人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体RV3A5及其应用

摘要

本发明公开了一种人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体RV3A5，该抗体运用噬菌体抗体库技术筛选获得。本发明的抗体特异性识别狂犬病毒颗粒抗原，且均针对狂犬病毒糖蛋白G，与狂犬病毒具有明显的免疫荧光反应和酶联免疫反应，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。可将本发明抗体制成预防和治疗狂犬病的特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由狂犬病毒引起的狂犬病。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程抗体技术，特别是涉及人源抗狂犬病毒糖蛋 白中和性抗体RV3A5及其应用。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒引起的世界性人兽共患病，一旦发病100％ 死亡。目前世界上87个国家有狂犬病报道,每年约有5万多人死于 狂犬病(KnobelDL,etal.2005)。狂犬病暴露后预防是防治狂犬病 的主要措施。对于严重暴露的人，世界卫生组织(WorldHealth Organization,WHO)建议采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋 白(rabiesimmuneglobulin，RIG)的方法。目前使用的两类RIG为人 抗狂犬病毒免疫球蛋白(humanrabiesimmuneglobulin，HRIG)和马 抗狂犬病毒免疫球蛋白(Equinerabiesimmuneglobulin，ERIG)。由 于ERIG副反应比较严重，而且对某些疫苗的抗体反应有抑制，而 HRIG价格昂贵，供应量有限并且有潜在的病原威胁。因此制备高效、 价廉、副反应小的被动免疫制剂成为新的研发目标。

含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白用以预防和治疗 传染病已历史悠久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护肌 体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、 麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100 ％保护动物免受病毒攻击。以抗原免疫动物获得多抗血清的途径一直 是获得抗体的经典方法，但缺乏特异性和均一性。继而建立的B淋巴 细胞杂交瘤技术使得众多科学家通过细胞工程可以在体外定向地制 备各种单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)，其特异性强，性 质均一，易于大量生产。然而McAb多为鼠源性，鼠源McAb的异源 性反应极大地限制了McAb作为治疗制剂在人体的应用。免疫球蛋白 (Vacciniaimmuneglobulin,VIG)作为抗体成分主要来自捐献者(恢 复期病人)免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测均需花费大 量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于来源于血清 因此容易发生血源性传播疾病的感染。因此使用人源基因工程产品替 代血制品则可克服这些缺陷，随着人源基因工程抗体研究的不断深 入，给这一领域的生物制品发展带来了新的希望和广阔前景。通过抗 体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源及人源抗体，使 对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及 实际运用前景。人源抗狂犬病毒单克隆抗体的研制和噬菌体抗体库技 术的产生为解决被动免疫制剂问题提供了新的思路。狂犬单克隆抗体 CR57和CR4098制成的单克隆抗体鸡尾酒中和了26种典型的街毒 株。对动物的保护性实验表明，利用单克隆抗体鸡尾酒进行治疗具有 可行性和优越性(GoudsmitJ,etal.2006)。

上世纪80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体库技术兴起和整个 基因工程抗体技术研究领域的发展，使当今世界人源或基因工程抗体 的开发研究取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究 和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成 功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗带来了新的希望，在抗 病毒感染生物药领域逐渐形成了一类新的抗病毒药，即所谓的抗体药 (AntibodyDrug)。如同当初血源性疫苗向基因工程疫苗的转变，现 在也急需用基因工程抗体替代血源性VIG，如通过嵌合抗体技术 (Boulianne,G.L.etal.,1984；Morrison,S.L.etal.,1984)、人源化抗体 技术(Jones,P.T.etal.,1986)、携带人单抗的转基因小鼠技术 (Green,L.L.etal.,1994)、异体杂交瘤技术(James,K.etal.,1987)、噬菌 体表面展示技术(Barbas,C.F.etal.,1991)等产生人源化抗体，已成为 国内外研究的重大方向，并逐步走向成功。

