人博卡病毒LAMP检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于扩增人博卡病毒基因序列的引物组和包含所述引物组的用于快速检测人博卡病毒的试剂盒。本发明的引物组包含SEQ？NO？ID：2-7所示的序列的组合。本发明还公开了利用本发明的引物组检测人博卡病毒的方法。本发明的试剂盒和/或检测方法可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到人博卡病毒。本发明的试剂盒和/或检测方法不需要复杂仪器，可用于儿童感染性疾病筛查和检测人博卡病毒。

说明书

技术领域

本发明属于病毒的分子生物学检测领域，具体地涉及用于检测人 博卡病毒的引物组、包含所述引物组的检测试剂盒和相应的检测方法。 更具体地，本发明涉及用于通过环介导等温扩增技术(LAMP)检测人博 卡病毒的专用引物组、包含该专用引物组的检测试剂盒和相应检测方 法。

背景技术

人博卡病毒(Humanbocavirus,HBoV)是2005年瑞典科学家 Allander等在急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物中发现的一种新病毒，属 细小病毒科(Parvoridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)博卡病毒属 (Bocavirus)。细小病毒科包括细小病毒亚科和浓核症病毒亚科。细小 病毒亚科为脊椎动物病毒，浓核症病毒亚科为昆虫病毒。除B19细小 病毒和人细小病毒4(Humanparvovirus，PARV4)外，人博卡病毒是 被发现的与人类疾病相关的又一细小病毒，外观呈球形，直径18-26nm， 二十面体立体对称结构，无包膜，为体积最小、结构最简单的DNA病 毒。基因组呈单链线状，全长约5.3kb，包括三个开放性读码框架(ORF)， 分别为非结构蛋白编码基因NS1、NP1和结构蛋白编码基因VP1/VP2。

近年来，借助于分子生物学技术的快速发展，尤其是生物信息学 的加盟，感染性疾病的病原诊断技术日益完善。在发达国家，病毒病 原诊断很大程度上利用了分子生物学和生物信息学的技术和方法。病 毒性疾病病原诊断的原则包括：(1)检测到病毒(包括病毒的分离、 病毒特异性基因和/或抗原的检测)；(2)检测到特异抗体的升高。对于 新发的病毒感染性疾病(如SARS、EV71、2009甲型H1N1、新型布 尼亚病毒等)的认定，需二者兼有。而在面对突发的公共卫生事件(如 群体发热、群发的肺炎、暴发流行的腹泻等)时，需要敏感、特异、 快速、简便的病原诊断方法，在最短的时间内确定病原，以利于疾病 防控部门和政府有关部门根据不同病原的传播特点快速采取恰当的措 施。因此目前已有的病毒检测方法，如病毒分离尽管是最可靠的方法， 但是耗时长，需要2-3周，且条件要求苛刻，不符合“快速”的要求；目 前批准上市的免疫荧光法检测呼吸道病毒病原，需要荧光显微镜等专 门设备，对人员要求较高，且操作复杂；而胶体金等快速抗原检测方 法虽可在短时间内出具报告，但又存在灵敏度低、易于漏诊的问题； 抗体一般在感染7-10天后才会出现，不能进行“早期”诊断。目前国外 已将病毒核酸(基因)检测作为早期、快速诊断的可靠的常用的手段， 尤其是实时荧光定量PCR，灵敏度高，不宜污染，但这一技术需要专 门的仪器，对人员要求也较高，不适合在基层医院推广。

目前用于人博卡病毒诊断的实验室方法主要是核酸检测，如聚合 酶链反应(PCR)、实时荧光PCR等；也有部分实验室建立了免疫酶联 反应，但因不同基因型别间的免疫交叉反应，该方法目前未能大量应 用。虽然基于PCR技术的检测方法已建立，但PCR需要昂贵的仪器， 而且操作繁琐。另外，现有的检测方法无论从特异性还是从检测时限 方面均不能实现在特定单一标本(例如，仅血样、或仅排泄物)中快速诊 断，这使得现有检测方法对样品的要求和依赖性很高，无法起到对临 床极早期或早期有效治疗人博卡病毒感染的指导作用并进一步限制了 它们在临床上的大规模应用。

