用于检测人类TP53基因5种突变的探针、引物及试剂盒

摘要

本发明公开了用于检测人类TP53基因5种突变的探针、引物及试剂盒，其中TM1～TM5的5组引物和探针，每组中突变引物能与TP53基因保守序列结合，突变ARMS引物能与其相应的突变序列特异性结合，扩增突变序列；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术，可准确检测TP53基因5种突变类型；建立的实时荧光PCR扩增反应体系的试剂盒方便对TP53基因突变的快速检测，操作简单，结果易读；检测方法灵敏度高，50拷贝突变能稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类TP53基因5种突变的探针、 引物及试剂盒。

背景技术

野生型TP53基因是一种抑癌基因，其编码的p53蛋白能修复已损伤细胞或除去严重损 伤的细胞以免除这些细胞对机体的危害。TP53基因突变与人类50％的肿瘤有关，目前发现 的就有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋 巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等，且在不同肿瘤中TP53等位基因突变存在差异。

人类肿瘤中TP53突变主要在高度保守区内，大部分为错义突变，其中以175、245、248、 249、273、283等密码子位点突变最高，这可能是特定癌症发生发展的一个主要因素。研究 表明，野生型p53基因能够抑制多药耐药蛋白基因转录，突变型TP53基因则可增强多药耐 药基因表达，与肿瘤细胞对铂类化疗药的耐药性相关，但不影响紫杉醇类药的敏感性。因此 一般认为TP53基因突变检测可用于指导临床肿瘤患者化疗的个体化用药。

目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度 低，检测灵敏度只有20-30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可 出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致 大量漏检及假阴性的发生。而不管是染料溶解曲线还是探针溶解曲线法，都无法有效区分同 一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。

发明内容

为了解决现有的TP53基因突变检测方法检测效率低、样品易污染、检测时间长、准确 性差、区分度困难等问题，本发明提供了用于检测人类TP53基因5种突变的引物和探针。 本发明还提供了含有该引物和探针的试剂盒，实现不限场地的快速准确检测。

本发明提供的用于检测人类TP53基因5种突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：

TM1：R175H突变

突变上游ARMS引物TM1-F：SEQIDNO:2，

突变下游引物TW1-R：SEQIDNO:1，

检测探针TW1-P：SEQIDNO:3，

阻断探针TW1-B：SEQIDNO:4；

TM2：R248W突变

突变上游引物TW2-F：SEQIDNO:5，

突变下游ARMS引物TM2-R：SEQIDNO:6，

检测探针TW2-P：SEQIDNO:8，

阻断探针TW2-B：SEQIDNO:9；

TM3：R248Q突变

突变上游引物TW2-F：SEQIDNO:5，

突变下游ARMS引物TM3-R：SEQIDNO:7，

检测探针TW2-P：SEQIDNO:8，

阻断探针TW2-B：SEQIDNO:9；

TM4：R273C突变

突变上游ARMS引物TM4-F：SEQIDNO:11，

突变下游引物TW3-R：SEQIDNO:10，

检测探针TW3-P：SEQIDNO:13，

阻断探针TW3-B：SEQIDNO:14；

TM5：R273H突变

突变上游ARMS引物TM5-F：SEQIDNO:12，

突变下游引物TW3-R：SEQIDNO:10，

检测探针TW3-P：SEQIDNO:13，

阻断探针TW3-B：SEQIDNO:14；

其中，所述检测探针的核苷酸序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；阻断探 针的核苷酸序列5’端经过双脱氧修饰，3’端标记有淬灭基团。

优选地，上述用于检测人类TP53基因5种突变的引物和探针，所述荧光基团为FAM， 所述淬灭基团为MGB。MGB(MinorGrooveBinder)基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提 高MGB探针与对应模板的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针， MGB探针序列可设计得更短，特异性更强。