发明内容

本发明的目的是提供人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗体RV3A5 或其活性片段。

本发明的另一目的是提供编码上述中和性抗体RV3A5或其活性 片段的基因。

本发明的再一目的是提供上述中和性抗体RV3A5及其活性片段 在制备预防或治疗狂犬病药物或诊断试剂中的应用。

本发明运用噬菌体抗体库技术，采集多个具有高滴度狂犬病毒抗 体的疫苗接种者外周血淋巴细胞，通过基因工程手段构建了人源抗狂 犬病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异抗狂犬病毒基因工程抗体 Fab段。获得的Fab段抗体命名为RV3A5。

这株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变 区(CDRs)特异性基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达 的特异性结合狂犬病毒的功能性抗体。它们特异性识别狂犬病毒颗粒 抗原，且均针对狂犬病毒糖蛋白G，与狂犬病毒具有明显的免疫荧光 反应(IFA)和酶联免疫(ELISA)反应，具有抗狂犬病毒感染的中 和活性功能。

RV3A5特异性的轻链可变区基因来源于对人源抗狂犬病毒抗体 基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于以狂犬单克隆抗体 CR4098为骨架，从狂犬病疫苗接种者外周血淋巴细胞通过RT-PCR 扩增抗体轻链可变区基因，替换单抗CR4098的轻链基因，构建轻链 置换文库。RV3A5特异性的重链可变区基因与CR4098相同。其轻链 和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间的框架区 序列组成了每个抗体可变区序列特征，RV3A5隶属于抗体轻链家族 VL6。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互 补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补所决定， 6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域， 决定了每个抗体的抗原结合特征和抗狂犬病毒功能特征。决定每株中 和抗体功能的抗体轻链和重链可变区氨基酸序列如表1所示：

表1

中和性抗体RV3A5轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo:1所 示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。

编码中和性抗体RV3A5轻链可变区的基因序列如SEQIDNo:3 所示，重链可变区的基因序列如SEQIDNo:4所示。

应当理解，在不影响scFv抗体活性的前提下，本领域技术人员 可对SEQIDNo:1-2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失 一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列，例如在非高变区 将具有类似性质的氨基酸进行替换，如将RV3A5的轻链VL序列的 第6位的Val替换为Ala。

本发明还提供含有编码所述中和性抗体RV3A5轻链可变区和重 链可变区基因的表达载体。

本发明还提供含有编码所述中和性抗体RV3A5轻链可变区和重 链可变区基因的工程菌及转基因细胞系。

本发明还提供所述中和性抗体RV3A5在制备预防或治疗狂犬病 的药物或诊断试剂中的应用。

本发明进一步提供含有所述中和性抗体RV3A5的药物或诊断试 剂。

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨 基酸序列的条件下，对编码上述scFv段抗体的基因序列进行修改， 获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的 密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

进一步，本发明将上述scFv抗体的轻链可变区和重链可变区进 行重组，获得其它分子形式如Fab抗体，该抗体同样能够特异性识别 狂犬病毒表面抗原，具有细胞内免疫的作用。单链抗体穿透力强，易 于进入局部组织发挥作用。

可将上述编码Fab抗体的基因、scFv基因克隆到表达载体中，进 而转化宿主，通过诱导表达获得Fab抗体以及单链抗体。

此外，可将上述scFv抗体的轻重链编码基因隆到全抗表达载体 中，并导入宿主细胞中，获得表达抗狂犬病毒的全抗免疫球蛋白。

在本发明的实施例中，将上述scFv抗体RV3A5的轻链和重链基 因分别克隆入VH/VK全抗体表达载体，采用转染试剂聚乙烯亚胺 (PEI)瞬时转染293T细胞，利用哺乳动物细胞系统实现了全抗体的 分泌型表达，得到全抗体免疫球蛋白IgG(即人源IgG全抗体 RV3A5)。

利用ELISA、IFA、SDS-PAGE对获得的全抗体进行功能鉴定， 结果表明人源IgG全抗体RV3A5针对aG株和CTN株狂犬病毒颗 粒均有特异性结合，与利用杆状病毒/昆虫细胞系统表达的狂犬病毒 aG株糖蛋白有特异性结合。采用快速免疫荧光灶抑制实验检测抗体 在体外与国际标准攻击毒株CVS株和国内疫苗株aG株的中和反应， 结果显示，CR4098置换抗体RV3A5对狂犬病毒aG株和CVS株均 具有较高的中和效价分别为834IU/ml和779IU/ml，与单抗CR4098 的中和活性相近。