为此，急需建立一种灵敏、准确、快速、简便、特异性强且对样 品要求不高的人博卡疫病毒实验室诊断方法。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述问题，本发明采用了环介导等温扩 增技术(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)来实现上述 目的。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种用于扩增人博卡病毒基 因序列的引物组(在本文中有时简称为“本发明的引物组”)，其包含 SEQNOID：2-7所示的序列的组合。

在一个优选的实施方案中，本发明的引物组可以是SEQNOID： 2-7所示的序列的组合，即，6条引物序列的组合。

在另一个优选的实施方案中，本发明的引物组可以是基于人博卡 病毒NP1基因序列设计的。优选地，所述人博卡病毒NP1基因序列是 SEQNOID：1所示的核酸序列。

在第二个方面，本发明提供了一种用于检测人博卡病毒的试剂盒 (在本文中有时简称为“本发明的试剂盒”)，所述试剂盒包含本发明的 引物组。

在一个优选的实施方案中，本发明的试剂盒可以是专用于LAMP 技术的试剂盒，因此其还可以包含用于LAMP的反应发生混合物、Bst DNA聚合酶以及其他对于LAMP检测所必要的检测试剂。

在第三个方面，提供了本发明的引物组在制备用于检测人博卡病 毒的试剂盒中的用途，即，可以将本发明的引物组开发成检测人博卡 病毒的试剂盒。优选地，如上所述，所述检测人博卡病毒的试剂盒可 以是专用于LAMP技术的试剂盒。

在第四个方面，本发明提供检测人博卡病毒的方法(在本文中有时 简称为“本发明的检测方法”)，该方法包括以下步骤：

1)提供获自受试者的待测样品，并提取待测样品的DNA；

2)以所述待测样品的DNA为模板，利用具有SEQNOID：2-7所 示的序列的引物进行扩增反应；以及

3)在步骤2)的扩增反应的开始前和结束后分别检测反应液的浊 度，和

4)通过反应前后反应液的浊度变化来判断结果。

在本发明中，所述受试者可以是人。

在一个特别优选的实施方案中，在本发明的检测方法中，步骤2) 中的扩增反应利用LAMP技术进行。

本发明的有益效果：

1)高特异性：6条引物对人博卡病毒NP1基因靶序列的8个特异区 域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性(参见下面的讨论)，即LAMP 能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；

2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR高10倍；

3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(透明为阴性，混浊为阳性)， 也可以直接用浊度仪判断结果；

4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起反应90分钟 后就可以判断结果；

5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一个半小时内即可完成， 且产率可达到0.5mg/mL。

附图说明

图1为在本发明的检测方法中对人博卡病毒基因的LAMP扩增方 法的示意图，图中显示了LAMP扩增区域、各条引物的位置和扩增方 向；

图2图示了采用6个引物组合对临床标本中人博卡病毒LAMP扩 增的曲线图。其中legend一列中不同孔(CH1-8)的扩增曲线以不同 颜色表示；√：各孔中对应加入的标本编号，1号孔(Q89)、4号孔(Q109) 为人博卡病毒检测阴性(几乎与0坐标重合)；余为人博卡病毒检测阳 性。

图3为关于本发明的人博卡病毒LAMP检测方法的特异性的浊度 仪检测结果截图。其中legend一列不同孔(CH1-8)的扩增曲线按下 列顺序以不同颜色表示；√：各孔中对应加入的不同病毒阳性的核酸 LAMP扩增结果(RSVA/B，A/B亚型呼吸道合胞病毒；FLUA/B，A 或B型流感病毒；HAdV1、3、7，1、3、7型腺病毒；HBoV3722NP1， 人博卡病毒阳性质粒DNA)(注：图中CH1-7孔的对应曲线几乎与0 坐标重合)。