表1人类TP53基因5种热点突变

突变名称 氨基酸变化 碱基变化 CosmicID TM1 R175H c.524G>A 10648 TM2 R248W c.742C>T 10656 TM3 R248Q c.743G>A 10662 TM4 R273C c.817C>T 10659 TM5 R273H c.818G>A 10660

上述引物是针对表1所列的5种突变进行检测的特异性引物，其中，ARMS引物，能够 与其相应的突变位点序列特异性结合，选择性扩增突变序列；与其对应的另一引物能够与 TP53基因保守序列结合；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野 生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。

本发明提供的用于检测人类TP53基因5种突变的试剂盒，包括以上任一所述的用于检 测人类TP53基因5种突变的引物和探针。

优选地，上述用于检测人类TP53基因5种突变的试剂盒，还包括外控引物和探针，核 苷酸序列如下：

外控上游引物TR-F：SEQIDNO:15，

外控下游引物TR-R：SEQIDNO:16，

外控检测探针TR-P：SEQIDNO:17，外控检测探针核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’ 端标记有MGB。其中，TR-F和TR-R用于扩增TP53基因的保守序列(此段保守序列不同 于以上任一突变引物结合扩增的保守序列，为>gi|568815581:c7687674-7687275段碱基序列)； TR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合。

优选地，上述用于检测人类TP53基因5种突变的试剂盒，还包括内控引物和探针，核 苷酸序列如下：

内控上游引物IC-F：SEQIDNO:18，

内控下游引物IC-R：SEQIDNO:19，

内控检测探针IC-P：SEQIDNO:20，内控检测探针核苷酸序列的5’端标记有JOE，3’ 端标记有BHQ1。

其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列；IC-P为5’端标记有 JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与扩增片段结合。

优选地，上述用于检测人类TP53基因5种突变的试剂盒，还包括阳性对照品和内控品， 阳性对照品包括含有5种突变序列基因的质粒TM1质粒～TM5质粒、含有TP53基因保守序 列>gi|568815581:c7687674-7687275段碱基的外控质粒和含有matK基因保守序列 >gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒，其中TM1质粒含有TP53基因 >gi|568815581:c7675288-7674889段碱基序列且R175H(c.524G>A)位点突变，TM2质粒和

TM3质粒均含有TP53基因>gi|568815581:c7674421-7674022段碱基序列且TM2质粒中 R248W(c.742C>T)位点突变而TM3质粒中R248Q(c.743G>A)位点突变，TM4质粒和 TM5质粒中均含有>gi|568815581:c7674003-7673604段碱基序列且TM4质粒中R273C (c.817C>T)位点突变而TM5质粒中R273H(c.818G>A)位点突变；内控品为含有matK 基因保守序列>gi|11994090:c2400-2001段碱基的内控质粒。

优选地，上述用于检测人类TP53基因5种突变的试剂盒，试剂盒中的反应体系分为6 个：

5个检测反应体系，每1个检测反应体系中包括用于检测人类TP53基因一种突变的引 物和探针，内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和ddH₂O；

1个质控反应体系：包括外控引物和探针、内控引物和探针，ABpremix，10×buffer和 ddH₂O；

所述ABpremix为美国应用生物系统公司产品FastAdvancedMasterMix；所述 10×buffer为10倍浓度的缓冲液，缓冲液中含有Mg²⁺。

本发明还提供了以上所述用于检测人类TP53基因5种突变的试剂盒的使用方法，首先 提取待检样品的基因组DNA，分别加入到各检测反应体系和质控反应体系，进行荧光定量 PCR反应；另外设置非模板对照和各突变相应的阳性对照，与待检样品的基因组DNA进行 同样的操作；根据Ct值分析检测结果：

首先需要满足JOE信号Ct值≤25，非模板对照的FAM信号不起线，阳性对照的FAM 信号Ct值≤22；9<Ct_质控≤18；然后按照△Ct＝Ct_检测-Ct_质控判定：

含有TM1：R175H(c.524G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中 FAM信号Ct值差值△Ct大于8为野生型，小于等于8为R175H(c.524G>A)突变型阳性；