本发明运用噬菌体抗体库技术，成功地获得了特异性针对狂犬病 毒糖蛋白的人源中和性抗体；利用上述获得的人源中和性抗狂犬病毒 糖蛋白基因工程抗体可变区基因、Fab抗体基因以及上述每个抗体基 因特征下的全抗体基因，可实现在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及 任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此 抗体基因的任何其他基因，获得具有中和狂犬病毒感染的抗体产物， 制成临床上用于预防和治疗狂犬病的特异性抗体药物。

附图说明

图1为本发明实施例1中人源抗狂犬病毒糖蛋白IgG抗体的特异 性表达的ELISA检测结果。

图2为本发明实施例1中纯化后IgG的SDS-PAGE电泳检测结 果。

图3为本发明实施例1中人源IgG抗体与sf9细胞表达狂犬病毒 糖蛋白蛋白免疫荧光分析结果。

图4为本发明实施例1中各抗体的竞争ELISA实验结果。

图5为本发明实施例1中非竞争ELISA测定抗体亲和力的实验 结果。

图6为本发明实施例1中抗狂犬病毒基因工程抗体中和活性测定 结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验 手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

材料和方法

1、病毒、细胞、载体：狂犬病毒aG株、CVS株由中国疾病预 防控制中心病毒病预防控制所提供。293T细胞和昆虫细胞Sf9来自 美国细胞培养中心(ATCC)。噬菌体抗体库建库载体pHAL14(Hust M,ToleikisL,DubelS.Antibodyphagedisplay.Handbookoftherapeutic antibodies.Weinheim:Wiley-VCH,2007:45-68.)由德国布伦瑞克工业 大学StefanDübel教授提供。全抗体表达载体VH/VK(HustM,Toleikis L,DubelS.Antibodyphagedisplay.Handbookoftherapeuticantibodies. Weinheim:Wiley-VCH,2007:45-68.)由德国布伦瑞克工业大学Stefan Dübel教授提供。狂犬病毒人免疫用毒株PM为法国赛诺菲巴斯德公 司生产的维尔博牌进口人用疫苗株，用于狂犬病毒体外中和实验的培 养细胞为BHK-21。RNA提取试剂盒、RT-PCR盒、PCR试剂盒均购 自Roche公司。胰酶、聚乙二醇(PEG)、转染试剂聚乙烯亚胺(PEI) 购自美国Sigma公司。

2、pHAL14-VH_CR4098克隆的构建：首先将单抗CR4098重链基 因VH克隆入pHAL14载体中作为轻链置换库建库的载体。载体 pHAL14和CR4098重链PCR产物分别用NcoI和HindIII进行双酶切， 37℃酶切2h后，酶切产物直接纯化回收，经T4DNA连接酶连接， 转化XLI-BlueMRF感受态细胞，挑取阳性细胞克隆pHAL4-VH_CR4098测定鉴定。

3、轻链置换抗体库的构建：从狂犬病毒疫苗注射者的抗凝血液 中分离淋巴细胞，提取总细胞RNA，逆转录成cDNA，用一组扩增 人源抗体IgG1重链Fv及轻链Kappa和Lambda可变区的引物，进行 PCR扩增。PCR条件为:94℃1min，55℃1min，72℃10min，30 个循环。以构建的pHAL4-VH_CR4098为建库载体，通过MluI和NotI 双酶切后，将轻链多样性基因VL_Pool经T4DNA连接酶与pHAL4-VH _CR4098连接，电转XLI-BlueMRF感受态，构建轻链置换库，详细建库 方法和引物序列参考文献(HustM,ToleikisL,DubelS.Antibody phagedisplay.Handbookoftherapeuticantibodies.Weinheim: Wiley-VCH,2007:45-68，以及PelatT,HustM,LafflyE,etal.Ahigh affinity,humanlikeantibodyfragment(scFv)neutralisinglethalfactor (LF)ofBacillusanthracisbyinhibitingthePA-LFcomplexformation. AntimicroAgentsChem,2007,51:2758-2764)。