图4为关于本发明人博卡病毒LAMP检测方法的灵敏度的浊度仪 检测结果截图。其中legend一列不同孔(CH1-8)的扩增曲线以不同 颜色表示；√：各孔中对应加入不同稀释度的人博卡病毒阳性质粒 HBoV3722NP1DNALAMP扩增结果(HBoV13-6，10^-6；HBoV13-7， 10^-7；HBoV13-8，10^-8；HBoV13-9，10^-9；HBoV13-10，10^-10；HBoV13-11， 10^-11；HBoV13-12，10^-12；nc，阴性对照)(注：图中CH5-8孔的对应 曲线重合)。

具体实施方式

LAMP是由T.Notomi(NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal. Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes2000； 28(12):63)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖6条特异设计的 引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、 快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病 原体检测。MasakiImai等人(ImaiM，NinomiyaA，MinekawaH，et al.RapiddiagnosisofH5N1avianinfluenzavirusinfectionbynewly developedinfluenzaH5hemagglutiningene-specificloop-mediated isothermalamplificationmethod.JVirolMethods.2007；141(2):173-80.)利 用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；NobuyukiHayashi等 人(HayashiN,AraiR,TadaS,TaguchiH,OgawaY.Detectionand identificationofBrettanomyces/Dekkerasp.yeastswithaloop-mediated isothermalamplificationmethod.FoodMicrobiol.2007；24(7-8):778-85.)针 对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的 LAMP检测体系。

然而，现有技术中尚没有利用LAMP技术来检测人博卡病毒的报 道，更没有给出关于如何设计引物对或引物组对人博卡病毒基因进行 扩增从而建立一种灵敏、准确、快速、简便、特异性强且对样品要求 不高的人博卡病毒实验室诊断方法的任何启示。

本发明的引物组合

为了实现本发明的目的，发明人基于以下的原则设计了用于 LAMP扩增人博卡病毒基因的引物：

1)特异性高；

2)GC含量高(超过60％)；和

3)无交叉反应性。

按照上述原则，发明人对人博卡病毒NP1基因序列(SEQNOID： 1)通过使用BLAST软件进行同源性分析，获得人博卡病毒NP1的特异 性保守靶序列，再根据该保守靶DNA序列，用软件PrimerdesignV4 设计用于对人博卡病毒进行LAMP检测的引物，设计出3套引物 (HBoV13-1,HBoV13-2,HBoV13-3)。这3套引物均识别人博卡病毒 NP1基因靶序列的8个特异区域(参见图1)，这样就保证了LAMP扩增 的高度特异，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应 的靶序列进行扩增。通过筛选和对比，最终确定HBoV13-1(SEQNOID： 2-7所示的序列)为实现本发明的目的的优选引物组合。

本发明的试剂盒

根据本发明，还提供了一种用于检测人博卡病毒的试剂盒，所述 试剂盒包含本发明的引物组(SEQNOID：2-7所示的序列的组合)。

在一个优选的实施方案中，除了本发明的引物组以外，本发明的 试剂盒还可以包含用于LAMP的反应发生混合物(例如，包含dNTP、 含Mg++的缓冲液等)、BstDNA聚合酶以及LAMP检测所需要的其他 检测试剂，例如双蒸水、阳性对照(例如HBoV3722NP1质粒DNA)、 和任选地，包含使用说明书等。

本发明的试剂盒不仅具有特异性高的优点，而且具备对检测样品 要求不高的特点，大大缩短了整体检测和诊断时间，提高了诊断效率。

本发明的检测方法

本发明进一步提供了检测人博卡病毒的方法，该方法包括以下步 骤：

1)提供获自受试者的待测样品，并提取待测样品的DNA；

2)以所述待测样品的DNA为模板，利用具有SEQNOID：2-7所 示的序列的引物进行扩增反应；

3)在步骤2)的扩增反应的开始前和结束后分别检测反应液的浊 度，和

4)通过反应前后反应液的浊度变化来判断结果。

根据本发明，待测样品可以来自受试者的体液(例如，血液、脑脊 液、泪液、胃液、肠液、淋巴液、腹水、胸腔积液、唾液、痰液等)、 排泄物(例如，粪便、尿液)、器官和组织(例如，头发、指甲、粘膜、 上皮组织、结缔组织、表皮、真皮等)标本、拭子标本(例如，口腔拭子、 咽拭子、鼻拭子)。