含有TM2：R248W(c.742C>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中 FAM信号Ct值差值△Ct大于8为野生型，小于等于8为R248W(c.742C>T)突变型阳性；

含有TM3：R248Q(c.743G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中 FAM信号Ct值差值△Ct大于8为野生型，小于等于8为R248Q(c.743G>A)突变型阳性；

含有TM4：R273C(c.817C>T)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中 FAM信号Ct值差值△Ct大于8为野生型，小于等于8为R273C(c.817C>T)突变型阳性；

含有TM5：R273H(c.818G>A)突变的引物和探针的检测反应体系与质控反应体系中 FAM信号Ct值差值△Ct大于8为野生型，小于等于8为R273H(c.818G>A)突变型阳性；

所述Ct_检测为待检样品的基因组DNA在上述5种检测反应体系中进行荧光定量PCR获 得的Ct值，所述Ct_质控为待检样品的基因组DNA在质控反应体系中进行荧光定量PCR获得 的Ct值。

优选地，以上所述的用于检测人类TP53基因5种突变的试剂盒的使用方法，荧光定量 PCR反应的条件为：

95℃10min；

92℃15sec，58℃1min，共15个循环；

92℃15sec，60℃1min，共30个循环；在60℃时收集信号。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用了特异性突变引物和探针阻断技术，可以检测人类TP53基因5种突变 类型。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基础上，阻断 探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高体系的特异 性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。

(2)本发明建立了实时荧光PCR扩增反应体系实现对TP53基因突变的快速检测；且 操作简单，结果易读。其JOE信号Ct值反映了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR 反应是否正常，操作过程是否准确)。

(3)本方法灵敏度高，可实现50拷贝突变基因的稳定检出；特异性好，20ng野生型基 因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

附图说明

图1为实施例1中内控(IC)实验结果；

图2为实施例1中非模板对照(NTC)实验结果；

图3为实施例1中阳性对照(STD)样本结果；

图4为实施例1中灵敏度(R248Q检测孔)实验结果；

图5为实施例1中精密度(R273C检测孔)实验结果；

图6为实施例2中阴性(野生型)样本实验结果；

图7为实施例2中阳性(R175H突变)样本实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本 发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1、用于检测人类TP53基因7种突变的检测试剂盒的引物和探针：

根据NCBI数据库公布的TP53基因(NCBIReferenceSequence:NM_000546.5)野生型 序列，以5号外显子R175H(TM1)突变位点，7号外显子R248W(TM2)和R248Q(TM3) 突变位点，8号外显子R273C(TM4)和R273H(TM5)突变位点为参考，设计特异性R175H 突变引物和探针(见表2)、特异性R248W突变引物和探针(见表3)、特异性R248Q突变 引物和探针(见表4)、特异性R273C突变引物和探针(见表5)和特异性R273H突变引物 和探针(见表6)。以基因工程构建的突变质粒和野生型质粒为模板，建立了实时荧光PCR 突变(Mutation)检测体系，实现对TP53基因突变的高灵敏度和高特异性检测。

(1)用于人类TP53基因R175H(TM1)突变检测的特异性引物和探针序列：

表2用于检测R175H位点的特异性引物和探针组合

SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰 1 TW1-R GGCAACCAGCCCTGTCGT 无 2 TM1-F GACGGAGGTGGTGACGCA 无 3 TW1-P CTGCTCAGATAGCGATG 5’端FAM，3’端MGB 4 TW1-B TGTGAGGCGCTGCC 5’端双脱氧修饰，3’端MGB

其中，TM1-F为突变上游ARMS引物，与R175H(c.524G>A)位点突变序列特异性结 合，选择性扩增突变序列；TW1-R为突变下游引物，与TP53基因保守序列结合；TW1-P 为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；TW1-B为5’端双 脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与R175H位点野生型序列特异性结合，抑制野生型 非特异扩增。