4、重链置换抗体库的构建：以上述CR4098轻链置换库筛选获 得阳性克隆为骨架，固定轻链可变区基因VL_X，将VH_CR4098替换掉。 首先将获得的轻链基因克隆入pHAL14载体中，通过MluI和NotI双 酶切构建pHAL14-VL_X克隆作为重链置换库的载体，以狂犬疫苗注射 者获得cDNA为模板进行重链基因扩增，通过NcoI和HindIII双酶切 后，经T4DNA连接酶连接，电转XLI-BlueMRF感受态，构建重链 置换库。

5、噬菌体抗体库的富集筛选及scFv单链抗体的诱导表达：用 0.1mol/LNaHCO₃(pH8.6)溶液将狂犬病毒4℃包被过夜，用MPBST (PBS加入1％脱脂奶和0.05％Tween-20)封闭包被孔室温孵育2h， 之后用PBST洗涤3遍。向其中加入10¹¹噬菌体抗体库，室温孵育 2h。移去上清，加100μl10μg/ml的胰酶洗脱。洗脱下来的噬菌体感 染新鲜的XLI-Blue菌液(OD₆₀₀＝0.5)，经辅助噬菌体包装后进行下 一轮筛选，如此反复3次后，随机挑选单克隆经IPTG诱导表达ScFv。 具体富集方法及ScFv抗体的诱导表达参考PelatT,HustM,LafflyE, etal.Ahighaffinity,humanlikeantibodyfragment(scFv)neutralising lethalfactor(LF)ofBacillusanthracisbyinhibitingthePA-LFcomplex formation.AntimicroAgentsChem,2007,51:2758-2764。

6、scFv抗体的ELISA检测：向包被有狂犬病毒颗粒的酶标板中 加入诱导表达的单链抗体，37℃孵育1h；加入抗-myc鼠源IgG抗体， 37℃孵育1h；加入抗鼠酶标IgG全抗，37℃孵育1h，显色液显色， 2MH₂SO₄终止反应，酶标仪检测吸光度A₄₅₀值，判定抗狂犬病毒 scFv阳性克隆。

7、基因序列分析：利用scFv测序引物对阳性克隆分别进行了抗 体轻重链的序列测定，测定工作由北京擎科生物技术有限公司完成， 获得的重组scFv抗体核苷酸序列用DNASTAR序列分析软件进行 分析处理，获得由此推导的氨基酸序列分析。比较InternetV-Base基 因库中的IgG家族序列，确定抗体轻重链型别。

8、IgG抗体表达纯化：scFv抗体阳性克隆经测序后参照V-Base 数据库比对分析，将获得的ScFv抗体轻重链基因分别克隆入VH/VK 全抗体表达载体，采用转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)瞬时转染293T细 胞，37℃5％CO₂条件下培养培养48h后收集上清，Protein-A亲和 层析柱纯化IgG表达上清。

9、IgG抗体的ELISA检测：收集IgG表达上清，进行抗人Fab 和抗狂犬病毒颗粒的ELISA检测。用0.1mol/LNaHCO₃(pH9.6)的 溶液分别包被抗人Fab抗体(美国Sigma,1﹕2000稀释使用)及狂犬 病毒颗粒(RV)于酶标板，4℃过夜；4％脱脂奶封闭，37℃1h，加 入IgG表达上清，37℃1h；加入酶标抗人Fc二抗(美国Sigma,1﹕ 2000稀释使用)，37℃1h；显色液显色，2MH₂SO₄终止反应，酶 标仪检测吸光度值。

10、间接免疫荧光(IFA)检测：利用pAc-UW51载体(BD Pharmingen，美国)转染昆虫细胞制备重组杆状病毒进行狂犬病毒aG 株糖蛋白表达，制备表达狂犬病毒糖蛋白抗原片段，加入IgG抗体， 37℃温育30min，冲洗，加入FITC标记的抗人IgG抗体(美国 Sigma)，37℃孵育30min，冲洗，晾干，荧光显微镜下观察。