在本发明的检测方法中，提取待测样品的DNA的方法不受限制， 可以采用本领域中公知的任何DNA提取技术或方法。

在本发明的检测方法中，SEQNOID：4可以作为内引物FIP，SEQ NOID：5可以作为内引物BIP，SEQNOID：6可以作为环引物LF， SEQNOID：7可以作为环引物LB，SEQNOID：2可以作为外引物 F3，SEQNOID：3可以作为外引物B3。

在一个特别优选的实施方案中，在本发明的检测方法中，步骤2) 中的扩增反应利用LAMP技术进行。具体的LAMP技术操作步骤可以 参照本领域的科学文献中所公开的方法步骤。优选地，所述步骤2)中 的扩增反应可以在下列的扩增条件进行：置60～65℃，优选63℃恒温 30～120分钟，优选60～100分钟，最优选90分钟。

在另一个优选实施方案中，在步骤2)中的扩增反应中，引物SEQ NOID：4：SEQNOID：5：SEQNOID：6：SEQNOID：7：SEQNO ID：2：SEQNOID：3的体积比可以为：8:8:4:4:1:1。

作为一种示例性的反应体系，步骤2)中的反应体系可以是25μl 的LAMP反应体系，其包括：待测样品的DNA2μl，20mMTris·HCl(pH 8.8)，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱 (betaine)，8mMMgSO₄，每种1.4mMdNTP，8UBstDNA聚合酶， 引物加入量为：40pmolSEQNOID：4(FIP)和40pmolSEQNOID： 5(BIP)，20pmolSEQNOID：6(LF)和20pmolSEQNOID：7(LB)， 5pmolSEQNOID：2(F3)和5pmolSEQNOID：3(B3)。

在本发明的检测方法的一个优选实施方案中，对于步骤4)中的扩 增反应结果判断，反应液的浊度变化可以通过肉眼判断，透明判为待 测样品中不存在人博卡病毒，而浑浊判为待测样品中存在人博卡病毒。

在本发明的检测方法的另一个优选实施方案中，对于步骤4)中的 扩增反应结果判断，反应液的浊度变化可以通过浊度计测量的浊度数 值来判断，扩增前后浊度值上升30％以上表示所述待测样品中存在人 博卡病毒，浊度值无变化或变化范围在±5％以内表示待测样品中不存 在人博卡病毒。

本发明的检测方法克服了传统PCR方法检测的不足，具有直观、 重复性好、特异性强、敏感性高、不易污染和易于操作等特点。只需 要在60～65℃的恒温条件下30～90分钟内即可完成扩增反应，不需 要热循环。因此，在反应条件等成熟的情况下，无须定量PCR仪等贵 重仪器，仅需一台恒温水浴锅即可完成扩增反应；由于反应过程中不 需要开启试管盖，因此大大降低了实验室污染的可能性；结果判定无 需开启试管盖，无须非常专业的技术人员对结果进行分析，只需肉眼 即可观察结果。

本发明包括以下的优选实施方案：

1.一种用于扩增人博卡病毒基因序列的引物组，其包含SEQNOID： 2-7所示的序列的组合。

2.根据实施方案1所述的引物组，其特征在于所述人博卡病毒基因序 列是SEQNOID：1所示的序列。

3.一种用于快速检测人博卡病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包 含根据实施方案1和2所述的引物组。

4.根据实施方案3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含dNTP 和BstDNA聚合酶。

5.根据实施方案1或2所述的引物组在制备用于检测人博卡病毒的试 剂盒中的用途。

6.一种用于检测人博卡病毒的方法，该方法包括以下步骤：

1)提供获自受试者的待测样品，并提取所述待测样品的DNA；

2)以所述待测样品的DNA为模板，利用具有SEQNOID：2-7所 示的序列的引物进行扩增反应；以及

3)在步骤2)的扩增反应的开始前和结束后分别检测反应液的浊 度，和

4)通过反应前后反应液的浊度变化来判断结果。

7.根据实施方案6所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的待测 样品选自来自受试者的血液、体液、排泄物、器官和组织标本、拭 子标本中的任一种。