(2)用于人类TP53基因R248W(TM2)突变检测的特异性引物和探针序列：

表3用于检测R248W位点的特异性引物和探针组合

其中，TW2-F为突变上游引物，与TP53基因保守序列结合；TM2-R为突变下游ARMS 引物，与R248W(c.742C>T)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；TW2-P为 5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；TW2-B为5’端双脱 氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与R248W位点野生型序列特异性结合，抑制野生型 非特异扩增。

(3)用于人类TP53基因R248Q(TM3)突变检测的特异性引物和探针序列：

表4用于检测R248Q位点的特异性引物和探针组合

SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰 5 TW2-F TCACAGGTCTCCCCAAGGC 无 7 TM3-R ATGGTGAGCATCGGCGTCT 无 8 TW2-P CCCATGCAGGAACT 5’端FAM，3’端MGB 9 TW2-B ATGGGCCTCCGGTTC 5’端双脱氧修饰，3’端MGB

其中，TW2-F为突变上游引物，与TP53基因保守序列结合；TM3-R为突变下游ARMS 引物，与R248Q(c.743G>A)位点突变序列特异性结合，选择性扩增突变序列；TW2-P 为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；TW2-B为5’端 双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与R248Q位点野生型序列特异性结合，抑制野生 型非特异扩增。

(4)用于人类TP53基因R273C(TM4)突变检测的特异性引物和探针序列：

表5用于检测R273C位点的特异性引物和探针组合

SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰 10 TW3-R CTTACCTCGCTTAGTGCTCCCT 无 11 TM4-F CCGACCCGCTTTGAGATGT 无 13 TW3-P CCTGTCCTGGGAGAGA 5’端FAM，3’端MGB 14 TW3-B AGGTGCGTGTTTGTG 5’端双脱氧修饰，3’端MGB

其中，TM4-F为突变上游ARMS引物，与R273C(c.817C>T)位点突变序列特异性结 合，选择性扩增突变序列；TW3-R为突变下游引物，与TP53基因保守序列结合；TW3-P 为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；TW3-B为5’端 双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与R273C位点野生型序列特异性结合，抑制野生 型非特异扩增。

(5)用于人类TP53基因R273H(TM5)突变检测的特异性引物和探针序列：

表6用于检测R273H位点的特异性引物和探针组合

其中，TM5-F为突变上游ARMS引物，与R273H(c.818G>A)位点突变序列特异性结 合，选择性扩增突变序列；TW3-R为突变下游引物，与TP53基因保守序列结合；TW3-P 为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测探针，能与扩增片段结合；TW3-B为5’端 双脱氧修饰3’端MGB标记的阻断探针，能与R273H位点野生型序列特异性结合，抑制野生 型非特异扩增。

2、质控引物(外控和内控)引物和探针

(1)用于人类TP53基因突变检测样本质控的外控引物和探针序列：

根据NCBI数据库公布的TP53基因(NCBIReferenceSequence:NM_000546.5)第1号 外显子保守序列，设计外控引物和探针(见表7)。以基因工程构建的外控质粒为模板，建立 了实时荧光PCR外控(ExternalControl)检测体系，对待测样本基因组DNA的质量和上样 量进行监测。

表7用于样本质控的外控引物和探针组合

SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰 15 TR-F GAGCCTCGCAGGGGTTGA 无 16 TR-R CAGCCCGAACGCAAAGTG 无 17 TR-P CCCCTCCCATGTGC 5’端FAM，3’端MGB

其中，TR-F和TR-R为外控上下游引物，扩增TP53基因保守序列 (>gi|568815581:c7687674-7687275)；TR-P为5’端标记有FAM信号3’端标记MGB的检测 探针，能与扩增片段结合。

(2)用于实时荧光PCR扩增反应体系内部质控的内控引物和探针序列：

根据NCBI数据库公布的matK基因(NCBIReferenceSequence:NC_001666.2)保守序 列(non-humanDNA)，设计内控引物和探针(见表8)。以基因工程构建的内控质粒为模板， 建立了实时荧光PCR内控(InternalControl)检测体系，对实时荧光PCR反应体系和实验操 作过程进行质控。