11、竞争ELISA：采用狂犬病毒aG株病毒作为包被抗原，以针 对狂犬病毒糖蛋白III号表位的抗体CR4098进行辣根过氧化物酶标 记作为检测抗体，滴定酶标抗体CR4098-HRP的使用稀释度为1:200。 竞争抗体为纯化全抗体RV3A5，对照竞争抗体包括CR4098，针对Ⅰ 号表位的CR57及人源抗干扰素单抗IFN-IgG。将96孔板加入100μl 5％脱脂奶-PBS溶液，取各竞争抗体100μl，分别加入到100μl5％脱 脂奶-PBS中，按1:1体积比混合稀释，随后每孔取出100μl混合液加 入到下一孔进行倍比稀释，之后加入1:200稀释的CR4098-HRP37℃ 孵育1h，洗板，显色液显色，2MH₂SO₄终止反应，酶标仪检测吸光 度A₄₅₀值。

12、非竞争ELISA法亲和力测定：用0.1MNaHCO₃(pH9.6)溶 液分别包被纯化的狂犬病毒aG株颗粒，浓度依次为5μg/mL、 2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL,5％脱脂奶封闭后，用5％脱脂奶 从1.8mg/L进行2倍稀释纯化IgG抗体100μL，如下稀释度1.8mg/L、 0.9mg/L、0.45mg/L、0.225mg/L等以此类推，37℃孵育1h后，加入 酶标抗人Fc抗体，37℃温育1h，显色后酶标仪检测吸光度A₄₅₀值。

结果判定：代入公式K＝(n-1)/2(nAb＇-Ab)计算亲和常数，式 中Ab和Ab＇分别表示当抗原浓度为Ag和Ag＇时，产生半数吸光 值的抗体浓度(mol/L)，n＝Ag＇/Ag，K值的均数即为抗体亲和力。

13、人源抗狂犬病毒抗体快速免疫荧光灶抑制实验(RFFIT)： 取不同稀释度的待测抗体及抗体标准品各50μL于96孔培养板中， 每孔加入50μL3×10⁶pfu/mL中和用病毒CVS株或aG株，同时设空 白孔对照和中和用病毒对照孔，混匀后置37℃中，1h，每孔加入1×10⁶/mLBHK-21细胞悬液50μL，置37℃5％CO₂孵箱中培养24h。待培 养结束吸干培养液，PBS清洗并吸干后，每孔加入预冷至4℃的80 ％丙酮50μL，-30℃固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后加入工作 浓度的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体，50μL/孔，37℃孵育30 分钟，甩掉液体，用PBS洗板2～3次，甩干液体，每孔加入80％甘 油50μL，荧光显微镜观察。实验组中能使荧光灶抑制≥50％的抗体最 高稀释倍数，即为被检抗体的中和抗体滴度。根据Reed&Muench 公式，计算各抗体样品及标准品的ED₅₀值，从而得出各待测抗体的 效价。

14、非高变区突变后的抗体对狂犬病毒抗性的研究

基于RV3A5轻链可变区氨基酸序列，将SEQIDNo.1所示氨基 酸序列的第6位的Val替换为Ala，将RV3A5重链可变区(SEQID No.2)的第2位的Ala替换为Gly。分别合成RV3A5的重链编码核 酸序列(在相应位置将密码子gtg替换为gcc)以及轻链编码核酸序 列(在相应位置将密码子gcc替换为ggg)。按照上述8～11的方法， 将轻链和重链基因分别克隆入VH/VK全抗体表达载体，瞬时转染 293T细胞，利用哺乳动物细胞系统实现了全抗体的分泌型表达，并 对该突变体进行免疫学检测。

结果

1、抗狂犬病毒糖蛋白III号表位轻链置换抗体库筛选

将轻链PCR产物和载体pHAL4-VH_CR4098酶切后连接，连接产物 经乙醇沉淀后，电转化构建轻链置换库，经高效噬菌体包装，用狂犬 病毒aG株进行富集筛选，3轮富集后随机挑取600个克隆，用狂犬 病毒颗粒aG株抗原ELISA检测scFv诱导表达上清，结果显示在三 轮富集过程中噬菌体抗体库呈现较强的富集趋势，尤其是第三轮富 集，洗脱库容有2个数量级的提升。ELISA检测显示在600个筛选克 隆中，34个克隆的ScFv诱导表达产物与狂犬病毒颗粒aG株具有结 合活性。三轮富集筛选分别产出量见表2。