8.根据实施方案6或7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的 扩增条件为：置60～65℃，优选63℃恒温30-120分钟，优选60-100 分钟，最优选90分钟。

9.根据实施方案6-8中任一项所述的方法，其特征在于反应液的浊度 变化通过肉眼判断，透明判为待测样品中不存在人博卡病毒，而浑 浊判为待测样品中存在人博卡病毒。

10.根据实施方案6-8中任一项所述的方法，其特征在于反应液的浊度 变化通过浊度计测量的浊度数值来判断，浊度值上升30％以上表示 所述待测样品中存在人博卡病毒，浊度值无变化或变化范围在±5％ 以内表示待测样品中不存在人博卡病毒。

11.根据实施方案6-10中任一项所述的方法，其特征在于：SEQNOID： 4为内引物FIP，SEQNOID：5为内引物BIP，SEQNOID：6为环 引物LF，SEQNOID：7为环引物LB，SEQNOID：2为外引物F3， SEQNOID：3为外引物B3。

12.根据实施方案6-11中任一项所述的方法，其特征在于：引物SEQNO ID：4：SEQNOID：5：SEQNOID：6：SEQNOID：7：SEQNO ID：2：SEQNOID：3的体积比为：8:8:4:4:1:1。

以下实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明， 而不是要限制本发明的范围。当阅读说明书并参考公知常识时，其它 实施方案对本领域技术人员来说将是显而易见的。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述 实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂公司购买 得到。

实施例

实施例1、用于对人博卡病毒进行LAMP检测的引物设计

从美国基因数据库检索获得人博卡病毒N基因序列(SEQNOID： 1)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得人博卡病毒的特异性保守 靶序列，再根据该保守靶DNA序列，用软件PrimerdesignV4设计用 于对人博卡病毒进行LAMP检测的引物，设计出3套引物(HBoV13-1, HBoV13-2,HBoV13-3)，经过实验对比，最终选取了由6条引物组成 的引物组合HBoV13-1，引物序列如表1所示。

表1用于对人博卡病毒进行LAMP检测的引物HBoV13-1

实施例2、本发明人博卡病毒的LAMP检测方法的建立

用实施例1获得的用于对人博卡病毒进行LAMP检测的六条引物 组合HBoV13-1对人博卡病毒株(来自首都儿科研究所)进行LAMP 检测，以获得最佳反应体系及反应条件，同时以其它2套引物 (HBoV13-2,HBoV13-3)为对照，具体方法如下：

一、最佳反应体系的确定

在相同反应条件(例如，置63℃恒温90min)下，反应体系中包 括以下物质，以下为确定的最佳反应体系：

1)以含人博卡病毒基因组DNA(用DNAzol核酸提取试剂提取待 测样品中的核酸)为模板，在实施例1获得的六条引物的引导下进行 LAMP扩增，其中，25μlLAMP反应体系包括：含人博卡病毒的基因 组DNA2μl，20mMTris·HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄， 0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，10mMMgSO₄，1.4mMdNTP 8UBstDNA聚合酶(购自蓝谱公司)，加入的引物量为：40pmolFIP 和BIP，20pmolLF和LB，5pmolF3和B3；反应条件为置63℃恒温 水浴锅中孵育90min。

2)反应结束后进行结果判定：直接用浊度仪检测反应前后反应液 的浊度变化来判断结果(原理：LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁， 焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP 反应)，浊度值上升(判断标准定为上升30％以上)表示待测样品中存在 人博卡病毒(阳性)，浊度值无变化(判断标准定义为无变化或变化范围 在±5％以内)表示待测样品中不存在人博卡病毒(阴性)。