表8用于内部质控的内控引物、探针组合

SEQIDNO: 名称 序列(5’→3’) 末端修饰 18 IC-F TCGTAAGGAATCAAATGCTGGAG 无 19 IC-R CAACGGGTTTACTAATAGGATGCC 无 20 IC-P TCGATACCACAGTCCTTGCAACTCCCC 5’端JOE，3’端BHQ1

其中，IC-F和IC-R为内控上下游引物，扩增matK基因保守序列(位于 >gi|11994090:c2400-2001)；IC-P为5’端标记有JOE信号3’端标记BHQ1的检测探针，能与 扩增片段结合。

3、本发明的检测人类TP53基因5种突变的检测试剂盒

实时荧光PCR扩增反应体系设置：用6孔实时荧光PCR扩增反应进行TP53基因5种 突变的检测。反应体系1～5(见表10)包含实时荧光PCR突变检测体系和实时荧光PCR内 控检测体系，反应体系6(见表10)包含实时荧光PCR外控检测体系和实时荧光PCR内控 检测体系。

表9试剂盒组成

其中，TM1质粒含有发生R175H(c.524G>A)碱基变化的TP53基因片段 (>gi|568815581:c7675288-7674889)；TM2质粒含有发生R248W(c.742C>T)碱基变化的 TP53基因片段(>gi|568815581:c7674421-7674022)；TM3质粒含有发生R248Q(c.743G>A) 碱基变化的TP53基因片段(>gi|568815581:c7674421-7674022)；TM4质粒含有发生R273C (c.817C>T)碱基变化的TP53基因片段(>gi|568815581:c7674003-7673604)；TM5质粒含 有发生R273H(c.818G>A)碱基变化的TP53基因片段(>gi|568815581:c7674003-7673604)。 TR质粒(即外控质粒)含有TP53基因保守序列>gi|568815581:c7687674-7687275段碱基。 IC质粒(即内控质粒)含有matK基因保守序列(>gi|11994090:c2400-2001)。

试剂盒各管内组成成分如下：

表10试剂盒组成成分

注：ABpremix全称FastAdvancedMasterMix，购自美国应用生物系统公司； 10×buffer(Mg²⁺Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司。

PCR反应总体积25μL，含19μL的反应体系，1μL的IC模板和5μL的检测模板(阳性 对照、非模板对照、质粒模板或待测样本基因组DNA)，IC模板和检测模板可预混。

反应体系1用于人类TP53基因R175H(TM1)突变的检测。体系包含用于突变目的序 列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表2)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组 合(见表8)。

反应体系2用于人类TP53基因R248W(TM2)突变的检测。体系包含用于突变目的 序列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表3)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针 组合(见表8)。

反应体系3用于人类TP53基因R248Q(TM3)突变的检测。体系包含用于突变目的序 列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表4)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组 合(见表8)。

反应体系4用于人类TP53基因R273C(TM4)突变的检测。体系包含用于突变目的序 列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表5)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组 合(见表8)。

反应体系5用于人类TP53基因R273H(TM5)突变的检测。体系包含用于突变目的序 列扩增的特异性突变引物和探针组合(见表6)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组 合(见表8)。