表2人源抗狂犬病毒噬菌体抗体库的富集筛选

2、人源抗狂犬病毒ScFv抗体的序列分析

34株阳性克隆经序列测定，抗体重链和轻链基因与Internet V-Base基因库中的IgG序列比较，发现存在14株序列差异的抗体， 其中2株属于VK，1株属于VL1家族，1株属于VL3家族，8株属 于VL6家族，其轻链可变区CDR的氨基酸序列见表3。

表3置换法筛选抗狂犬病毒scFv抗体轻链CDR氨基酸序列

3、CR4098抗体重链置换筛选

将上述筛选的轻链基因克插入pHAL14载体中，各阳性克隆等量 混合作为CR4098抗体重链置换库的载体pHAL14-VL_X，将重链PCR 产物和载体pHAL14-VL_X进行NocI和HindIII双酶切，回收酶切片段 相连接。连接产物经乙醇沉淀后，电转化感受态，经高效噬菌体包装， 用狂犬病毒aG株进行富集筛选，富集筛选中未发现洗脱库容递增趋 势，在第三轮富集后随机挑取600个克隆，IPTG诱导表达后采用狂 犬病毒颗粒进行ELISA检测，结果显示在狂犬病毒病毒颗粒结合活 性的ELISA检测未获阳性克隆，提示CR4098抗体重链在抗体功能中 发挥主要作用，一旦被替换，抗体结合活性丢失，因此保留CR4098 重链序列不变，对筛选到的轻链置换抗体进行评价。

4、人源抗狂犬病毒糖蛋白IgG抗体表达及ELISA检测

狂犬病毒糖蛋白III号表位置换库筛选的阳性克隆采用双质粒系 统VH/VK瞬时转染293T细胞，收集表达上清，进行抗人Fab和抗 狂犬病毒颗粒的ELISA检测，结果如图1所示，与CR4098相比， RV1C8和RV4B8(对应于表3中1C8和4B8)具有较高的抗人Fab 滴度，表明抗体表达水平较高，但狂犬病毒检测滴度远低于CR4098， 说明抗体与狂犬病毒糖蛋白结合活性低。RV3A5(对应于表3中3A5) 抗人Fab滴度虽低于CR4098，但抗病毒活性与之相近，说明在相近 的抗体表达水平上，RV3A5具有良好的抗狂犬病毒糖蛋白结合活性。

根据上述实验结果，选择抗病毒结合活性较高的RV3A5进一步 研究，RV4B8作为后备参考株。利用ProteinA亲和层析柱对RV3A5、 RV4B8及对照CR4098进行亲和层析纯化，将纯化的Ig抗体进行 SDS-PAGE电泳检测，结果证实均得到纯化的IgG蛋白，在约28KD、 55KD处可清晰条带(图2)。

5、人源抗狂犬病毒IgG抗体的结合特异性(IFA)

为了证实所获得的IgG抗体对狂犬病毒结合的特异性，进一步通 过间接免疫荧光试验鉴定抗体的功能，如图3所示，置换库筛选抗体 RV3A5、RV4B8株单克隆抗体与狂犬病毒aG株糖蛋白免疫荧光均为 阳性。

6、竞争ELISA分析抗体作用的抗原表位

采用狂犬病毒aG株病毒作为包被抗原，以针对狂犬病毒糖蛋白 III号表位的抗体CR4098进行辣根过氧化物酶标记作为检测抗体，检 测与RV35A之间是否存在相互竞争。对照竞争抗体包括CR4098， 针对Ⅰ号表位的CR57及人源抗干扰素单抗IFN-IgG。结果如图4所 示，针对狂犬病毒糖蛋白I号表位单克隆抗体CR57及人源抗干扰素 单抗IFN-IgG与CR4098不存在相互竞争，而本研究中筛选的针对 CR4098轻链置换的人源单抗RV3A5与CR4098存在明显的竞争，说 明这两株单抗可能针对的相同表位。

7、抗体亲和力测定

采用非竞争ELISA法测定CR4098抗体的亲和力为2.8×10^-9M， 而RV3A5亲和力为2.1×10-⁹M，略高于CR4098。RV4B8亲和力较 低，约为4.1×10^-8，难以满足实际应用，CR4098和RV3A5亲和力 测定结果见图5。

