下，该相应量仅为2.25％(图12)。

获得的结果证明硒是PAM的酶活性的新的抑制因子。因此，在PAM酶的作用-和随后C-末端α-酰胺化Pro的量都可以在体内(即使在大规模蛋白质生产中)显著地通过在发酵培养基中可用的硒浓度进行调节。

为了测试锌对CP活性的影响，对三个不同的氯化锌浓度进行了测试，即3.7μM，11μM和22μM。在含有22μM和11μM的锌的两种培养基中的细胞培养生长是差不多的，而在含有3.7μM的锌的培养基中的生长显著下降(图13A)，这表明不充足量的锌会限制细胞的生长。关于生产率，随着锌浓度的降低，测得恒定降低的生产率。在具有最高锌浓度的培养基中，滴定量达到了3.86g/L，在11μM锌浓度的培养基中，最终滴定量达到了2.90g/L，且在最低锌浓度的的培养基中，最终滴定量仅为1.86g/L(图13B)。

测试了锌浓度的增加对C-末端赖氨酸的量的显著影响。当在含有22μM锌浓度的培养基生产重组蛋白时，所得的肽只有3.15％的C-末端赖氨酸，而在含有3.7μM锌浓度的培养基中，C-末端赖氨酸的含量为6％(图14)。

获得的结果证明锌是在CP酶的活化剂。通过增加锌浓度，CP酶更为活跃，并会导致C-末端赖氨酸的量减少。相反地，通过降低在培养基可用的锌离子浓度，可以增加C-末端赖氨酸的量。反过来，C-末端赖氨酸(间接地)的量增加，会导致C-末端α-酰胺化Pro的量减少。

参考文献

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