反应体系6用于待测样本的质控。体系包含用于外控基因扩增的外控引物和探针组合 (见表7)以及用于内控基因扩增的内控引物和探针组合(见表8)。

4、试剂盒检测方法：

(1)获取待测样本基因组DNA

石蜡包埋样本的提取使用QIAampDNAFFPETissueKit(CatNo.56404)。按照说明书 提取乳腺癌患者组织标本基因组DNA，操作步骤简述如下：

取临床采集的石蜡包埋组织切片(10um，5-7片)放入1.5ml的离心管中，加入1000μL 的二甲苯，剧烈涡旋10sec，12000rpm室温离心5min,弃上清，注意不要倒掉沉淀；加入1000μL 无水乙醇，以除去残留的二甲苯，轻轻涡旋，12000rpm室温离心5min，弃上清；打开离心 管，在37℃孵育10-15min，直至乙醇完全蒸发；分别加入180μLbufferATL和20μL蛋白酶 K，彻底涡旋，56℃孵育2h左右，直到该组织完全溶解(在孵育过程中可以偶尔涡旋)；加 入200μLbufferAL，涡旋后加入200μL无水乙醇，混合后再次彻底涡旋震荡；将最后的混合 物加入到离心柱上，8000rpm离心1min，弃废液；加入500μLbufferAW1，8000rpm离心 1min，弃废液；加入500μLbufferAW2，12000rpm离心3min，弃废液；12000rpm离心1min； 将离心柱放置在新的1.5ml离心管中，加入50-200μLbufferAE，室温放置5min,12000rpm离 心1min。收集滤液，-20℃保存。

将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质量，DNA的浓度要求 ≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。定量后，母液-20℃保存。

(2)实时荧光PCR扩增反应：

实时荧光PCR扩增反应基本原理：上述检测探针序列5’端连接荧光基团(FAM、JOE)， 3’端连接淬灭基团(MGB、BHQ1)。未进行PCR扩增反应前，检测探针5’端荧光基团与 3’端的淬灭基团相互靠近，由于荧光共振能量转移的作用，荧光基团不能发出荧光。随着 PCR扩增反应的进行，检测探针在DNA聚合酶的作用下发生水解，5’端荧光基团脱落而与 淬灭基团相互分离，进而能发出荧光。通过仪器检测荧光信号的积累可反映待测模板目的片 段的起始浓度。在突变检测探针、外控检测探针和阻断探针的3’端连接有MGB(Minor GrooveBinder)基团。MGB基团可与DNA螺旋小沟结合，进而提高MGB探针与对应模板 的杂交稳定性(Tm值提高约10℃)。相对于普通TaqMan探针，MGB探针序列可设计得更 短，特异性更强。

该试剂盒的优势：(1)在本发明实时荧光PCR突变检测体系中，对目的基因突变区域 进行PCR扩增。其中，特异性突变引物与突变序列匹配度高于相应的野生型序列；在此基 础上，阻断探针与野生型序列特异性结合，有效抑制了野生型的非特异性扩增，进一步提高 体系的特异性水平，从而实现了在高野生型基因背景下对低含量突变序列的检出。(2)在本 发明实时荧光PCR外控检测体系中，对目的基因保守区域进行PCR扩增。其FAM信号Ct 值反映了待测样本基因组DNA的相关信息(DNA质量、纯度及上样量)。(3)在本发明实 时荧光PCR内控检测体系中，对非人类基因保守区进行PCR扩增。其JOE信号Ct值反应 了实时荧光PCR扩增反应体系的相关信息(PCR反应是否正常，操作过程是否准确)。

实时荧光PCR扩增反应：

将样本的基因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为模板，加入到 实时荧光PCR扩增反应体系中(见表10)进行扩增。

实时荧光PCR扩增反应条件设置：

表11实时荧光PCR扩增反应条件

最优的，在Stage2阶段(15个循环)，58℃的退火延伸温度，有利于突变模板的富集。 在Stage3阶段(30个循环)，60℃的退火延伸温度可以保证更好的扩增特异性。

(3)检测结果分析

根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成 功的判定标准(JOE信号Ct值≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD) FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对照 FAM信号Ct值≤22，体系性能良好，结果有效)；以外控检测孔(反应体系6)FAM信号Ct 值作为上样量质控标准(9<Ct_质控≤18，Ct_质控≤9，说明加入的基因组DNA浓度过高，应稀释 后重新检测该样本；Ct_质控>18或无扩增曲线，说明加入的基因组DNA浓度过低或存在降解， 建议重新提取该样本基因组DNA后进行检测)，以待测样本突变检测孔与外控检测孔FAM 信号的△Ct值(△Ct＝Ct_检测-Ct_质控)作为阴阳性判定标准(见表12)。