扩增产物的浊度变化检测结果如图2所示，由图2可以看出， HBoV13-1的扩增效果最好，因此将HBoV13-1引物组合定为本发明用 于对人博卡病毒进行LAMP检测的专用引物组合。

在HBoV13-1引物组合的引导下，将本发明的人博卡病毒的LAMP 检测体系的一个实例确定为(25μl)：待测物的基因组DNA2μl，20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20， 0.8M甜菜碱(betaine)，8mMMgSO₄，1.4mMdNTP，8UBstDNA聚 合酶，加入的引物量为：40pmolFIP和BIP，20pmolLF和LB，5pmol F3和B3。

二、最佳反应条件的确定

在步骤一确定的相同的反应体系下，在不同反应条件下对含人博 卡病毒的基因组DNA进行LAMP检测，以确定最佳反应条件，具体 方法包括以下步骤：

1)以含人博卡病毒的基因组DNA为模板，在实施例1获得的六 条引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μlLAMP反应体系包括： 含人博卡病毒的基因组DNA2μl，20mMTris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO₄，1.4mMdNTP，8UBstDNA聚合酶，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmolLF和LB，5pmolF3和B3。LAMP的扩增条件 为：置60～65℃恒温30-120分钟。

2)结果判定

反应结束后，用与步骤一相同的方法进行结果判定。检测结果表 明，本发明最佳的人博卡病毒LAMP扩增条件为：置63℃恒温90min。 实施例3、本发明的人博卡病毒的LAMP检测方法的特异性、灵敏性 检测

一、本发明的人博卡病毒的LAMP检测方法的特异性检测

阳性对照用阳性菌株样本HBoV3722NP1以及已经确定为RSV A/B、FLUA/B、HAdV1、3、7阳性的临床标本DNA作为模板,检测实 施例2获得的最佳的人博卡病毒的LAMP检测方法的特异性，反应体 系和反应条件与实施例2相同。

本发明的人博卡病毒LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果如 图3所示，从图中可以看出，只有人博卡病毒阳性菌株样本 HBoV3722NP1发生了LAMP反应，其余均未发生；表明本发明的人 博卡病毒的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到 人博卡病毒。

二、本发明的人博卡病毒的LAMP检测方法的灵敏度检测

检测本发明的LAMP检测方法检测人博卡病毒的灵敏度，方法为： 提取人博卡病毒阳性菌株样本HBoV3722NP1DNA后定量，然后以10 倍梯度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、 10^-12)进行稀释使模板中DNA的浓度分别为10⁷拷贝/μl，10⁶拷贝/μl， 10⁵拷贝/μl，10⁴拷贝/μl，10³拷贝/μl，10²拷贝/μl，10¹拷贝/μl，10⁰拷 贝/μl，10^-1拷贝/μl，10^-2拷贝/μl，10^-3拷贝/μl，再以经梯度稀释的DNA 为模板，用本发明的LAMP检测方法进行灵敏度检测。

本发明的人博卡病毒LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如 图4所示(模板浓度分别为：10³拷贝/μl，10²拷贝/μl，10¹拷贝/μl，10⁰拷贝/μl，10^-1拷贝/μl，10^-2拷贝/μl，10^-3拷贝/μl，nc为阴性对照)，本 发明人博卡病毒的LAMP检测方法可检测到1拷贝/μl，表明本发明的 人博卡病毒的LAMP检测方法灵敏度高。

实施例4、制备人博卡病毒的LAMP检测试剂盒

将LAMP反应发生混合物(含人博卡病毒扩增引物、dNTP、含 Mg++的缓冲液)、BstDNA聚合酶、双蒸水、和阳性对照共同包装， 得到本发明的人博卡病毒的LAMP检测试剂盒。

综上所述，本发明的试剂盒和/或检测方法可以在等温条件下快速、 方便、高效、高特异、高灵敏地检测到人博卡病毒，不需要复杂仪器， 为人博卡病毒的检测提供了一个新的技术平台，可用于儿童感染性疾 病筛查和检测人博卡病毒。