8、人源抗狂犬病毒抗体中和试验

为进一步研究比较狂犬病毒糖蛋白III号表位置换抗体RV3A5 的中和活性，采用快速免疫荧光灶抑制实验来检测抗体在体外与国际 标准攻击毒株CVS株和国内疫苗株aG株的中和反应，结果如图6 所示，CR4098置换抗体RV3A5对狂犬病毒aG株和CVS株均具有 较高的中和效价分别为834IU/ml，779IU/ml，与CR4098中和活性 相近。RV4B8由于与狂犬病毒糖蛋白结合活性偏低导致中和活性效 价较低，约200IU/ml。根据国家药品检定机构规定抗狂犬病血清效 价大于200IU/mL即表示该产品为合格产品，因此本发明所获得的针 对狂犬病毒糖蛋白III号表位置换抗体RV3A5具有与单抗CR4098相 当的中和活性。

9、非高变区突变后的抗体对狂犬病毒抗性的影响

按照材料与方法中14(非高变区突变后的抗体对狂犬病毒抗性 的研究)的方法，将基于RV3A5改变后的轻链基因和重链基因克隆 到VH/VK全抗体表达载体，瞬时转染293T细胞，利用哺乳动物细 胞系统实现了全抗体的分泌型表达，得到突变体RV3A5’。对该突变 体进行免疫学检测，间接免疫荧光实验表明RV3A5’能特异性针对狂 犬病毒糖蛋白G，采用快速免疫荧光灶抑制实验来检测抗体在体外与 国际标准攻击毒株CVS株的中和反应，结果显示其性质与RV3A5基 本相同。

讨论

本发明运用ScFv噬菌体抗体库技术，从具高滴度抗狂犬病毒抗体 的疫苗接种者外周血分离淋巴细胞，结合高效噬菌体包装系统，构建 了针对狂犬病毒糖蛋白III号表位中和抗体CR4098的置换库，并选择 纯化狂犬病毒颗粒aG株对抗体库进行富集筛选。最终获得了针对糖蛋 白III号表位的高亲和力人源中和抗体RV3A5，该抗体轻链彻底替换为 全新轻链基因，由原来CR4098的VK1家族替换成VL6家族，值得重视 的是本发明中重链基因没有替换成功，提示CR4098抗体重链在抗体 功能中发挥主要作用，一旦被替换，抗体结合活性丢失。同一抗体重 链和不同的轻链基因可以组合成具有特异性结合活性的功能抗体，说 明抗体重链在保持抗体结构和功能中发挥关键作用。

本发明的体外中和试验中，III号表位置换抗体RV3A5对狂犬病毒 CVS株和aG株均具有较高的中和效价分别为779IU/ml、834IU/ml，与 CR4098中和活性相近，RV4B8由于与狂犬病毒糖蛋白结合活性偏低 导致中和活性效价较低。抗体中和效应的实现依赖于多方面机制共同 作用，上述抗体针对狂犬病毒所展现出中和效率的差异可能与其所针 对的抗原表位的独特性及抗体自身针对抗原的亲和力密切相关。由于 狂犬病毒基因型别较多，糖蛋白的序列并不十分保守，使用针对单一 中和抗原位点的单克隆抗体不能起到广谱安全的疗效。将针对不同中 和抗原位点的单克隆抗体联合起来制成单克隆抗体鸡尾酒，成为取代 RIG作为狂犬病暴露后预防的被动免疫制剂的最佳选择。研究报道由 抗狂犬病毒糖蛋白抗体CR57和CR4098构成的单克隆抗体鸡尾酒 CL184在美国和印度完成了I期临床，该临床结果表明CL184安全有 效，可取代RIG，用于暴露后预防。发明人曾通过Fab噬菌体抗体库 成功地获得11株抗狂犬病毒糖蛋白的人源Fab抗体，结合本发明成功 改造的针对糖蛋白III号表位的新型中和抗体RV3A5，均可以作为候选 抗体，为我国具有自主知识产权的狂犬单克隆抗体鸡尾酒配伍制剂的 研发打下基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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