表12样本检测结果判定

5、本发明试剂盒性能分析实验(灵敏度和精密度)

用本发明中的人类TP53基因5种突变检测试剂盒进行性能分析实验。

每次检测需同时进行非模板对照(NTC)实验和阳性对照(STD)实验。图1为IC检 测结果，Ct_内控≤25，符合要求；图2为NTC检测结果，反应体系1～6FAM均不起线，符合 要求；图3为STD检测结果，反应体系1～6FAM信号均起线且Ct≤22，符合要求。

(1)灵敏度实验

将以现有基因工程技术合成的含有TP53基因突变序列的5种重组质粒DNA干粉用TE (10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。取1×10³拷贝/μL的5种突变质粒DNA分别进行 10倍稀释，稀释2个梯度，然后以3种浓度梯度(1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL和1×10¹拷贝/μL)的突变质粒DNA为模板，进行实时荧光PCR扩增反应(见图4)。由图4可见本 发明的荧光PCR方法灵敏度高，10拷贝/μL突变基因即可检出。

(2)精密度实验

将以现有基因工程技术合成的含有TP53基因突变序列的5种重组质粒DNA干粉用TE (10mmol/L，pH8.0)复溶，定量后稀释。以5×10¹拷贝/μL的5种突变质粒DNA为模板， 进行实时荧光PCR扩增反应(见图5)。由图5可见本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性 好(20次重复实验结果稳定，CV<5％)。

实施例2

用本发明中人类TP53基因5种突变检测试剂盒来检测临床采集的组织样本。

本实施例中收集临床病理诊断为乳腺癌的患者组织样本，并从中提取基因组DNA。用 TP53基因5种突变检测试剂盒检测待测样本中TP53基因的突变状态。具体步骤如下：

(1)样本基因组DNA提取

石蜡包埋组织样本的提取使用QIAampDNAFFPETissueKit(CatNo.56404)。按说明书 提取待测样本基因组DNA，将抽提好的DNA样本，用紫外分光光度计检测浓度和DNA质 量，DNA的浓度要求≥10ng/μL，DNA的质量OD260/280在1.8～2.0之间。将符合要求的基 因组DNA用TE(10mmol/L，pH8.0)稀释到2～10ng/μL作为PCR模板，进行实时荧光PCR 扩增反应。

(2)实时荧光PCR扩增反应

实时荧光PCR扩增反应条件见表11，按照人类TP53基因5种突变检测试剂盒说明书进 行样本检测。

(3)结果判定

根据荧光定量PCR扩增仪Ct值分析检测结果：以JOE信号Ct值作为PCR反应是否成 功的判定标准(JOE信号Ct值Ct≤25，扩增正常)，以非模板对照(NTC)和阳性对照(STD) FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准(非模板对照FAM信号不起线，阳性对 照FAM信号Ct值Ct≤22，体系性能良好，结果有效)；以待测样本突变检测孔和外控检测孔 FAM信号△Ct值(△Ct＝Ct_检测-Ct_质控)作为阴阳性判定标准(见表12)。

图6中，Ct_质控＝12.1，符合要求；突变检测孔FAM信号均未起线，显示样本检测结果为 阴性。

图7中，Ct_质控＝12.2，符合要求；TM1突变检测孔FAM信号起线而TM2～TM5突变检 测孔FAM信号均未起线，且Ct_检测(TM1)＝15.9，△Ct＝3.7，显示样本检测结果为TM1(R175H) 阳性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限 于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范 围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCELISTING

<110>武汉海吉力生物科技有限公司

<120>用于检测人类TP53基因5种突变的探针、引物及试剂盒

<130>

<160>20

<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

<213>人工序列

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